Diese Studie wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft zu SW (DFG WA 2804) und ein Stipendium der Universität zu SW vom Experimental and Clinical Research Center, eine Kooperation des Max-Delbrück-finanzierte Centrum für Molekulare Medizin und Medizinische Fakultät Charité in Berlin. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und-analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Erstellung des Manuskripts. Wir danken Herrn Robert Westphal für technischen Support während seines Praktikums in unserem Labor.

Alle tierischen Verfahren müssen von der lokalen institutionellen Tierschutz Ausschuss vor der Ausführung genehmigt werden. Während der MR-Messungen ein angemessenes Niveau der Anästhesie und physiologischen Überwachung (Körpertemperatur, Atemfrequenz) sind unabdingbare Voraussetzungen. 1. Erzeugung von Maus-Knochenmark-abgeleiteten dendritischen Zellen <ol><li> Auszug Knochenmarkzellen aus C57BL / 6 Mäusen wie zuvor 12 beschrieben. Dieses Protokoll stammt bis 1992 13 und wurde ursprünglich von der Gruppe von Ralph M. Steinman (1943-2011), der Entdecker der dendritischen Zelle 14 beschrieben. </li><li> Kurz gesagt, extrahieren Schien-und Wadenbein bald nach opfern Mäusen. Arbeiten unter dem Laminarströmungshaube (eine Verkeimung zu verhindern), spülen Sie das Knochenmark in einer kleinen Petrischale mit wash Medium (5% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin und 1% HEPES in RPMI) 12. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension durch eine Zelle strainer (100 um Maschenweite, Nylon) in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen, um Knochen und übrig gebliebene Gewebe zu entfernen. Nach mehreren Waschschritten und einer Lyse Schritt 12 zählen die lebensfähigen Zellen mit Trypanblau und einer Zählkammer. </li><li> Resuspendieren Knochenmarkszellen in einer Konzentration von 400.000 Zellen ml -1 in Kulturmedium (RPMI mit 10% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin 1% HEPES und 1% L-Glutamin), enthaltend 75 ng ml -1 des Maus Granulozyten Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (MGM-CSF) aus Überständen von 293FT HEK-Zellen mit einer Maus GMCSF transfiziert erhalten. Übertragen 10 ml Zellsuspension (4 x 10 6 Zellen) in Petrischalen (100 mm x 20 mm) und Inkubation in einem CO 2-Inkubator (37 ° C, 5% CO 2). Am Tag 3 aufzufüllen alte Medium mit 10 ml frischem Medium (Ende halten Konzentration mGM-CSF bei 75 ng ml -1). Am Tag 6, entfernen 10 ml altes Medium und fülltmit 10 ml frischem Medium (MGM-CSF Endkonzentration = 75 ng ml -1). Am Tag 8, entfernen 10 ml altes Medium und füllt mit 10 ml frischem Medium (MGM-CSF Endkonzentration = 150 ng ml -1). </li><li> Am Tag 10, reifen die differenzierte DC mit 1 ug ml -1 Lipopolysaccharid (LPS) für 24 Stunden. </li></ol> 2. Markierung von dendritischen Zellen mit 19 F-reiche Partikel <ol><li> Während der 24 Stunden Reifung Schritt (1.5), die DC-Label mit 1 mM fluorreichen Perfluor-15-Krone-5-Ether (PFCE) Teilchen (500-560 nm) auch für 24 Stunden. Bereiten großen Fluor-markierten Partikel durch Emulgieren PFCE in Pluronic F-68 (Gesamtvolumen 2,5 ml) unter Verwendung eines Zell-störenden Titansonotrode und unter Verwendung eines kontinuierlichen Puls-Programm (100% Amplitude, Leistung = 250 W) 60 s lang. </li><li> Nach den oben Inkubationsschritte Ernte der reifen und Fluor-markierten DC mit einem Gewebekulturzelllinien Schaber, Überführung in einen 50-ml-Zentrifugenröhrchen und Zentrifugebei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur gerührt. </li><li> Um abwaschen alle übrig gebliebenen Partikel und abgestorbene Zellen, lassen geernteten Zellen auf Poly-L-Lysin-Gerichte zu halten. Um diesen Schritt vorzubereiten, Mantel Petrischalen mit Poly-L-Lysin (1 mg ml -1) bei 37 ° C für 1 Stunde, danach abwaschen des ungebundenen Poly-L-Lysin mit PBS. </li><li> Inkubieren über geernteten Zellen auf Poly-L-Lysin-beschichteten Platten in serumfreiem Medium und lassen sich an Zellen (1 h bei 37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Waschen Sie die mittel-bis nicht-haftenden Zellen verbleibenden Partikel und abgestorbene Zellen zu verwerfen und dreimal mit vorgewärmten (37 ° C) PBS. </li><li> Ernte adhärenten Zellen durch Trypsin-EDTA-Behandlung (0,25% Trypsin-EDTA, 3 min Inkubation bei 37 ° C). </li><li> Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt waschen, suspendieren die erforderliche Menge an reifen DC in serumfreiem sterile PBS. </li><li> Um festzustellen, ob die Zellen wurden erfolgreich markiert, ist es empfehlenswert, die physicoche überprüfenmische Eigenschaften der Zellen mittels Durchflusszytometrie (FACS). Die seitliche Streulicht (SSC) sollte eine erhöhte Granularität in diesen Zellen zu offenbaren, wie zuvor 11 beschrieben. Es sollte auch bedacht werden, dass Fibroblasten könnte die DC Kulturen verunreinigen und könnte auch nehmen die 19 F-Teilchen in parallel. Deshalb ist die DC Reinheit zu beurteilen (durch Messung der Anteil der CD11c + CD11b + Zellen mit FACS) vor in vivo-Anwendung werden. </li></ol> 3. In vivo-Anwendung von 19 F-markierten dendritischen Zellen <ol><li> Verwalten DC (6. Oktober - 7. Oktober) in einem Volumen von 50 - 100 ul intrakutan in die Hinterbeine einer C57BL / 6 Maus durch Positionieren der Maus in einem Halter und sorgfältig Einsetzen einer Nadel 26 G ½ in die oberen Schichten der Haut vor der Anwendung (Verwendung 0,5 ml Tuberkulin Spritzen mit fest angeschlossene Nadeln Totvolumen zu minimieren). Um eine zu gewährleistenn entsprechenden intrakutan Anwendung ist es wichtig, dass der eingeführte Teil der Nadel teilweise sichtbar unter der Haut. Wenn die Nadel ist nicht mehr sichtbar, hat die Nadel eingeführt worden zu tief in die Hautschichten. Für das ungeübte einzelnen könnte die intrakutanen Anwendung unter Narkose durchgeführt werden. </li><li> Bild in den Extremitäten in vivo Fluor (19 F) / Proton (1 H) MRI (siehe nächster Abschnitt) 21 h nach der Injektion. </li></ol> 4. In Vivo 19 F / 1 H Magnetic Resonance Imaging Die detaillierte Anleitung für die Einrichtung der MR-Scans beziehen sich auf einen Bruker MR-Scanner mit der Steuerungs-Software Paravison (Version 5.1). Bezeichnungen, Hersteller-spezifische Funktionen und Optionen sind kursiv hervorgehoben. Für andere MR-Scannern können diese Schritte müssen nach der Hersteller-Richtlinien angepasst werden. <ol><li> Vereinbaren Sie Zugang zu einem dediziertenKleintier-MR-Scanner. Für eine ausreichende Bildqualität, ein System mit einer Magnetfeldstärke von 9,4 Tesla oder mehr und maßgeschneiderte Hochfrequenzspulen (z. B. 1 H / 19 F Dual-Band abstimmbaren HF-Spule, 35 mm Innendurchmesser, 50 mm Länge, schnelle Biomed, Würzburg, Deutschland) werden empfohlen. </li><li> Vor MRI, bereiten Sie das Setup des MRI-Scanners für Anästhesie und physiologischen Überwachung. Stellen Sie sicher, dass die Atemmaske des Tieres Bett / Halter an der Isofluran-System angeschlossen ist und dass der Temperaturfühler und die Atmung Pad zu einem entfernten Tier-Monitoring-System (z. B. Modell 1025, SA Instruments Inc., New York, USA) verbunden. Letztere dient dazu, das Tier Vitalparameter wie Körpertemperatur und Atmung zu überwachen. </li><li> Anesthetize Mäuse durch Inhalation Narkose mit einer Maus Kammer, die mit einem Isofluran-System. Stellen Sie den Durchfluss für Luft-und O 2 bei 0,2 L min -1 und 0,1 L min -1 bzw.und 3% Isofluran (bereinigt von einem Verdampfer) für ca. 2 min, bis das erforderliche Niveau der Narkose erreicht ist (keine Antwort folgende toe Prise). Optimale Flussraten je nach Setup verwendet wird. Seien Sie sich bewusst, dass hohe Strömungsgeschwindigkeiten kann zu Austrocknung führen. Eine sorgfältige Überwachung der Tiere &quot;Bedingungen ist jederzeit erforderlich, wie oben erwähnt. </li><li> Positionieren Sie den Mauszeiger auf die Maus anfällig Bett / Inhaber der Kleintier MR Scanner (Abbildung 1). </li><li> Während man den Durchfluss für Luft-und O 2 konstant, passen Sie die Isofluran Verdampfer auf 0,8-1,5%, bis eine optimale Atmung erreicht ist. Eine Atemfrequenz von 50 - 70 Atemzüge pro min empfohlen. </li><li> Halten Sie die Körpertemperatur auf 36-37 ° C während des Experiments durch die Verwendung eines warmen Wasser (oder alternativ Warmluft) Kreislauf-System. </li><li> Halten Sie die Augen der Maus feucht mit sterilem Auge Schmier Salbe während der Messung. </li><li> Nach dem Befestigen des Tieresauf dem Imaging-Halter und die Anbindung an das Monitoring-System, bewegen Sie den Halter in der Mitte des 1 H / 19 F HF-Spule (das ist im Isozentrum des Tieres Scanner Magneten positioniert). </li><li> Die Position der Maus, so dass das Knie in das Isozentrum des Magneten liegt, entweder mit einem automatisierten Verfahren (zB unter Verwendung eines Lasers mit einer Positionierung motorbetriebenen Tierhalter kombiniert) oder durch manuelle Berechnung des Abstandes der Halter bewegt werden muss in den Magneten zu erreichen Isozentrums. </li><li> Zur Bestätigung der korrekten Positionierung des Tieres in den Scanner und die spätere Planung des Bildscheibe Geometrie (dh Größe, Position und Rotation im Raum), erwerben scout Bilder in drei Standard-Orientierungen (axial, koronal, sagittal) mit schnellen und Bild mit niedriger Auflösung Erwerb Methoden (zB TriPilot Protokoll, das einen FLASH-Pulssequenz verwendet). </li><li> Stimmen Sie die HF-Spule auf die 1 H-Resonanzfrequenz (zB. 400,1 MHz für 9,4 T) und dem 19 F Resonanzfrequenz (zB 376,3 MHz für 9,4 T) und passen Sie die Impedanz der Spule 50 Ohm mit dem Tuning-Monitor des Tieres MR-Scanner. Tuning und Matching ist notwendig, um die optimalen Bedingungen für die Übertragung und Empfang zu erzielen. </li><li> Führen Sie die erforderlichen Einstellungen, einschließlich automatisches System Shim zur Feinabstimmung der Homogenität des Magnetfeldes (zB ADJ_SHIM), Netzfrequenz Anpassungen an die RF der Larmorfrequenz der Maus (zB ADJ_SF) und Referenz-Verstärkung einzustellen, um die HF-Amplitude einstellen ( zB ADJ_REFG). Alle diese Einstellungen sind wichtig, um die statischen und variablen magnetischen Feldern (B 0, B 1) in der Region von Interesse machen so homogen wie möglich. </li><li> Erwerben Sie einen zweiten Satz von scout Bilder (wie oben) entlang der drei orthogonalen Orientierungen, nach dem Einstellen das Sichtfeld (FOV), so dass beide unteren Gliedmaßen are sichtbar von Becken bis Fuß (LxBxH = 50x25x25 mm). Diese Bilder dienen dazu, die Orientierungen der endgültige 3D 1 H / 19 F-Scans planen. </li><li> Richten Sie eine TurboRARE 3D Protokoll für 1 H-Scan: TR / TE = 1500/53 ms, FOV = 50x25x25 mm, Matrix = 400x200x200, RARE Factor = 16 (. Zykluszeit ca. 60 min). Stellen FOV mit Hilfe der scout Bilder, starten Sie den Scan (Ampel). </li><li> Einlegen eines einzelnen Impulses FID-Sequenz mit TR von mindestens 1000 msec. Öffnen Sie Bearbeiten Scan und stellen Kern bis 19 F. Verwenden Sie die manuelle Gain-Einstellungen, indem Sie das automatische Bezugsverstärkung im Edit-Methode der Toolbox. </li><li> Messung starten ohne Aufzeichnung von Daten, um eine MR-Signal in Echtzeit mit APS (go Setup) anzuzeigen. Wenn die 19 F spektrale Signal innerhalb der Akquisition Fenster ist zu niedrig, fügen Sie mehr Durchschnitte Methode bearbeiten und / oder modulieren die Pulsabschwächers (TX0 oder SP0 Schieberegler), bis eine signal ist deutlich sichtbar. Stellen Sie die Grundfrequenz, um Mitte des 19. F spektralen Peak bei 0 Hz in den Erwerb Fenster. Bewerben Grundfrequenz und drücken Sie STOP. Beachten Sie, dass die Isofluran als Anästhesie kann einen Hintergrund zu erzeugen. 9.4 Tesla MRI die chemische Verschiebung zwischen den 19 F-enthaltenden Teilchen und Isofluran etwa 1.800 Hz liegt. Stellen Sie sicher, dass die Anregung Bandbreite kleiner als 3.600 Hz ist die spannende Isofluran zusammen mit den 19 F-markierten Zellen oder Partikel zu vermeiden. Die Grundfrequenz ist richtig auf dem Signal von der 19 F-markierten Zellen erzeugt eingestellt werden. Alternativ könnte eine andere Methode der Anästhesie verwendet, wie der Experimentator sieht fit werden. </li><li> Clone (Duplizieren) die TurboRARE 3D-Protokoll aus dem vorherigen 1 H-Scan. Zur Methode und deaktivieren Sie die automatische Referenz Verstärkung (wie oben) bearbeiten. Set 19 F Kern von Scan bearbeiten. Ändern Sie die Matrix 128x64x64und der RARE-Faktor auf mindestens 40 (bis zu 64). Für einen TR / TE 1000/6 ms und 64 beträgt, ist die Scan-Zeit ca. 70 min. Stellen Sie den Empfänger Gewinn auf 101 (Toolbox) und starten Sie den Scan ohne weitere Anpassungen mit GOP (go-Pipeline). </li><li> Wenn die Scans fertig sind einfahren Maus Halter aus dem MR-Scanner. Trennen Sie die Maus vorsichtig aus der Halterung. Wenn die Maus nicht für ex vivo-Analyse (zB Histologie oder Spektroskopie, siehe unten) geopfert direkt nach der MR-Messungen, genau beobachten, bis sie vollständig aus der Narkose erholt hat. Regulierung der Körpertemperatur durch die Narkose beeinflusst wird, so bei der Wiederherstellung, legen Sie die Maus in einem separaten Käfig, an einem warmen Temperatur-geregelte Pad platziert wird. Sobald die Maus vollständig aus der Narkose erholt, sie wieder in ihre Haltekäfig und dem Tier Raum. </li><li> Um die 19 Bilder F 1 H Bilder überlagern, verwenden Sie das Menü Ansicht option auf der gleichen Software (Paravison). Die Unterlage Funktion kann unter Korrelation gefunden werden. Speichern Sie die Unterlage, laden Sie das neue Bild und markieren Sie die 19 F-Schicht durch die Definition eine neue Farbe aus der Nachschlagetabelle. Um zwischen den 19 F-und 1 H-Scans diskriminieren, ändern Sie den Schwellenwert für die gewählte Farbe (geschnitten Nachschlagetabelle), so dass die 19 F-Signal wird die gewählte Farbe und den Hintergrund 1 H Bild haben wird in Graustufen bleiben. Andere Nachbearbeitung Programme (zB ImageJ) stehen zur Verfügung, um die 1 H / 19 F Bild-Overlays erstellen. </li><li> Sollte ein in vivo Quantifizierung der 19 F-Signal notwendig sein, folgen eine einfache quantitative Protokoll wie zuvor beschrieben 15,16. Kurz gesagt, kann die Quantifizierung, indem ein Verweis Rohr mit einer bekannten Konzentration von PFCE-Emulsion innerhalb des FOV neben der Maus durchgeführt werden. Nach dem Erwerb der MR-Bilder, QuanTIFY der Intensitäten der Signale unter Verwendung von 19 F-Region of Interest (ROI)-Analyse und zu vergleichen, um die in vitro Eichkurve wie in Fig. 2 gezeigt. </li></ol> 5. Lymphknoten Magnetic Resonance Spectroscopy (MRS) <ol><li> Nach Einbußen bei der Maus, entfernen Sie die Popliteallymphknoten und in einem kleinen 5 mm NMR-Röhrchen und 100 ul von 2% PFA. </li><li> Installieren eines 19 F-Spektroskopie Spule (zB eine Ringspule), die eine Öffnung von mindestens 5 mm zur Aufnahme der NMR-Röhrchen mit den Lymphknoten ist. </li><li> Legen Sie das NMR-Röhrchen im Inneren der Spule und bewegen Sie die Spule in die Isozentrums des Magneten. </li><li> Stimmen Sie die HF-Spule auf die 19 F Resonanzfrequenz (zB 376,3 MHz für 9,4 T) und passen Sie die Impedanz der Spule 50 Ohm mit dem Tuning-Monitor des Tieres MR-Scanner. Tuning und Matching ist notwendig, um die optimalen Bedingungen für die Übertragung und Signalverarbeitung erreichenEmpfang. </li><li> Stellen Sie alle Parameter innerhalb der Shim Unterlegmaß Toolbox auf 0 und drücken anzuwenden. Normalerweise ist es nicht erforderlich, Trimm-Verfahren anzuwenden, da das Volumen der Probe ist relativ klein. Wenn eine ausreichende 19 F-Signal verfügbar ist, können automatisierte Verfahren zur Shim, Netzfrequenz und Empfänger Gewinn wie oben beschrieben angewendet werden. </li><li> Einlegen eines einzelnen Impulses FID-Sequenz mit TR von mindestens 1000 msec. Öffnen Sie bearbeiten Scan und stellen Sie den Kern auf 19 F. Verwenden Sie die manuelle Gain-Einstellungen, indem Sie das automatische Bezugsverstärkung im Edit-Methode der Toolbox. Stellen Sie die Anzahl der Mittelwerte zu 1. </li><li> Starten Sie die Sequenz mit APS. Wenn die 19 F spektrale Signal innerhalb der Akquisition Fenster ist zu niedrig, fügen Sie mehr Durchschnitte Methode bearbeiten und / oder modulieren die Pulsabschwächers (TX0 oder SP0 Schieberegler), bis ein Signal ist deutlich sichtbar. Stellen Sie die Grundfrequenz, so dass die 19 F speMittelamerika Peak in der Mitte des Erfassungsfensters bei 0 Hz und gelten Grundfrequenz. Stellen Sie die Pulsabschwächers erneut, um das Signal, bis 90 ° Anregung erreichen zu maximieren. Wenn das Signal mit maximaler Presse Stop ist. </li><li> Stellen Sie die Durchschnittswerte im Edit-Methode zwischen 64 und 256 (oder mehr, falls erforderlich, je nach Signal) und starten Sie die Übernahme mit GOP. Das erfasste Signal korreliert linear mit der Anzahl der Mittelwerte. Während Quantifizierung im Hinterkopf behalten, dass das erfasste Signal an einem durchschnittlichen normalisiert werden muss. Darüber hinaus ist ein Kalibriernormal einer bekannten Konzentration oder eine Eichkurve notwendig, die Anzahl von Zellen aus dem normierten Signal F 19 (2) zu berechnen. </li><li> Sobald der Scan abgeschlossen ist, entfernen Sie die Probe, legen Sie die nächste Probe und fahren Sie mit Schritt 5.3. </li></ol>

<ol>
	<li>Yeh, T. C., Zhang, W., Ildstad, S. T., Ho, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamic+MRI+tracking+of+rat+T-cells+labeled+with+superparamagnetic+iron-oxide+particles.">In vivo dynamic MRI tracking of rat T-cells labeled with superparamagnetic iron-oxide particles.</a> Magn. Reson. Med. 33 (2), 200-208 (1995).</li><li>Weissleder, R., Cheng, H. C., Bogdanova, A., Bogdanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetically+labeled+cells+can+be+detected+by+MR+imaging.">Magnetically labeled cells can be detected by MR imaging.</a> J. Magn. Reson. Imaging. 7 (1), 258-263 (1997).</li><li>Franklin, R. J., Blaschuk, K. L., Bearchell, M. C., Prestoz, L. L., Setzu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+imaging+of+transplanted+oligodendrocyte+precursors+in+the+rat+brain.">Magnetic resonance imaging of transplanted oligodendrocyte precursors in the rat brain.</a> NeuroReport. 10 (18), 3961-3965 (1999).</li><li>de Vries, I. J., Lesterhuis, W. J., Barentsz, J. O., Verdijk, P., van Krieken, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+tracking+of+dendritic+cells+in+melanoma+patients+for+monitoring+of+cellular+therapy.">Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy.</a> Nat. Biotechnol. 23 (11), 1407-1413 (2005).</li><li>Liu, W., Frank, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+magnetically+labeled+cells+by+cellular+MRI.">Detection and quantification of magnetically labeled cells by cellular MRI.</a> Eur. J. Radiol. 70 (2), 258-264 (2009).</li><li>Ahrens, E. T., Flores, R., Xu, H., Morel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+platform+for+tracking+immunotherapeutic+cells.">In vivo imaging platform for tracking immunotherapeutic cells.</a> Nat. Biotechnol. 23 (8), 983-987 (2005).</li><li>Holland, G. N., Bottomley, P. A., Hinshaw, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-19+Magnetic-Resonance+Imaging.">F-19 Magnetic-Resonance Imaging.</a> Journal of Magnetic Resonance. 28 (1), 133-136 (1977).</li><li>Partlow, K. C., Chen, J., Brant, J. A., Neubauer, A. M., Meyerrose, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=19F+magnetic+resonance+imaging+for+stem/progenitor+cell+tracking+with+multiple+unique+perfluorocarbon+nanobeacons.">19F magnetic resonance imaging for stem/progenitor cell tracking with multiple unique perfluorocarbon nanobeacons.</a> FASEB J. 21 (8), 1647-1654 (2007).</li><li>Ruiz-Cabello, J., Walczak, P., Kedziorek, D. A., Chacko, V. P., Schmieder, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+"hot+spot"+MR+imaging+of+neural+stem+cells+using+fluorinated+nanoparticles.">In vivo "hot spot" MR imaging of neural stem cells using fluorinated nanoparticles.</a> Magn. Reson. Med. 60 (6), 1506-1511 (2008).</li><li>Srinivas, M., Morel, P. A., Ernst, L. A., Laidlaw, D. H., Ahrens, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorine-19+MRI+for+visualization+and+quantification+of+cell+migration+in+a+diabetes+model.">Fluorine-19 MRI for visualization and quantification of cell migration in a diabetes model.</a> Magn. Reson. Med. 58 (4), 725-734 (2007).</li><li>Waiczies, H., Lepore, S., Janitzek, N., Hagen, U., Seifert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfluorocarbon+particle+size+influences+magnetic+resonance+signal+and+immunological+properties+of+dendritic+cells.">Perfluorocarbon particle size influences magnetic resonance signal and immunological properties of dendritic cells.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21981 (2011).</li><li>Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Bone+Marrow+Derived+Murine+Dendritic+Cells+for+Use+in+2-photon+Imaging.">Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging.</a> J. Vis. Exp. (17), e773 (2008).</li><li>Inaba, K., Inaba, M., Romani, N., Aya, H., Deguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li><li>Lanzavecchia, A., Sallusto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ralph+M.+Steinman.+1943-2011.">Ralph M. Steinman. 1943-2011.</a> Cell. 147 (6), 1216-1217 (1943).</li><li>Srinivas, M., Turner, M. S., Janjic, J. M., Morel, P. A., Laidlaw, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cytometry+of+antigen-specific+t+cells+using+19F.">In vivo cytometry of antigen-specific t cells using 19F.</a> MRI. Magn. Reson. Med. 62 (3), 747-753 (2009).</li><li>Srinivas, M., Heerschap, A., Ahrens, E. T., Figdor, C. G., de Vries, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(19)F+MRI+for+quantitative+in+vivo+cell+tracking.">(19)F MRI for quantitative in vivo cell tracking.</a> Trends Biotechnol. 28 (7), 363-370 (2010).</li><li>Lammermann, T., Bader, B. L., Monkley, S. J., Worbs, T., Wedlich-Soldner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li><li>Liu, M. S., Long, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfluoroctylbromide+as+a+diagnostic+contrast+medium+in+gastroenterography.">Perfluoroctylbromide as a diagnostic contrast medium in gastroenterography.</a> Radiology. 122 (1), 71-76 (1977).</li><li>Kwiatkowska, K., Sobota, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+phagocytosis.">Signaling pathways in phagocytosis.</a> Bioessays. 21 (5), 422-431 (1999).</li><li>Mitragotri, S., Lahann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+approaches+to+biomaterial+design.">Physical approaches to biomaterial design.</a> Nat. Mater. 8 (1), 15-23 (2009).</li><li>Hoult, D. I., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+signal-to-noise+ratio+of+the+nuclear+magnetic+resonance+experiment.">The signal-to-noise ratio of the nuclear magnetic resonance experiment.</a> J. Magn. Reson. 24 (1), 71-85 (1976).</li><li>Kovacs, H., Moskau, D., Spraul, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryogenically+cooled+probes+-+a+leap+in+NMR+technology.">Cryogenically cooled probes - a leap in NMR technology.</a> Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 46 (2-3), 131-155 (2005).</li><li>Waiczies, H., Millward, J. M., Lepore, S., Infante-Duarte, C., Pohlmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Cellular+Infiltrates+during+Early+Stages+of+Brain+Inflammation+with+Magnetic+Resonance+Microscopy.">Identification of Cellular Infiltrates during Early Stages of Brain Inflammation with Magnetic Resonance Microscopy.</a> PLoS ONE. 7 (3), e32796 (2012).</li><li>Haacke, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Magnetic resonance imaging physical principles and sequence design. , (1999).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Diese Methode der Verwendung von 19 F / 1 H MRI, um die Bewegung von DC in den Lymphknoten folgen die Möglichkeit gibt, die Wanderungsbewegungen von Immunzellen in vivo zu untersuchen. Dendritische Zellen sind hervorragende Beispiele für die Migration schnell Immunzellen, die in der Lage, durch dreidimensionale Strukturen dicht ohne Einhaltung spezifische Substrate 17 zu manövrieren sind. Obwohl die geringe räumliche Auflösung (um-Bereich) der beschriebenen Technik ist nich...

Das Tracking von Zellen in vivo ist ein entscheidender Aspekt in mehreren Bereichen der Biomedizin. Hierzu sind invasive bildgebende Verfahren, die selektiv lokalisiert Zellen über einen längeren Zeitraum kann extrem wertvoll. Vor der Entwicklung von dreidimensionalen Magnetresonanz-Bildgebung (MRI), wurde die Verfolgung der Immun-Zellmigration mikroskopische Analysen oder Gewebeproben beschränkt. Handy-Tracking mit Hilfe von MRI hat immense Aufmerksamkeit in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen, nicht nur für das Studium Immunologen Immunzellen Verhalten in vivo, sondern auch für die klinische und die Stammzell-Forscher. Während Mitte der 90er Jahre, Nanopartikel die ersten Studien auf Eisenoxid 1 initiiert eine Kaskade von Entwicklungen für die Verfolgung von Zellen mit MRT. Eisenoxid-Partikel verkürzen die MR-Relaxationszeit (T2 *) der markierten Zellen und damit Signal Erschöpfung in MR-Bildern. Eisenoxidteilchen zur Markierung Makrophagen 2, Oligodendrozyten p eingesetztrogenitors 3 und viele andere Zelltypen. Einige dieser Partikel wurden ebenfalls klinisch von der FDA für die Kennzeichnung zelluläre Impfstoffe in Melanom-Patienten 4 genehmigt. Da in vivo oder ex vivo-Markierung von Zellen mit Eisenoxidteilchen stützt sich auf eine Verkürzung der T2 *-Signal, wobei letzteres auch etwa durch in vivo gebracht Anfälligkeit Zusammenhang T2 * Effekte wie Mikro Blutungen Eisenlagerstätten oder Luftblasen es könnte schwierig sein, markierten Zellen in vivo zu identifizieren aus anderen Hintergrund T2 *-Signal Aussterben 5. In diesem Artikel beschreiben wir eine Technik für die Verfolgung von dendritischen Zellen (DC) in vivo durch den Einsatz von 19 F / 1 H Magnetresonanz-Tomographie (MRT). Diese Zelle Tracking-Technologie wurde erst im Jahr 2005 eingeführt, 6, mehrere Jahre nach der ersten erkannte Anwendungen für 19 F in MRI worden war 7 gemeldet. Ein wichtiger ADVAntage von 19 F auf Eisenoxidpartikels Zellmarkierung ist die geringe biologische Auftreten von 19 F in Gewebe, das macht es möglich, Zellen sehr selektiv zu verfolgen im Grunde mit Hintergrund-Bilder. Weiterhin ist es möglich, die 19 F MR-Signal von den transplantierten markierten Zellen überlagern mit anatomischen Bilder von herkömmlichen 1H MRI erhalten. 19 F / 1 H MRI ist daher wesentlich, die für Studien, Zellmigration in vivo. Zellen, die mit dieser Methode untersucht werden mit 19 F-reiche Partikel bezeichnet. Synthetisch abgeleitet perfluorierte Kohlenwasserstoffe (FKW), die hauptsächlich aus Kohlenstoff und Fluor-Atome werden häufig verwendet, um die Teilchen herzustellen. Diese Verbindungen sind nicht wasserlöslich und müssen vor der Applikation in vitro oder in vivo emulgiert werden. Die übliche Größe der Teilchen, die PFC von anderen Gruppen wurden für Arbeitnehmer in vivo 19 F-MRT Tracking Experimenteim Bereich zwischen 100 nm und 245 nm 6,8-10. Wir haben jedoch gezeigt, dass die Effizienz bei der Markierung von dendritischen Zellen mit Perfluor-15-Krone-5-Ether (PFCE) Teilchen mit zunehmender Teilchengröße (&gt; 560 nm). 11

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C57BL/6 mice</td>
 <td>Charles River, Berlin</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>21875-091</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS Superior</td>
 <td>Biochrom AG</td>
 <td>S 0615</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Gibco-Invitrogen</td>
 <td>15630-056</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>15140-122</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-glutamine</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>25030-024</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's PBS</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>D8662</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFA</td>
 <td>Santa Cruz</td>
 <td>sc-281692</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfluoro-15-crown-5-ether </td>
 <td>ChemPur</td>
 <td>391-1996</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pluronic F-68 </td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P5556</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes (35 x 10 mm)</td>
 <td>VWR, Germany</td>
 <td>391-1996</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>27 &frac12; G syringes</td>
 <td>VWR, Germany</td>
 <td>612-0151</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nylon cell strainers (100 &mu;m mesh) </td>
 <td>VWR, Germany</td>
 <td>734-0004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NMR tubes </td>
 <td>VWR, Germany</td>
 <td>634-0461</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection tools</td>
 <td>FST</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CO2 incubator </td>
 <td>Binder</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Small animal MR system</td>
 <td>Bruker Biospin</td>
 <td></td>
 <td>9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision Acquisition and Processing Software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1H/19F dual-tunable volume RF coil </td>
 <td>Rapid Biomed, W&uuml;rzburg, Germany</td>
 <td></td>
 <td>35 mm inner diameter, 50 mm length</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>19F spectroscopy coil </td>
 <td>in-house</td>
 <td></td>
 <td>tune/match loop coil, 4 turns, inner diameter 5 mm, 10 mm long, two capacitors for tuning and matching</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isoflurane inhalation system</td>
 <td>F&ouml;hr Medical Instruments GmbH</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Animal monitoring system Model 1025</td>
 <td>SA Instruments Inc., New York, USA</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

monitoring dendritic cell migration using 19f / 1h magnetic resonance imaging

Kontinuierliche Fortschritte in der nicht-invasiven bildgebenden Verfahren wie Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) haben stark unsere Fähigkeit, physiologische oder pathologische Prozesse in lebenden Organismen zu studieren verbessert. MRT erweist sich auch ein wertvolles Werkzeug für die Erfassung transplantierten Zellen in vivo sein. Initial Zellmarkierung Strategien für MRI gemacht Verwendung von Kontrastmitteln, die die MR-Relaxationszeiten beeinflussen (T1, T2, T2 *) und führen zu einer Erhöhung (T1) bzw. Abreicherung (T2 *) des Signals in dem markierten Zellen vorhanden sind. T2 * Verstärkungswirkstoffe wie ultrakleine Eisenoxid Agenten (USPIO) wurden eingesetzt, um die Zellwanderung und einige haben auch von der FDA für die klinische Anwendung zugelassen zu studieren. Ein Nachteil von T2 * Mittel ist die Schwierigkeit, das Signal Löschung durch den markierten Zellen von anderen Artefakten wie Blutgerinnsel, Mikro Blutungen oder Luftblasen erzeugt unterscheiden. In diesem Artikel beschreiben wir eine aufstrebende Technik für die Tracking-Zellen in vivo, dasswird zur Kennzeichnung der Zellen mit Fluor (19 F)-reiche Partikel. Diese Partikel werden durch Emulgieren Perfluorcarbon (PFC)-Verbindungen und dann auf Label-Zellen, die anschließend durch 19 F MRI abgebildet werden können, erstellt. Wichtige Vorteile von PFC für Handy-Tracking in vivo include (i) das Fehlen von Kohlenstoff-gebundenen F 19 in vivo, die dann liefert Hintergrund-Bilder und komplette Zelle selectivityand (ii) die Möglichkeit, die Zelle, das durch 19 F MR-Spektroskopie quantifiziert .

Achtzehn bis 21 Stunden nach Anwendung intrakutanen, 19 F-markierten dendritischen Zellen (DC) in die Drainage Popliteallymphknoten migrieren. Die Bewegung der DC über die Lymphbahnen in die Drainage politeal Lymphknoten können durch Überlagerung der 1 H anatomische Bilder mit den 19 F DC Bilder (2A) geschätzt. Wir haben bereits über die Migration dieser Zellen in vivo, sowie die Auswirkungen der 19 F-Partikelgröße auf DC Immunbiologie, einschl...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging at JoVE.com

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Verfolgung von Zellen mittels MRT hat bemerkenswerte Aufmerksamkeit in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen. Dieses Protokoll beschreibt die Kennzeichnung von dendritischen Zellen mit Fluor (<sup&gt; 19</sup&gt; F)-reiche Teilchen, die in vivo Anwendung dieser Zellen, und Überwachen des Ausmaßes der Migration in die Lymphknoten mit<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H MRI und<sup&gt; 19</sup&gt; F MRS.

Überwachung dendritische Zellen mit Migration<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

monitoring-dendritic-cell-migration-using-19f-1h-magnetic-resonance

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

11.7K Aufrufe.  A joint cooperation between the Charité Medical Faculty and the Max Delbrück Center for Molecular Medicine. Verfolgung von Zellen mittels MRT hat bemerkenswerte Aufmerksamkeit in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen. Dieses Protokoll beschreibt die Kennzeichnung von dendritischen Zellen mit Fluor ( 19 F)-reiche Teilchen, die in vivo Anwendung dieser Zellen, und Überwachen des Ausmaßes der Migration in die Lymphknoten mit 19 F / 1 H MRI und 19 F MRS.

Serie: Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Nicht-invasive Bildgebung von Leukozyten Homing und Migration In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to intracellular responses. GPCRs control diverse biological functions such as chemotaxis, intracellular calcium release, gene regulation in a ligand dependent manner via heterotrimeric G-proteins1-2. Ligand binding induces a series of conformational changes leading to activation of heterotrimeric G-proteins that modulate levels of second messengers such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP), inositol triphosphate (IP3) and diacyl glycerol (DG). Concomitant with activation of the receptor ligand binding also initiates a series of events to attenuate the receptor signaling via desensitization, sequestration and/or internalization. The desensitization process of GPCRs occurs via receptor phosphorylation by G-protein receptor kinases (GRKs) and subsequent binding of &beta;-arrestins3. &beta;-arrestins are cytosolic proteins and translocate to membrane upon GPCR activation, binding to phosphorylated receptors (most cases) there by facilitating receptor internalization 4-6.
Leukotriene B4 (LTB4) is a pro-inflammatory lipid molecule derived from arachidonic acid pathway and mediates its actions via GPCRs, LTB4 receptor 1 (BLT1; a high affinity receptor) and LTB4 receptor 2 (BLT2; a low affinity receptor)7-9. The LTB4-BLT1 pathway has been shown to be critical in several inflammatory diseases including, asthma, arthritis and atherosclerosis10-17. The current paper describes the methodologies developed to monitor LTB4-induced leukocyte migration and the interactions of BLT1 with &beta;-arrestin and , receptor translocation in live cells using microscopy imaging techniques18-19.
Bone marrow derived dendritic cells from C57BL/6 mice were isolated and cultured as previously described 20-21. These cells were tested in live cell imaging methods to demonstrate LTB4 induced cell migration. The human BLT1 was tagged with red fluorescent protein (BLT1-RFP) at C-terminus and &beta;-arrestin1 tagged with green fluorescent protein (&beta;-arr-GFP) and transfected the both plasmids into Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) cell lines18-19. The kinetics of interaction between these proteins and localization were monitored using live cell video microscopy. The methodologies in the current paper describe the use of microscopic techniques to investigate the functional responses of G-protein coupled receptors in live cells. The current paper also describes the use of Metamorph software to quantify the fluorescence intensities to determine the kinetics of receptor and cytosolic protein interactions.

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

This paper describes the methodology to determine the chemotactic response of leukocytes to specific ligands and identify interactions between the cell surface receptors and cytosolic proteins using live cell imaging techniques.

Real-time Imaging von Leukotrien B 4 Vermittelte Zellmigration und BLT1 Wechselwirkungen mit β-Arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial cells and tissue extravasation is a multistep process controlled by different adhesion molecules (homing receptors) expressed on lymphocytes and their respective ligands (addressins) displayed on endothelial cells 1 2. Even though the function of these adhesion receptors can be partially studied ex vivo, the ultimate test for their physiological relevance is to assess their role during in vivo lymphocyte adhesion and migration. Two complementary strategies have been used for this purpose: intravital microscopy (IVM) and homing experiments. Although IVM has been essential to define the precise contribution of specific adhesion receptors during the adhesion cascade in real time and in different tissues, IVM is time consuming and labor intensive, it often requires the development of sophisticated surgical techniques, it needs prior isolation of homogeneous cell populations and it permits the analysis of only one tissue/organ at any given time. By contrast, competitive homing experiments allow the direct and simultaneous comparison in the migration of two (or even more) cell subsets in the same mouse and they also permit the analysis of many tissues and of a high number of cells in the same experiment.
Here we describe the classical competitive homing protocol used to determine the advantage/disadvantage of a given cell type to home to specific tissues as compared to a control cell population. We chose to illustrate the migratory properties of gut-tropic versus non gut-tropic T cells, because the intestinal mucosa is the largest body surface in contact with the external environment and it is also the extra-lymphoid tissue with the best-defined migratory requirements. Moreover, recent work has determined that the vitamin A metabolite all-trans retinoic acid (RA) is the main molecular mechanism responsible for inducing gut-specific adhesion receptors (integrin a4b7and chemokine receptor CCR9) on lymphocytes. Thus, we can readily generate large numbers of gut-tropic and non gut-tropic lymphocytes ex vivoby activating T cells in the presence or absence of RA, respectively, which can be finally used in the competitive homing experiments described here.

Competitive homing experiments allow to directly assessing the migratory properties of two different cell populations in a single mouse. Here we illustrate this procedure by comparing the migration of ex vivo-generated gut-tropic versus non-gut tropic T cells.

Competitive Homing-Assays auf Gut-trope T-Zell-Migration Study

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

Optimiertes Protokoll für die effiziente Transfektion von dendritischen Zellen ohne Zell-Reifung

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

Probenvorbereitung von<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extrakte für Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in peripheral tissues in steady state; however in response to antigen stimulation, DCs take up the antigen and rapidly migrate to the draining lymph nodes where they initiate T cell response against the antigen1,2. Additionally, DCs also play a key role in initiating autoimmune as well as allergic immune response3.
DCs play an essential role in both initiation of immune response and induction of tolerance in the setting of lung environment4. Lung environment is largely tolerogenic, owing to the exposure to vast array of environmental antigens5. However, in some individuals there is a break in tolerance, which leads to induction of allergy and asthma. In this study, we describe a strategy, which can be used to monitor airway DC maturation and migration in response to the antigen used for sensitization. The measurement of airway DC maturation and migration allows for assessment of the kinetics of immune response during airway allergic inflammation and also assists in understanding the magnitude of the subsequent immune response along with the underlying mechanisms.
Our strategy is based on the use of ovalbumin as a sensitizing agent. Ovalbumin-induced allergic asthma is a widely used model to reproduce the airway eosinophilia, pulmonary inflammation and elevated IgE levels found during asthma6,7. After sensitization, mice are challenged by intranasal delivery of FITC labeled ovalbumin, which allows for specific labeling of airway DCs which uptake ovalbumin. Next, using several DC specific markers, we can assess the maturation of these DCs and can also assess their migration to the draining lymph nodes by employing flow cytometry.

We describe a strategy to monitor maturation and migration of pulmonary dendritic cells in response to ovalbumin in the setting of ovalbumin induced allergic airway inflammation. This strategy can be modified to assess migration of pulmonary dendritic cells in settings of infection.

Analyse der Lungen-Reifung von dendritischen Zellen und Migration während der allergischen Atemwegsentzündung

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H mice using ALDEFLUOR/ALDH as a marker, and tested their immunogenicity using the cell lysate as a source of antigens to pulse dendritic cells (DCs). DCs pulsed with ALDHhigh CSC lysates induced significantly higher protective antitumor immunity than DCs pulsed with the lysates of unsorted whole tumor cell lysates in both models and in a lung metastasis setting and a s.c.&#160;tumor growth setting, respectively. This phenomenon was due to CSC vaccine-induced humoral as well as cellular anti-CSC responses. In particular, splenocytes isolated from the host subjected to CSC-DC vaccine produced significantly higher amount of IFN&#947; and GM-CSF than splenocytes isolated from the host subjected to unsorted tumor cell lysate pulsed-DC vaccine. These results support the efforts to develop an autologous CSC-based therapeutic vaccine for clinical use in an adjuvant setting.

Evaluated in syngeneic immunocompetent hosts, cancer stem cell (CSC) based dendritic cell (DC) vaccine demonstrated significantly higher antitumor immunity than traditional DC vaccines pulsed with heterogeneous bulk tumor cells.

Generierung eines neuartigen Dendritisch-Zell-Impfstoffs mit Melanom- und Plattenkrebs-Stammzellen

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Imaging CD4 T-Zell-Interstitial Migration in den entzündeten Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with &lt;em&gt;Mycobacterium bovis&lt;/em&gt; Bacille Calmette-Gu&amp;#233;rin

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

Ein CFSE-basierten Assay die Migration von murinen Haut Dendritischen Zellen in Lymphknoten während der Infektion zu studieren mit<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bazillus Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Erzeugung einer großen Zahl von myeloischen Vorläuferzellen und dendritischen Zellen Vorstufen aus murinen Knochenmark mit einer neuartigen Zelle Sortieren Strategie

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...