Diese Arbeit zum Teil durch die NIH unterstützt unter Grant R15 CA137499-01 (FB) und ein Startup-Fonds an der Ohio University (FB).

1. Dissection der Maus Oberschenkel-und Schienbein und Kultur von Knochenmarkzellen <ol><li> Sacrifice 2 Mäuse durch CO 2-Erstickung und sorgfältig sezieren tibias und Oberschenkelknochen ohne Eingriff in die Knochen endet. </li><li> Reinigen Sie die Knochen von allen angeschlossenen Gewebe durch Tissue-Papier. Achten Sie darauf, um die Knochen zu brechen. </li><li> Sterilisieren der Knochen durch Eintauchen in 70% Ethanol für 10 min in einer 35 mm Petrischale. Von diesem Moment an, in einem Biosafety Haube arbeiten, um eine Kontamination der Zellkulturen zu vermeiden. </li><li> Recover die Knochen aus dem Ethanol und lassen Sie sie an der Luft trocknen für 5 min in einer Petrischale im Biosicherheitswerkbank. </li><li> Schneiden Sie die Oberschenkel zur Hälfte, und die Tibia von der dünnsten Spitze. Infuse der Innenseite des Knochens mit 1 ml RPMI-Medium (ohne Serum, sondern mit Antibiotika) mit einer sterilen Spritze auf eine sterile Petrischale. </li><li> Die Zellsuspension wird gesammelt und gewaschen 2X in RPMI-Medium durch 10 min Zentrifugation in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen bei 1.100 RPM in einer Kühlzentrifuge (4 ° C) mit einem Ausschwingrotor. </li><li> Nach der letzten Waschung, die Zellen in 2 ml ACK-Lysepuffer und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur, um rote Blutkörperchen zu beseitigen. </li><li> Fügen Sie 13 ml RPMI mit 10% FBS, resuspendieren und waschen in diesem Medium 2X mit den gleichen Einstellungen wie in 1.6 beschrieben. </li><li> Zählen von Zellen, anpassen, um 2 x 10 5 Zellen / ml mit RPMI 10% FBS, und fügen Sie rm-GM-CSF (20 ng / ml Endkonzentration) 5. </li><li> 10 ml dieser Suspension in eine sterile, mikrobiologische Qualität, 10 cm Petrischale und Kultur in einem CO 2-Inkubator (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Drei Tage später kommen weitere 10 ml RPMI 10% FBS mit 20 ng / l rmGM-CSF zu jedem der vorbereiteten Platten. </li><li> Drei Tage später 10 ml Zellsuspension aus jeder Petrischale erholt, zentrifugiert, wie in 1,6, resuspendiert in das gleiche Volumen RPMI 10% FBS mit rmGM-CSF und kehrte in die Petrischale. Die Zellen werden für 2 weitere Tage in der CO 2-Inkubator. </li></ol> 2. Sammlung und Kennzeichnung von DCs <ol><li> Nach 8 Tagen in Kultur lose anhaftenden Zellen werden durch Waschen der Petrischalen mit frischem Medium wieder. Dieses Protokoll macht etwa 2-4 x10 8 DCs in unseren Händen. Die Zellen können für DC-Phänotyp mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. </li><li> Gesammelten Zellen werden dann mit den Qtracker 655 Zellen Labeling Kit streng nach den Anweisungen des Herstellers gekennzeichnet. </li><li> Wir haben hervorragende Ergebnisse Kennzeichnung murinen Knochenmark-abgeleitete DCs mit qdots bei 10 nM Konzentration. Um dies zu erreichen, Aliquots Qtracker Zelle Labeling Kit Komponenten A und B sind in gleichen Volumina gemischt, inkubiert für 5 min bei Raumtemperatur, und sofort verdünnt 1 / 100 in frischem Medium mit Vortexen für 30 s. </li><li> Um Flecken 5 x 10 6 DCs, mix 5 ul der einzelnen Komponenten des Kits A und B in einem Eppendorf-Röhrchen und inkubieren für 5 min bei Raumtemp. Dann fügt man 1 ml RPMI 10% FBS inkubiert, und Vortex für 30 Sekunden. </li><li> 0,5 ml Zellsuspension mit 5 x10 6 DCs, und bei 37 ° C für 60 min. </li><li> Dann waschen Sie die Zellen 2X in RPMI 10% FBS (1.100 RPM). Die Zellen können in RPMI für weitere Kultur oder in PBS werden für die Injektion in Versuchsmäusen resuspendiert. </li></ol> 3. Evaluation von markierten DC <ol><li> Zellmarkierung können mittels Fluoreszenz-Mikroskopie ausgewertet werden. Um dies zu erreichen, ist ein Tropfen der Zellsuspension auf einen Objektträger gegeben, bedeckt mit einem Deckglas und ausgewertet mit einem Fluoreszenzmikroskop unter Berücksichtigung, dass diese qdots Emissions-und Anregungsspektren von 565nm und 405-525nm haben bzw. (Abb. 3 ) </li><li> An diesem Punkt können die markierten Zellen verwendet werden, um Tiere zu injizieren, oder Reifung kann durch Inkubation dieser Zellen für 48 h induziert werden (37 ° C, 5 CO 2) in Gegenwart von LPS (100 ng / ml) und TNF-( 20 ng / ml). Fluoreszenzmarkierung nicht durch DC-Reifung (Abb. 4) betroffen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Hiermit erklären wir beschrieben, wie man murine Knochenmark abgeleiteten DCs vorbereiten und wie beschriftet sie mit fluoreszierenden qdots. Abb.. 1 fasst die Verfahren, um die Zelle zu erhalten, während Abb.. 2 zeigt das Verfahren, um sie mit qdots Etikett. Wie in Abb.. 3, fast alle Zellen werden durch diesen Vorgang bezeichnet, und das ist nicht von DC-Reifung mit entzündlichen Faktoren (Abb. 4). Abb. betroffen. 5 zeigt, dass Qdot-gefärbten DCs (Abb. 5a), vergleichbar mit nicht-gefärbten Zellen verhalten, wenn mit einer entzündlichen Cocktail behandelt. Beide Zellpräparationen ähnlich hochregulieren Ausdruck kostimulatorischen Molekülen (Abb. 5b), und produzieren ähnliche Mengen an IL-6 (Abb. 5c) und Stickstoffmonoxid (Abb. 5d) bei der Reifung Reize. Dies stimmt mit VorjahrOrganisationseinheiten veröffentlichten Daten zeigt, dass Qdot Färbung hat keinen Einfluss auf die Fähigkeit von DC bis zu reifen Zellen hervorrufen können Immunreaktionen [6] ein. Diese Zellen können dann für die Injektion Versuchstiere verwendet werden. Wie in Abb.. 6, 2 Tage nach intravenöser Injektion von markierten DCs in Mäusen, konnten wir Qdot-gefärbten Zellen in der Milz zu erkennen. Dies ist auch in Übereinstimmung mit früheren veröffentlichten Daten über die Verwendung der Qdot Nanokristalle zur Migration von DC in vivo zu bewerten [6] durch nicht-invasive Bildgebung und Durchflusszytometrie. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Flussdiagramm DC-Generation aus dem Knochenmark. Hiermit möchten wir zeigen den Prozess zu Knochenmark-abgeleitete DC zu erhalten. Beide Schienbeine und Oberschenkel sind seziert und sauber aus den umliegenden Gewebes. Knochen Tipps erhalten und das Innere der Knochen sind mit mittlerer gespült. Nach Beseitigung roten Blutkörperchen, sind Knochenmarkszellen für 8 Tage in Gegenwart von GM-CSF, um sie in DCs differenzieren kultiviert. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Flussdiagramm der Kennzeichnung Verfahren. Equal Aliquots Qtracker Zelle Labeling Kit Komponenten A und B sind in ein Eppendorf-Röhrchen gemischt. Dendritische Zellen sind aus 8-Tage-Knochenmark-Kulturen mit GM-CSF gesammelt und mit dem Etikett Farbstoff für 60 min bei 37C. Dann Zellen werden in Medium gewaschen, um überschüssige Markierung von Partikeln zu vermeiden. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Fluorescent Mikrofotografie von DCs sofort nach der Markierung. Ein Tropfen der markierten Zellen wurde auf einen Objektträger aufgebracht und bedeckt von einem Deckglas. Dann wurden die Proben in einem Fluoreszenz-Mikroskop ausgewertet und die Bilder wurden durch eine Micropublisher 5,0 Digitale CCD-Farbkamera (Qimaging, Surrey, BC Canada) erworben. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Fluorescent Mikrofotografie von DCs nach 48 h Reifung in vitro. Labeled DCs wurden für 48 h mit LPS (100 ng / ml) und TNF-α (20 ng / ml) auf Glasplättchen auf einer CO 2-Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) kultiviert. Dann wurden die Proben mit PBS (5 min, 2X) gewaschen, mit Aceton (15 min, 4 ° C) und Gegenfärbung mit DAPI. Die Zellen wurden in einem Fluoreszenz-Mikroskop wie oben ausgewertet. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig5.jpg" alt="Abbildung 5"/> Abbildung 5. Biologische Aktivität von Qdot gefärbten reifen DCs. Labeled DCs in vitro wie oben gereift wurden mittels Durchflusszytometrie (A) analysiert und (B). (A) Qdot-gefärbten Zellen geben ein starkes Signal in der FL3 (PerCP) Kanal. Shaded Histogramm: ungefärbten Kontrolle. Und Isotypkontrollen; (B) Qdot-gefärbten und ungefärbten DCs wurden zusätzlich mit spezifischen Antikörpern gegen Reifung Marker CD86 und CD40 gefärbt. Die Zellen wurden dann in einem FACSort Durchflusszytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) analysiert. Zusätzlich wurden IL-6 (C) und Stickstoffmonoxid (NO) in Überständen von reifen Qdot-gefärbten DCs und Kontrollen bestimmt. Spiegel von IL-6 und Stickoxid wurden mittels ELISA-Analyse und Griess-Assay als wir bisher 7 beschrieben, 8 bestimmt. Alle Daten zeigten in dieser Abbildung ist repräsentativ für zwei oder drei unabhängigen Experimenten zeigen ähnliche Ergebnisse. Die Daten wurden mittels ANOVA mit dem GraphPad Software analysiert. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig6.jpg" alt="Abbildung 6"/> Abbildung 6. Erkennung von markierten DCs in seziert Gewebe. Labeled reife DCs (1x10 6 Zellen) wurden intravenös in C57BL / 6 Mäusen injiziert. (A) Zwei Tage später Mäuse getötet und Milz gesammelt, schockgefroren, eingebettet in OCT und 8 pM Abschnitte hergestellt unter Verwendung eines Kryostaten. Dann wurden die Proben mit Aceton (15 min, 4 ° C) fixiert und mit DAPI gegengefärbt. Die Zellen wurden in einem Fluoreszenz-Mikroskop wie oben ausgewertet Abb. 6a:. 40fache Vergrößerung, Abb. 6b: 100-facher Vergrößerung, Bild. 6C, 400-facher Vergrößerung.

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Murine myeloische) DCs wurden ausgiebig genutzt, um die Wirksamkeit und Verbesserung der DC-basierte Impfstoffe zu bestimmen; untersuchen DC: T-Zell-Interaktionen oder DC Entwicklung und bestimmen ihre Rolle bei verschiedenen Erkrankungen 9-11. Hiermit zeigen wir, wie DCs aus Vorläufern aus den Knochen Zucchini der Schienbeine und Oberschenkel erholt zu generieren. Wir gewinnen die Knochen ohne Schneiden der Spitzen, so dass wir sie durch Eintauchen in 70% igem Ethanol sterilisiert, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination. Zur Unterscheidung DCs aus dem Knochenmark Zellen verwenden wir nur GM-CSF, wie oben beschrieben 5. Obwohl einige Protokolle auch IL-4, ist berichtet worden, dass dieses Zytokin nicht notwendig ist, bei der Arbeit mit einem hohen Grad von GM-CSF 12. In der Tat haben wir bereits gezeigt, dass diese DCs in der Lage, Immunreaktionen 13 induzieren. Auch ist darauf zu achten, um nur lose anhaftenden Zellen aus 8-Tage-Kulturen wieder durch Waschen der Petrischalen mit Medium, da anhaftenden Zellen eine Monozyten-ähnlichen Phänotyp zeigen. Hier zeigen wir die Kennzeichnung von DCs mit fluoreszierenden Qdot Partikel. Diese Kennzeichnung hat einige Vorteile gegenüber anderen Methoden. Zunächst werden die qdots Teilchen leicht in die Zellen aufgenommen. Zweitens ist die Fluoreszenz-Signal sehr hoch und wird nicht von DC Reifung verändert. Drittens wird die Fluoreszenz nicht verloren, wenn Zellen oder Gewebe mit Lösungsmitteln wie Aceton, entgegen dem, was passiert, wenn GFP wird verwendet, um DCs 14 Tag, was mehr Flexibilität im Moment zu Färbeprotokollen wählen fixiert sind. Schließlich erlaubt die hohe Fluoreszenz-Signal durch diese Partikel gegeben Visualisierung der Zellen trotz Gewebe Autofluoreszenz. Wie bereits 6 beschrieben, hat Qdot Färbung keinen Einfluss auf die Reifung Fähigkeit dieser Zellen. Hiermit zeigen wir, dass Qdot-gefärbten DCs in ähnlicher Weise als nicht-gefärbten DCs verhalten, heraufregulierende kostimulatorischen Molekülen und produzieren IL-6 und Stickstoffmonoxid in Reaktion auf entzündliche Reize. Obwohl DCs Zellen bei der Auslösung von Immunreaktionen spezialisiert sind, haben sie gezeigt, dass bei pathologischen Zuständen wie Krebs und Arteriosklerose 4, 15, 16 Jahren teilnehmen. Sie wurden auch behauptet, in angiogenen Prozess 17, 18, ​​auch als strukturell an der Entwicklung von neuen Schiffen 19, 20 vorgeschlagen teilzunehmen. So Methoden, die für DC-Tracking in vivo, und die Bestimmung ihrer geografischen Lokalisation in verschiedenen Geweben 4, 21 zu ermöglichen, sind 22 sehr wertvoll.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> C57BL / 6 Mäusen </td><td> Jackson Laboratorien </td><td></td><td> Weiblich, 6-8 Wochen alt </td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-119 </td><td></td></tr><tr><td> Rinderfötenserum, qualifizierte </td><td> Invitrogen </td><td> 10437-028 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotika-Antimykotikum </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-096 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10010-049 </td><td></td></tr><tr><td> ACK Lysepuffer </td><td> Lonza Walkersville, Inc </td><td> 10-548E </td><td></td></tr><tr><td> Rekombinantes murines GM-CSF </td><td> PeproTech Inc </td><td> 315-03 </td><td></td></tr><tr><td> Qtracker 655 Zellen Labeling Kit </td><td> Invitrogen </td><td> Q25021MP </td><td></td></tr><tr><td> Lipopolysaccharide </td><td> Invivogen </td><td> tlrl-eblps </td><td></td></tr><tr><td> Rekombinantes murines TNF alpha </td><td> PeproTech </td><td> 315-01A </td><td></td></tr><tr><td> CD86-Antikörper </td><td> BD Biosciences </td><td> 553691 </td><td></td></tr><tr><td> CD40-Antikörper </td><td> BD Biosciences </td><td> 553791 </td><td></td></tr><tr><td> Griess-Reagenz-System </td><td> Promega </td><td> G2930 </td><td></td></tr><tr><td> IL-6 Fänger-Antikörper </td><td> eBioscience </td><td> 13-7061-81 </td><td></td></tr><tr><td> IL-6 Nachweisantikörper </td><td> eBioscience </td><td> 13-7062-81 </td><td></td></tr></tbody></table>

generation and labeling of murine bone marrow-derived dendritic cells with qdot nanocrystals for tracking studies

Dendritische Zellen (DCs) sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen (APC) in peripheren Geweben und in der immunologischen Organe wie Thymus, Knochenmark, Milz, Lymphknoten und Peyer-Plaques 1-3 gefunden. DCs im peripheren Gewebe Probe des Organismus auf das Vorhandensein von Antigenen, die sie aufnehmen, verarbeiten und präsentieren in ihrer Oberfläche im Rahmen der Haupthistokompatibilitätskomplex-Moleküle (MHC). Dann Antigen-beladenen DCs zu immunologischen Organen, wo sie derzeit die verarbeiteten Antigen an T-Lymphozyten auslösen spezifische Immunantwort zu migrieren. Eine Möglichkeit, die wandernde Fähigkeiten von DCs zu bewerten ist, sie mit fluoreszierenden Farbstoffen 4 Label. Hiermit zeigen wir die Verwendung von Qdot fluoreszierenden Nanokristallen zu murinen Knochenmark-abgeleitete DC-Label. Der Vorteil dieser Kennzeichnung ist, dass Qdot Nanokristalle stabile und langlebige Fluoreszenz, die sie ideal für die Erkennung markierter Zellen in Geweben wieder zu besitzen. Um dies zu erreichen, werden zunächst Zellen aus murinem Knochen Zucchini gewonnen und kultiviert für 8 Tage in Anwesenheit von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor, um DC Differenzierung zu induzieren. Diese Zellen werden dann mit fluoreszierenden Quantenpunkte werden durch kurze In-vitro-Inkubation gekennzeichnet. Gefärbte Zellen mit einem Fluoreszenz-Mikroskopie sichtbar gemacht werden. Die Zellen können in Versuchstiere an dieser Stelle injiziert werden oder können zu reifen Zellen auf in-vitro-Inkubation mit entzündlichen Stimuli werden. In unseren Händen hat DC Reifung nicht bestimmen, Verlust der Fluoreszenz-Signal auch nicht Qdot Färbung beeinflussen die biologischen Eigenschaften des DCs. Nach der Injektion können diese Zellen im Immunsystem Organe durch Fluoreszenz-Mikroskopie werden folgende typische Präparation und Fixierung identifiziert.

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Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritische Zellen Aufnahme Antigene und wandern in Richtung Immunsystem Organe prozessierte Antigene, die auf T-Zellen präsentieren. Qdot Nanokristall Kennzeichnung stellt eine langfristige und stabile Fluoreszenz-Signal. Dies ermöglicht die Verfolgung von dendritischen Zellen in verschiedenen Organen durch Fluoreszenz-Mikroskopie.

Erzeugung und Kennzeichnung von Murine Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen mit Qdot Nanokristalle für Tracking-Studien

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

generation-labeling-murine-bone-marrow-derived-dendritic-cells-with

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

24.7K Aufrufe.  Ohio University. Dendritische Zellen Aufnahme Antigene und wandern in Richtung Immunsystem Organe prozessierte Antigene, die auf T-Zellen präsentieren. Qdot Nanokristall Kennzeichnung stellt eine langfristige und stabile Fluoreszenz-Signal. Dies ermöglicht die Verfolgung von dendritischen Zellen in verschiedenen Organen durch Fluoreszenz-Mikroskopie.

Serie: Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

Untersuchung von Makrophagen-Polarisation mit Knochenmark-Makrophagen

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen-Produktion

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

Isolierung und intravenöse Injektion von Maus-Knochenmark stammenden Monozyten

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. The immune system is a constant balance in maintaining tolerance to self-molecules and reacting rapidly to pathogens. Dendritic cells (DCs) are powerful professional antigen presenting cells that link the innate immune system to the adaptive immune system and balance the adaptive response between self and non-self. Depending on the maturation signals, immature dendritic cells can be selectively stimulated to differentiate into immunogenic or tolerogenic DCs. Immunogenic dendritic cells provide proliferation signals to antigen-specific T cells for clonal expansion; while tolerogenic dendritic cells regulate tolerance by antigen-specific T-cell deletion or clonal expansion of regulatory T-cells. Due to this unique property, dendritic cells are highly sought after as therapeutic agents for cancer and autoimmune diseases. Dendritic cells can be loaded with specific antigens in vitro and injected into the human body to mount a specific immune response both immunogenic and tolerogenic. This work presents a means to generate in vitro from monocytes, immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), tolerogenic and mature moDCs that differ in surface marker expression, function and metabolic phenotypes.

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

Die Erzeugung von Unreife, Ältere und Tolerogene Dendritischen Zellen mit unterschiedlichen Metabolic Phänotypen

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

Erzeugung und Identifizierung von GM-CSF Abgeleitet Alveolare ähnlichen Makrophagen und dendritische Zellen aus Knochenmark der Maus

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Herstellung von menschlichen Monozyten abgeleiteten Dendritischen Zellen aus Vollblut

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Erzeugung einer großen Zahl von myeloischen Vorläuferzellen und dendritischen Zellen Vorstufen aus murinen Knochenmark mit einer neuartigen Zelle Sortieren Strategie

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

An &lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Mouse Model to Measure Na&amp;#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

Eine In Vivo Mausmodell Maßnahme naive CD4-T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch Knochenmark-abgeleitete Dendritische Zellen

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von aus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen aus Mäusen

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...