Die Arbeit wird von einem Institut Development Award aus dem Kinderkrankenhaus von Philadelphia unterstützt.

Ein. Querverbindung Chromatin <ol><li> Wachsen Zellen in 100x20mm Zellkulturschalen. Die Menge der Zellen können von 1 bis 10 Millionen Zellen pro Schale je nach Zelltyp reichen. Etwa 2 Millionen Zellen ist ausreichend für eine Immunpräzipitation. </li><li> Querverbindung Zellen in 1% Formaldehyd für 10 min bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Schaukelstuhl. </li><li> Quench Vernetzung durch Zugabe einer Endkonzentration von 125 mM Glycin und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur gerührt. </li><li> Waschen der Zellen mit 1X Phosphate Buffered Saline (PBS) zweimal, dekantieren PBS, und fügen Sie 0,2 ml PBS. </li><li> Ernten Sie die Zellen mit einem Kunststoff Zellenabstreifer in ein Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Spin down Zellen bei 2.000 rpm für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Saugen Sie den Überstand. Die Zellen in SDS-Lyse-Puffer (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8,1) für Ganzzelllysat oder halten sie als Pellet für nukleare Extraktion. </li><li> Die Zellen können bei -80 ° C gespeichert werden, oder man kann immediat gehenEly mit Beschallung. </li></ol> 2. Bereiten Kerne (Fahren Sie mit 3.5 für Ganzzelllysat Schritt) <ol><li> Nachtrag Cell Lysis Buffer (5 mM PIPES pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40) mit 1X Proteinase-Inhibitor jedes Experiment. </li><li> Resuspendieren aufgetaut Zellpellet in etwa das 10-fache Volumen Pellet mit Cell Lysis Buffer. </li><li> Dounce nachhomogenisieren 10 mal mit Stößel dann auf Eis inkubieren 10 min. </li><li> Zentrifuge Probe bei 4.000 rpm für 5 min bei 4 ° C, Überstand verwerfen und speichern Kernpellet. </li></ol> 3. Beschallung * <ol><li> Warm up SDS Lysis Buffer und Ergänzung Menge Puffer mit Proteinase-Inhibitor verwendet werden. </li><li> Resuspendieren Kernpellet in SDS Lysis Buffer (ca. 0,5 ml Puffer pro 1-10.000.000 Zellen) </li><li> Inkubation auf Eis für 10 min. </li><li> 0,5 ml Aliquots der Proben zu Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Mit Ultraschall auf nassem Eis mit Misonix Ultraschallgerät mit 30 Sek. auf 45 Sek. undoff bei einer Amplitude von 2 Einstellung. Anzahl der Zyklen für ideal Fragmentgröße werden, indem zuerst versucht verschiedene Taktzahlen (zB 2, 4, 8, 12, 16 und 20 oder mehr Zyklen) ermittelt werden. Eine andere Marke von Ultraschallgerät verwendet, jedoch die Bedingungen variiert werden. Versuche mit der Anzahl der Zyklen und Zeit-und Ausschalten muß durchgeführt werden, um die optimalen Bedingungen zu bestimmen. </li><li> Sammle 20 ul jeder Probe Beschallung Ergebnisse zu überprüfen und zu quantifizieren tun. Der Rest der Probe bei -80 ° C gelagert werden </li><li> Verdünnen Sie die 20 ul Probe durch Zugabe von 30 ul 0,1 × TE-Puffer. </li><li> Gönnen Probe mit 1 ul RNase A bei 37 ° C für 1 Stunde dann 1 ul Proteinase K und Inkubation bei 62 ° C für 2 Stunden. </li><li> Führen Sie 20 ul der Probe auf einem 2% Agarosegel. </li><li> Reinigen Sie die verbleibende Probe mit QIAquick PCR Purification Kit dann quantifizieren mit NanoDrop Spektralphotometer. </li></ol> * Für nativen ChIP kann microccocal Nucleaseverdau alternativ zum Abscheren des DNA verwendet werden. 4. Blockieren Agarosekügelchen * <ol><li> Wenn Perlen bereits blockiert sind, gehen Sie zu Schritt 5.1. </li><li> Verwenden Protein A oder Protein G-Agarose. Für 5 Immunpräzipitationen (IPs), verwenden Sie 600 ul 50% Kügelchenaufschlämmung (300 ul Wulst Pellet) </li><li> Um die Perlen waschen, schleudern sie unten bei 800 rpm für 1 min bei 4 ° C und Überstand verwerfen. In etwas mehr als 2 ml ChIP Dilution Buffer (0,01% SDS, 1,2 mM EDTA, 167 mM NaCl, 1,1% Triton X-100, 16,7 mM Tris-HCl pH 8,1) zugeben und langsam umdrehen, die Röhre 10X. Spin down wieder bei 800 rpm für 1 min bei 4 ° C und Überstand verwerfen. Wiederholen Sie die Wäsche 2 weitere Male. </li><li> Blockieren Perlen durch Drehen bei 4 ° C über Nacht in Blocking-Lösung. Siehe Tabelle 1 für das Rezept des Blocking-Lösung. </li></ol> 5. Pre-clear Chromatin <ol><li> Thaw beschallt Chromatin auf Eis. </li><li> Spin down bei 12.000 rpm foder 10 min bei 4 ° C auf Eis sofort, SDS (weiß Pellet) entfernen setzen. </li><li> Sammle Überstand verwerfen Pellet, und kombinieren Proben, wenn nötig. </li><li> Nehmen Sie die Beträge für das Experiment auf Berechnungen (1-10 ug von Chromatin pro IP) benötigt. </li><li> Verdünnen Chromatin 10X in ChIP Dilution Buffer mit Proteinase-Inhibitor ergänzt. </li><li> In 100 ul blockiert Perlen pro IP. </li><li> Drehen bei 4 ° C für 1 Stunde. </li></ol> 6. Immunpräzipitation <ol><li> Spin down Proben bei 800 rpm für 1 min und den Überstand in ein frisches Röhrchen. </li><li> Spin down Überstand bei 800 rpm für 1 min und Übertragung auf ein anderes sauberes Röhrchen. </li><li> Sparen Sie 20 ul der Überstand, die als Input-Steuerung dienen, bei -20 ° C. </li><li> Aliquot des Chromatins der Anzahl von IPs in den Test erfolgen. </li><li> In 2 ug Antikörper pro 1-10 ug von Chromatin zu jeder Probe. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 4 ° C Drehung. </li><li> In 100 ul blockiert Perlen an jede IP-Probe. </li><li> Inkubation für 1 h bei 4 ° C unter Rotation. </li><li> Pellet die Perlen indem sie zum Stillstand bei 800 rpm für 1 min und entsorgen Sie so viel von der Überstand wie möglich. </li><li> Waschen Sie Perlen einmal mit wenig Salz Immune Complex Waschpuffer. 1 ml Puffer in jedes Röhrchen, drehen bei Raumtemperatur 5-8 min; Spin-Down bei 800 rpm für 1 min, dann Überstand verwerfen. Wiederholen waschen einmal mit hoher Salz Immune Complex Waschpuffer und LiCl Immune Complex Waschpuffer und zweimal mit TE-Puffer für insgesamt 5 Wäschen (Tabelle 2). </li></ol> 7. Elution <ol><li> Thaw Eingang Proben aus vorherigen Tag, um mit den Fliessmitteln verarbeitet werden. </li><li> Als Elutionspuffer frisch (Tabelle 3). </li><li> Machen Sie einen Master-Mix von genug Elutionspuffer für IPs und Eingang Kontrollproben sowie 1-2 zusätzliche Proben benötigt. </li><li> 100 l Elutionspuffer auf jedem IP Probe und Inkubation bei Raumtemperatur für 15 mMit Drehung. </li><li> Spin down bei 800 rpm für 1 min und fügen Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen. </li><li> Einen weiteren hinzufügen 100 ul Elutionspuffer zu jedem Röhrchen von Perlen und Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min mit der Drehung. </li><li> Vortex für 15 sec nach der Inkubation; Abzentrifugieren bei 5000 Upm für 1 min, dann verbinden sich mit dem Überstand aus der ersten Elution Überstand. (Stellen Sie sicher, dass keine über Perlen in den Überständen links. Falls Sie unsicher sind, Spin-down Überstand erneut bei 5.000 rpm für 1 min und den Überstand in ein neues Röhrchen. </li><li> In 180 ul Elutionspuffer auf die 20 ul Eingang Kontrollproben. </li></ol> 8. Reverse-Kreuz-link <ol><li> Zum 200 ul Elutionsmitteln und Eingabe-Steuerelemente, Add 8 ul 5 M NaCl. </li><li> Seal-Röhrchen mit Parafilm und Inkubation im Wasserbad bei 65 ° C über Nacht. </li></ol> 9. DNA Purification <ol><li> Behandle jeden Probe mit 1 ul RNase A für 1 h bei 37 ° C. </li><li> In 4 μl von 0,5 M EDTA, 8 ul 1 M Tris-HCl, mischen, dann fügen Sie 1 ul Proteinase K zu jeder Probe und Inkubation bei 45 ° C für 2 Stunden. </li><li> Reinigen Sie die Proben mit dem QIAquick PCR Purification Kit. Die Proben können bei -20 ° C und PCR Check gespeichert werden können, zu einem späteren Zeitpunkt durchgeführt werden. </li></ol> * Alternativ können ChIP-grade magnetischen Kügelchen anstelle Agarose für die Immunpräzipitation Teil verwendet werden. 10. PCR Check <ol><li> Für die PCR Überprüfung einfach Primer für Regionen bekannt, die durch das Protein von Interesse gebunden werden. Verwenden Sie außerdem Primer für nicht-bindenden Regionen als negative Kontrollen. </li><li> Mischen Sie die Reagenzien für die Reaktion. Verdünnen Eingang Probe bei 1:100 (Tabelle 3). </li><li> Führen Reaktion. PCR-Programm: </li></ol> Schritt 1: 94 ° C 3 min Schritt 2: 94 ° C 20 sec 59 ° C 30 sec 72 ° C 30 sec (Wiederholen Sie Schritt 2 für mindestens 30 cycln) Schritt 3: 72 ° C 2 min <ol start="4"><li> Führen Proben auf 1% Agarosegel. </li><li> Die Anreicherung kann auch quantitativ mit Echtzeit-PCR bestimmt. </li></ol>

<ol>
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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+loci+are+significantly+over-represented+among+genes+bound+by+transcription+factor+7-like+2+(TCF7L2)+in+vivo.">Disease-associated loci are significantly over-represented among genes bound by transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) in vivo.</a> Diabetologia. 53, 2340-2346 (2010).</li><li>Benjamini, Y., Yekutieli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+trait+Loci+analysis+using+the+false+discovery+rate.">Quantitative trait Loci analysis using the false discovery rate.</a> Genetics. 171, 783-790 (2005).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Es ist nun möglich, die Durchführung einer genomweiten Profil von Protein-DNA-Wechselwirkungen Assoziation mit ChIP-seq, wie bereits vor kurzem mit anderen Transkriptionsfaktoren 2,3 demonstriert. Der Schlüssel zu einer erfolgreichen Sequenzierung Ergebnis ist die Erzeugung eines hochwertigen Chromatinimmunpräzipitation DNA-Vorlage. Sobald die DNA-Matrize erzeugt wurde und festgestellt, angemessen angereichert werden, kann man dann nehmen Sie es in der Bibliothek Vorbereitung ...

Seit vielen Jahren hat es einen unerfüllten Bedarf, um den Satz von Genen, gebunden und durch ein bestimmtes Protein genomweiter, insbesondere in den Transkriptionsfaktor reguliert Klasse zu identifizieren. Odom et al. 1 verwendet Chromatinimmunpräzipitation (Chip) mit Promoter Microarrays systematisch zu identifizieren, die Gene von vorgegebenen Transkriptionsfaktoren in der menschlichen Leber und Pankreas-Inseln besetzt kombiniert. Anschließend entwickelte Johnson et al. 2 eine groß angelegte Chromatinimmunpräzipitation Assay auf direkte Ultra Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung (ChIP-seq), um umfassend abzubilden Protein-DNA-Wechselwirkungen über die gesamte Säugergenomen basiert. Als Testfall sie in vivo der Bindung des Neuron-einschränkende Faktor Schalldämpfer (NRSF) bis 1946 Stellen im menschlichen Genom abgebildet. Die angezeigten Daten scharfen Auflösung von verbindlichen Position (+ 50 Basenpaare), die sowohl die i erleichtertsolation der Motive und der Identifizierung von NRSF-bindende Motive. Diese ChIP-seq Daten hatten auch hohe Sensitivität und Spezifität und statistische Sicherheit (P &lt;10 -4), Eigenschaften, die wichtig für die Ableitung neuer Kandidat Wechselwirkungen sind. Robertson et al. 3 auch ChIP-seq verwendet werden, um Ziele in der Karte STAT1 Interferon-γ (IFN-γ)-stimulierten und unstimulierten humanen HeLa S3-Zellen in vivo. Durch ChIP-seq, mit 15,1 und 12,9 Mio. eindeutig zugeordnet Sequenz liest, und eine geschätzte False Discovery Rate von weniger als 0.001, identifizierten sie 41.582 und 11.004 mutmaßliche STAT1-bindenden Regionen in stimulierten und unstimulierten Zellen. Von den 34 Loci bekannt STAT1 auf Interferon ansprechenden Bindungsstellen 4-8 enthalten, gefunden ChIP-seq 24 (71%). ChIP-seq Ziele wurden in Sequenzen ähnlich bekannt STAT1 Bindungsmotive bereichert. Vergleiche mit zwei bestehenden ChIP-PCR-Datensätze vorgeschlagendass ChIP-seq Sensitivität lag zwischen 70% und 92% und eine Spezifität von mindestens 95%. Darüber hinaus war es klar, dass ChIP-seq sowohl niedrige analytische Komplexität und Sensibilität, die mit zunehmender Tiefe Sequenzierung bietet. Als solche &quot;nächsten Generation&quot; Genom-Sequenzierung Technologien bieten 1-2 Größenordnungen Anstieg in Höhe von Sequenz, die kostengünstig gegenüber älteren Technologien 9 erzeugt werden können. ChIP-seq Methoden daher direkt liefern Ganzgenom Abdeckung für wirksame Profilierung der Säuger Protein-DNA-Wechselwirkungen 3. Im Jahr 2006 wurde eine starke Assoziation von Varianten in den Transkriptionsfaktor 7-like 2 (TCF7L2) Gen mit Typ-2-Diabetes 10 entdeckt. Andere Forscher haben bereits unabhängig diese Feststellung in verschiedenen Ethnien repliziert und interessanterweise von den ersten genomweiten Assoziationsstudien von Typ-2-Diabetes in Nature veröffentlicht 11,12 </sup&gt;, Wissenschaft und anderswo 13-15 16,17 war die stärkste Assoziation mit der Tat TCF7L2, dies ist nun die wichtigste genetische Befund bei Typ-2-Diabetes als 18-20 Laufenden. Darüber hinaus hat TCF7L2 das Krebsrisiko 21,22 in Verbindung gebracht worden, ja, wurde diese Verbindung noch deutlicher, wenn der Locus 8q24 durch genomweite Assoziationsstudien von einer Reihe von Krebsarten, einschließlich kolorektalen Karzinomen ergab, wurde gezeigt, dass durch eine extreme stromaufwärts TCF7L2 bindende Element der Fahrt die Transkription von MYC 23,24. Daher besteht ein großes Interesse an der Feststellung der nachgeschalteten Gene durch diese Taste Transkriptionsfaktor reguliert. Basierend auf den Erfahrungen mit TCF7L2 als Beispiel der Methodik, umreißt dieses Papier wie man qualitativ hochwertige ChIP-DNA-Template zu erzeugen. Chip wurde im kolorektalen Karzinom-Zelllinie HCT116, z. anschließende Sequenzierung, um Aufbau eines High-Resolution Karte der Gene durch TCF7L2 25 in dem Bestreben, weitere Einblicke in seine wichtige Rolle in der Pathogenese von komplexen Merkmalen ergeben gebunden.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28104 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-ChIP Kit </td>
 <td>Millipore </td>
 <td>17-371 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GoTaq Hot Start Polymerase </td>
 <td>Promega</td>
 <td>M5001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Misonix Sonicator</td>
 <td>Qsonica </td>
 <td>XL-2000 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>
 NanoDrop 1000 Spectrophotometer </td>
 <td>
 Thermo-Scientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Positive control primer sequences (TCF7L2-1) 
 Forward- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' 
 Reverse- 5'-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3' 
 Negative control primer sequences (CTRL-1) 
 Forward-5'-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3'
 
 Reverse- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3'</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

generation of high quality chromatin immunoprecipitation dna template for high-throughput sequencing (chip-seq)

ChIP-Sequenzierung (ChIP-seq) Methoden direkt anbieten Ganzgenom Deckung, wo die Kombination Chromatinimmunpräzipitation (Chip) und massiv parallele Sequenzierung genutzt werden, um das Repertoire der Säuger-DNA-Sequenzen, die von Transkriptionsfaktoren in vivo gebunden zu identifizieren. &quot;Next-Generation&quot; Genom-Sequenzierung Technologien bieten 1-2 Größenordnungen Anstieg in Höhe von Sequenz, die sein können kostengünstig im Vergleich zu älteren Technologien erzeugt so dass für ChIP-seq Methoden, um direkt zur Verfügung Ganzgenom Abdeckung für wirksame Profilierung von Säugetieren Protein-DNA-Wechselwirkungen. Für eine erfolgreiche ChIP-seq Ansätze, muss man erzeugen hochwertige ChIP DNA-Vorlage, um die besten Ergebnisse zu erhalten Sequenzierung. Die Beschreibung ist um Erfahrungen mit dem Proteinprodukt des Gens am stärksten in der Pathogenese von Diabetes Typ 2, nämlich der Transkriptionsfaktor Transkriptionsfaktor 7-like 2 (TCF7L2 gebracht basierend). Dieser Faktor ist auch in verschiedenen Tumoren in Verbindung gebracht. Skizziert ist wie man qualitativ hochwertige ChIP DNA-Vorlage aus dem kolorektalen Karzinom Zelllinie HCT116 abgeleitet zu erzeugen, um eine hochauflösende Kartendarstellung durch Sequenzierung der Gene von TCF7L2 gebunden bestimmen zu bauen, geben weitere Einblicke in seine wichtige Rolle in der Pathogenese von komplexen Merkmalen.

Sobald das Chromatin wurde mit Ultraschall behandelt wurde, und wurden mit RNase und Proteinase behandelt, sollten die Proben auf der 2% igen Agarosegel aufgetrennt ein Abstrich mit der Masse der DNA, die in der gewünschten Größe. Wenn mehrere Zyklen geprüft, ist eine allmähliche Abnahme in der Größe der Anzahl von Zyklen erhöht (Abbildung 2) zu sehen. Nach Abschluss der Immunopräzipitation des Protokolls ist die Anreicherung kann entweder durch PCR oder Echtzeit-PC...

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Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Die Kombination von Chromatinimmunpräzipitation und ultra-Sequenzierung mit hohem Durchsatz (Chip-seq) zu identifizieren und abzubilden Protein-DNA-Wechselwirkungen in einem bestimmten Gewebe oder Zelllinie. Skizziert ist, wie man eine hohe Qualität ChIP Vorlage für anschließende Sequenzierung mit Erfahrung mit dem Transkriptionsfaktor TCF7L2 als Beispiel zu generieren.

Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

24.3K Aufrufe.  Children's Hospital of Philadelphia Research Institute. Die Kombination von Chromatinimmunpräzipitation und ultra-Sequenzierung mit hohem Durchsatz (Chip-seq) zu identifizieren und abzubilden Protein-DNA-Wechselwirkungen in einem bestimmten Gewebe oder Zelllinie. Skizziert ist, wie man eine hohe Qualität ChIP Vorlage für anschließende Sequenzierung mit Erfahrung mit dem Transkriptionsfaktor TCF7L2 als Beispiel zu generieren.

Serie: Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Hoch effiziente Ligation kleine RNA-Moleküle für MicroRNA Quantifizierung von Hochdurchsatz-Sequenzierung

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Forschung

Biologie

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Gezielte DNA Methylierungsanalyse von Next-Generation-Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Chromatinimmunpräzipitation Assay zur Identifizierung von Arabidopsis-Protein-DNA-Wechselwirkungen<em&gt; In-vivo-</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DAMiD-seq: Genomweite Mapping von Protein-DNA-Wechselwirkungen von Hochdurchsatz-Sequenzierung von Adenin-methylierten DNA-Fragmenten

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

High-throughput CRISPR Vector Konstruktion und Charakterisierung von DNA-Modifikationen durch Erzeugung von Tomaten Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

Ein Protokoll für Functional Assessment of Whole-Protein Sättigungsmutagenese-Bibliotheken mit Hilfe von High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable of measuring SSDC in many single DNA molecules simultaneously. Bead-tethered substrate DNAs, each containing a single copy of the target sequence, are prepared in a microfluidic flow channel. An external magnet applies a weak force to the paramagnetic beads. The integrity of up to 1,000 individual DNAs can be monitored by visualizing the microbeads under darkfield imaging using a wide-field, low magnification objective. Injecting of a restriction endonuclease, NdeI, initiates the cleavage reaction. Video microscopy is used to record the exact moment of each DNA cleavage by observing the frame in which the associated bead moves up and out of the focal plane of the objective. Frame-by-frame bead counting quantifies the reaction, and an exponential fit determines the reaction rate. This method allows collection of quantitative and statistically significant data on single molecule SSDC reactions in a single experiment.

A highly parallel method for measuring the site-specific cleavage of DNA at the single molecule level is described. This protocol demonstrates the technique using the restriction endonuclease NdeI. The method can easily be modified to study any process that results in site-specific DNA cleavage.

Paralleler Hochdurchsatz-Single Molecule Kinetic Assay für standortspezifische DNA-Spaltung

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, host characteristics, and broader ecosystem functions. With this rapid increase in breadth and depth of sequencing capabilities have come methods to extract, amplify, analyze, and interpret environmental DNA successfully with maximum efficiency. Unfortunately, performing DNA extractions quickly can come at the cost of increasing the risk of contamination among samples. In particular, high-throughput extractions that are based on samples contained in a 96-well plate offer a relatively quick method, compared to single-tube extractions, but also increase opportunities for well-to-well cross-contamination. To minimize the risk of cross-contamination among samples, while retaining the benefits of high-throughput extraction techniques, we developed a new method for loading environmental samples into 96-well plates. We used pierceable PCR sealing films to cover each plate while loading samples and added samples first to PCR tubes before moving them into wells; together, these practices reduce the risk of sample drift and unintended double loading of wells. The method outlined in this paper provides researchers with an approach to maximize available high-throughput extraction techniques while reducing the risk of cross-contamination inherent to 96-well plates. We provide a detailed step by step outline of how to move from sample collection to DNA extraction while minimizing the risk of unwanted cross-contamination.

Current methods for loading 96-well plates for DNA extractions can be prone to contamination. We detail a new method for loading 96-well plates that reduces risk of cross-contamination among wells. Our method will help other researchers capitalize on the efficiency of high-throughput DNA extraction techniques and minimize risk of contamination.

Modifizierte Methoden zum Laden von DNA-Extraktionsplatten mit hohem Durchsatz reduzieren das Kontaminationspotenzial

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...