Wir sind dankbar für die Unterstützung aus dem NIH (Award-Nummern R00 NS072192 um MKL, HD029178 um AS.L. und 2 RO1 NS032457 um CAW). MKL ist der Empfänger von der Kinderklinik Boston Career Development Fellowship / Harvard Medical School Shore Fellowship und Fellow der Alfred P. Sloan Foundation. CAW ist ein Investigator des Howard Hughes Medical Institute.

Ein. Embryo Isolation / der Zubereitung Diese Technik kann für Maus oder Ratte verwendet werden. In diesem Protokoll demonstrieren wir die CSF Sammlung Technik und zerebralen Kortex Explantat Dissektion mit embryonalen Gehirn. Wir werden auf alle wichtige Unterschiede für Ratten im Vergleich zu Mäusen, die im Rahmen der allgemeinen Techniken existieren kommentieren. Für die embryonalen Alter Staging-System, ist E1 als der Tag des Steckers für Ratten klassifiziert und E0.5 wird als Tag des Steckers für Mäuse eingestuft. <ol><li> Bereiten Sie eine Mikrodissektion Gericht mit Sylgard Silikon-Elastomer. Sylgard 184 Silikon-Elastomer wird als zweiteilige flüssige Komponente, Teil A und Teil B. Teil A und Teil B in einem Verhältnis von 10:1 nach Gewicht oder Volumen gemischt werden mitgeliefert. Nachdem die Flüssigkeitskomponenten gemischt werden, gießen die Sylgard Elastomers in einer Petrischale, die gesamte Oberfläche der Schale abzudecken. Einige Luftblasen vorliegen können, die während der Aushärtung zu zerstreuen werden. Legen Sie die Petrischale Deckel auf und lassen Sie die Elastomereer zu heilen. Das Elastomer kann bei Raumtemperatur für 24 Stunden gehärtet werden, oder bei höheren Temperaturen (zB 37 ° C) für eine schnellere Aushärtung. Sobald die flüssigen Bestandteile zu verfestigen, ist die Dissektion Gericht einsatzbereit. Die Schale kann wiederholt für mehrere Experimente verwendet werden, vorausgesetzt, es wird auch nach der Verfahrensweise gereinigt. </li><li> Herstellung der Mikrokapillare Pipette (Nadel). Micro-Kapillar-Pipetten werden durch Anwendung von Hitze zubereitet und ziehen mit einem Narishige PC-10 vertikale Feinpipettenziehvorrichtung mit den folgenden Einstellungen: Ein Schritt Pull; Heater # 2 auf 58, 100 g Abzugsgewicht. Die feine Spitze der Mikropipette wird sorgfältig off mit feinen Nr. 55 Zangen gerissen. Die resultierende durchschnittliche Innendurchmesser der Nadel 85 um. </li><li> Bereiten Sie den Sauger Baugruppe für CSF Aspiration. Legen Mikro-Stempel versehen mit Mikro-Kapillaren in die Kapillare Nadel. Alternativ beifügen Kunststoff-Einweg-Filter am Ende der Saugvorrichtung Tubusbaugruppe, die t verbunden isto die Mikrokapillare Pipette. Schieben der Nadel durch die Dichtung in Position am gegenüberliegenden Ende des Aspirators Montage. </li><li> Übertragen Embryo isoliert von der Streu zu einer Mikrodissektion Schale mit Sylgard hergestellt. </li><li> Entfernen Sie die extra-embryonalen Membranen und Geweben, so dass der Embryo deutlich ausgesetzt ist. Jedes Gewebe Schicht zuerst die Gebärmutterwand und dann die decidua-kann seziert mit feinen Iridektomie Schere (dh Fine Science Tools # 15000-02) werden. An jedem Implantationsstelle zunächst der Gebärmutterwand, dann die decidua kann parallel zu der langen Achse des Uterus eingeschnitten werden soll, und der Schnitt kann dann weiter geöffnet werden mit feinen Pinzetten. Die Decidua kann nach einem ähnlichen Schnitt entfernt werden, Freilegung der Fruchtblase. Vorsicht ist geboten, so dass die Fruchtblase nicht eingeschnitten oder durchstochen werden. </li><li> Waschen mit steriler Hanks balanced salt solution (HBSS) und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus dem umliegenden Embryos mit einer Pipette sowie einen Kimwipe oder FilterPapier geschnitten in Dreiecke. </li></ol> 2. Ventrikelliquor Sammlung <ol><li> Visualisieren Embryo unter dem Dissektionsmikroskop: für Maus, der Embryo sollte auf seiner Seite vorgesehenen Ablagefläche ist, so dass man eine sagittale Ansicht des sich entwickelnden Embryos aufweist. Mit Rattenembryonen E16 oder älteren, Positionieren des Embryos auf seiner dorsalen Wirbelsäule entlang seiner längsten planaren Dimension von einer kranial nach kaudal Richtung, als wenn der Embryo auf dem Rücken liegt. Auf diese Weise kann der Liquor von beiden rechten und linken lateralen Ventrikel gesammelt werden. </li><li> Kontinuierlich einsetzen Mikrokapillare Pipette in den lateralen Ventrikel, mesencephalicus Herzkammer oder cisterna magna, versucht nicht, die Neuroepithelzellen kontaktieren, sobald der Pipette eingesetzt ist. Für E14.5 Maus-Embryonen oder älter, kann der Liquor aus der rechten Herzkammer abgesaugt werden und anschließend die Nadel entnommen und in den linken Ventrikel. Wegen der Durchgängigkeit der Ventrikel und dem Neuralrohr in Embryonen jünger als E14.5, diegesamte CSF Lautstärke kann oft aus der Seitenventrikel mit einem einzigen Nadeleinführung abgesaugt werden. Dies ist jedoch nicht immer der Fall, da Zeiten und Entwicklungsstörungen Durchgängigkeit der Verbindung Ventrikel leicht variieren kann, und daher kann die Mikrokapillare Pipette kann auch in die Zisterne magna eingefügt werden, um die maximale Volumen CSF sammeln. </li><li> Sobald die Mikrokapillare Pipette in den lateralen Ventrikel, mesencephalicus Herzkammer oder cisterna magna eingesetzt ist, sorgfältig und schonend beginnt Ansaugen der CSF in die Pipette, wobei entweder die Mikro-Kolben einen Unterdruck erzeugen und saugt den CSF, oder durch Bereitstellen eines sanften Unterdruck durch den Mund, so dass CSF sanft in die Mikro-Kapillarpipette in einem langsamen und kontrollierten Art und Weise zu fließen beginnt erstellt. Wir empfehlen, dass der Betrachter mit ihren eigenen lokalen Beamten in Bezug auf institutionelle Politik auf diesen Ansätzen überprüft. </li><li> Weiterhin negativen Druck auszuüben und sammeln die CSF in der Mikro-Kapillarpipette.In beiden Maus und Ratte Embryonen von E16.5/E17 oder jünger ist es möglich, den Ventrikel Zusammenbruch leicht beobachten durch das Auftreten eines Divot Bilden, auf der Seite des Kopfes, dass die Mikro-Kapillarpipette in. ist In älteren Embryonen, wegen der größeren Größe des Gehirns, kann es nicht möglich sein, den Kopf zu beobachten kollabieren. </li><li> Stoppen Sie Druck und entfernen Sie vorsichtig die Mikrokapillare Pipette aus der Seitenventrikel. </li><li> Gently Vertreibung der CSF Probe in ein Eppendorf-Röhrchen auf Eis wurde gekühlt. </li><li> Sammeln Sie weiter die CSF aus einem ganzen Wurf von Tieren und bündeln die Proben in das gleiche Rohr. </li><li> Zentrifugieren bei 10000 × g bei 4 ° C für 10 min, um alle kontaminierenden Zellen zu entfernen. </li><li> Analyse der Proben auf Anzeichen von kontaminierenden Neuroepithelzellen oder roten Blutzellen. Anzeichen von Verunreinigungen werden in der Regel durch das Fluid auftretenden trüb oder rot / rosa, oder die Anwesenheit eines Pellets mit einem Blut gefärbte Fleck angedeutet. Nach Zentrifugation der CSF kann mikroskopisch auf Anzeichen von Zellen oder Zelltrümmer analysiert werden. Bei Anzeichen von Verunreinigungen sind die Flüssigkeit sollte verworfen werden. Als zusätzliche Kontrolle kann das Pellet Inhalt auch für Zellen gefärbt werden. Ein sauberer CSF-Probe kann für eine Zellkultur, kortikale Kultur, Spektrometrie, Western-Blot, ELISA, und andere Assays verwendet werden. Die klare CSF sollte ein neues steriles Eppendorf-Röhrchen überführt werden. Die Probe kann nun zur Analyse verwendet werden, mit anderen gepoolten Proben oder Schnappverbindung mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C. Das Einfrieren und Auftauen von kleinen Proben von Fluid kann in einem kleinen Volumen Abnahme und Veränderungen in Proteinkonzentration führen. Dies kann durch Gefriertrocknen die Proben vermieden werden. </li></ol> 3. Kortikale Explantation Dissection <ol><li> Übertragen Sie die E14.5 Embryos aus dem Wurf auf eine Mikrodissektion Gericht mit Sylgard vorbereitet isoliert. </li><li> Entfernen Embryo aus extra-embryonalen Membranen und Geweben wie in Schritt 1.5 beschrieben. </li> &lt;li&gt; Wash mit steriler Hanks balanced salt solution (HBSS) und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus dem umliegenden Embryos mit einer Pipette. </li><li> Sezieren durch den Halsbereich Abtrennen des Kopfes von dem Rest des Embryos (Abb. 1A). </li><li> Mit einem feinen Skalpell (Augenheilkunde Messer), reduzieren die Mittellinie der Kopfhaut. Fassen Sie jede Seite diesen Einschnitt mit feinen Pinzetten und entfernen Sie die Haut. Als Nächstes verwenden Iridektomie Schere einen Einschnitt, der die Länge der Mittellinie der Entwicklungsländer Schädels verläuft machen. Anschließend stellen zwei weitere Einschnitte, etwa 1/3 des Abstands von der vorderen und hinteren Enden der Entwicklungswalze Schädel. Verwenden feinen Pinzette, um die &quot;Klappen&quot; des Schädels zu begreifen, die sich aus diesem Teil der Dissektion, und entfernen Sie die Entwicklung von Schädel Gewebe, Aussetzen des Kortex (Abbildung 1B). </li><li> Mit dem Skalpell bisect das Gehirn entlang der Mittellinie in der Mitte der Sagittalebene, die Trennung der rechten und linken kortikalen Hemisphären (Figures1B, C). Die Pia und Arachnoidea sind links an dem Cortex und die Dura wird zusammen mit der Entwicklung von Schädel entfernt. </li><li> Bereiten Sie jede kortikale Hemisphäre getrennt. Legen Sie die Hemisphäre medialen Seite nach oben, so dass Sie die Ganglien Eminenz und die Entwicklung von Cortex (1C, D) zu sehen. </li><li> Mit dem Skalpell einen koronalen Schnitt durch die kortikalen Neuroepithel kaudal der Entwicklung Riechkolben. Dieser Schnitt sollte am vorderen Rand der lateralen und medialen ganglionären Eminenzen beginnen, und erstrecken sich durch den vorderen Bereich des cingulären entwickeln kortikalen Rudiment (1E). </li><li> Machen Sie eine weitere koronalen Schnitt nur kaudal der hintere Begrenzung der seitlichen ganglionic eminence (1F). Dieser Einschnitt sollte auch von der seitlichen Begrenzung des ganglionären Eminentia erstrecken zur medialen Wand der Entwicklungseinheit kortikalen Rudiment. </li><li> Ziehen Sie den kortikalen &quot;Klappe&quot; created durch die beiden Einschnitte in den Schritten 3.7 und 3.8 hergestellt, ein Skalpell oder leichten Druck aus einem Strom von HBSS mit 200 ul Pipettors geliefert an eine mechanische Beschädigung der Hirnrinde zu vermeiden. Dann machen Sie einen Quer-Schnitt entlang der Grenze zwischen den seitlichen ganglionic Eminenz aus den Entwicklungsländern Kortex (Figuren 1G, H). Dann sezieren entfernt die Entwicklungsländer Hippocampus und Kortex Saum des medialen Telencephalon, an der Spitze des Neokortex, wo die seitliche kortikale Oberfläche trifft interhemisphärischen Wand. </li><li> Machen Sie einen Quer-Schnitt entlang der Grenze zwischen den seitlichen ganglionic Eminenz aus den Entwicklungsländern Kortex (Abb. 1H). </li><li> Entfernen Sie zusätzliche seziert Gewebe, das auf der Sylgard Platte aus dem seziert kortikalen Explantat ist. Man kann vorsichtiges Pipettieren mit frischem HBSS-Puffer verwenden, um pipettieren entfernt alle persönlichen seziert Gewebe. Die seziert Kortex ist jetzt mit meningealen Seite nach unten (Abb. 1I). </li></ol><ol><li> Bereiten Sie einen Platindraht Schleife mit einer Glaspipette. Erwärmen der Glaspipette mit einem gefalteten Platindraht am Ende der Glaspipette eingefügt. Durch Verdrehen des Endes der Platindraht Schleife kann die Größe der Schleife erhöht oder verringert werden, und die Schleife geformt sein, um die Größe des gewünschten Explantat zu passen. (Dies kann vorbereitet und wiederverwendet werden.) </li><li> Erwärmen des Endes des Platindraht, um die Schleife zu sterilisieren. </li><li> Isolieren Sie die seziert kortikalen Explantat und entfernen Sie die zusätzlichen HBSS Medien durch vorsichtiges Pipettieren, so dass eine kleine Menge mit der Drahtschlinge verwenden. </li><li> Legen Sie eine 1 cm Polycarbonat Membran in einer 4 cm Durchmesser Bildgebung Gericht. </li><li> Mit der Seite des Platin Drahtschlinge vorsichtig kippen die Rinde, so dass die meningealen Seite nach oben zeigt. </li><li> Heben die kortikale Explantat vor der Dissektion Schale, indem das Explantat in der Mitte der Schleife und Verwendung der intrinsischen hydrostatischen KräfteHeben Sie das Explantat auf einer ebenen Fläche. </li><li> Sanft platzieren das Explantat auf dem Polycarbonat-Membran, und heben den Platindraht Schleife entfernt, so dass das Explantat auf der Membran auf eine flache Ebene mit der ventrikuläre Oberfläche in Kontakt mit Membran bleibt. </li><li> Heben Sie die Membran und pipettieren 50 ul CSF oder andere Medien unter der Membran. </li><li> Bedecken Sie den Imaging-Teller, legen Sie sie in einem befeuchteten zweiten Behälter, und bei 37 ° C in 5% CO 2 für 24 Stunden, um weitere Zellproliferation und Explantat Wachstum zu unterstützen. Abbildung 2 zeigt eine schematische Darstellung des endgültigen kortikalen Explantat Gericht Vorbereitung. </li></ol>

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	<li>Dziegielewska, K. M., Evans, C. A., Lai, P. C., Lorscheider, F. L., Malinowska, D. H., Mollgard, K., Saunders, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+in+cerebrospinal+fluid+and+plasma+of+fetal+rats+during+development.">Proteins in cerebrospinal fluid and plasma of fetal rats during development.</a> Developmental Biology. 83 (1), 193-200 (1981).</li><li>Gato, A., Martin, P., Alonso, M. I., Martin, C., Pulgar, M. A., Moro, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cerebro-spinal+fluid+protein+composition+in+early+developmental+stages+in+chick+embryos.">Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos.</a> Journal of Experimental Zoology. Part A, Comparative Experimental Biology. 301 (4), 280-289 (2004).</li><li>Gato, A., Moro, J. A., Alonso, M. I., Bueno, D., Mano, D. L., Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+cerebrospinal+fluid+regulates+neuroepithelial+survival,+proliferation,+and+neurogenesis+in+chick+embryos.">Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos.</a> The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 284 (1), 475-484 (2005).</li><li>Parada, C., Gato, A., Aparicio, M., Bueno, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+chick+embryonic+cerebrospinal+fluid.">Proteome analysis of chick embryonic cerebrospinal fluid.</a> Proteomics. 6 (1), 312-320 (2006).</li><li>Parada, C., Gato, A., Bueno, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+embryonic+cerebrospinal+fluid+proteome+has+greater+apolipoprotein+and+enzyme+pattern+complexity+than+the+avian+proteome.">Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome.</a> Journal of Proteome Research. 4 (6), 2420-2428 (2005).</li><li>Zappaterra, M. D., Lisgo, S. N., Lindsay, S., Gygi, S. P., Walsh, C. A., Ballif, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+proteomic+analysis+of+human+and+rat+embryonic+cerebrospinal+fluid.">A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid.</a> Journal of Proteome Research. 6 (9), 3537-3548 (2007).</li><li>Desmond, M. E., Jacobson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+brain+enlargement+requires+cerebrospinal+fluid+pressure.">Embryonic brain enlargement requires cerebrospinal fluid pressure.</a> Developmental Biology. 57 (1), 188-198 (1977).</li><li>Lehtinen, M. K., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+at+the+brain-cerebrospinal+fluid+interface.">Neurogenesis at the brain-cerebrospinal fluid interface.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 653-679 (2011).</li><li>Lehtinen, M. K., Zappaterra, M. W., Chen, X., Yang, Y. J., Hill, A. D., Lun, M., Maynard, T., Gonzalez, D., Kim, S., Ye, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid+provides+a+proliferative+niche+for+neural+progenitor+cells.">The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells.</a> Neuron. 69 (5), 893-905 (2011).</li><li>Martin, C., Alonso, M. I., Santiago, C., Moro, J. A., De la Mano, A., Carretero, R., Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryonic+brain+development+in+rats+requires+the+trophic+influence+of+cerebrospinal+fluid.">Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid.</a> International Journal of Developmental Neuroscience: The Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 27 (7), 733-7340 (2009).</li><li>Martin, C., Bueno, D., Alonso, M. I., Moro, J. A., Callejo, S., Parada, C., Martin, P., Carnicero, E., Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF2+plays+a+key+role+in+embryonic+cerebrospinal+fluid+trophic+properties+over+chick+embryo+neuroepithelial+stem+cells.">FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells.</a> Developmental Biology. 297 (2), 402-416 (2006).</li><li>Zappaterra, M. W., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid:+regulator+of+neurogenesis,+behavior,+and+beyond.">The cerebrospinal fluid: regulator of neurogenesis, behavior, and beyond.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 69 (17), 2863-2878 (2012).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Das beschriebene Verfahren zur Ventrikelliquor Kollektion relativ reine Proben von embryonalen CSF mit stabilen Protein-Zusammensetzung und konsequente Aktivität in einer Reihe von zellulären Assays 9 ergab. Mit einer guten Sammlung Technik und Wurfgröße von zehn E14.5 Mäusen, kann man erwarten, 10-15 ul CSF zu sammeln und aus einem Wurf von E16 Ratten, kann man erwarten, dass etwa 50-90 ul CSF sammeln. Diese Sammlung Technik minimiert Kontamination von Blut und Gewebe, durch sorgfältige Beobachtung, Ze...

Das GFK ist eine komplexe Flüssigkeit, die die Entwicklung Neuroepithel 1-6 badet und liefert wesentliche Druck 7 und wachstumsfördernde Signale für das sich entwickelnde Gehirn 8-12. Die CSF im Laufe der Entwicklung des Gehirns zu untersuchen, haben wir Techniken Ventrikelliquor aus Entwicklungs Ratte oder Maus-Embryonen isolieren während verschiedenen Stadien der Entwicklung 6,9. Bisherige Methoden der Isolation aufgenommen mit einem Glas Mikro-Nadel und Isolierung der CSF mit einem Mikro-Injektor 1,2. Unsere Methode nutzt ein Glas Mikro-Kapillarpipette deren Spitze wurde gezogen, um eine ultrafeine für verbesserte Eindringen in das Gewebe zu schaffen. Das Glas Mikrokapillare Pipette ist an ein Sauggebläse angeschlossen, so dass Ventrikelliquor Sammlung unter leichtem Druckänderungen gesteuert werden kann. Um die Stammzellen Einflüsse von CSF-Signale zu untersuchen, zerlegen wir zerebralen kortikalen Explantaten, legen Sie sie auf Polycarbonat Membranen und schweben sie über geeignete culture Medium mit CSF Proben 9 ergänzt. Mit dieser Technik sind geringere Mengen von Medien ausreichend ist, um das Gewebe Kultur, so dass für eine effiziente Verwendung von CSF 9.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Wiretrop II Kapillarnadeln </td><td> Drummond Scientific </td><td> # 5-000-2020 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Ellsworth Adhesives </td><td> Nr. 184 SIL ELAST Kit </td><td></td></tr><tr><td> Aspirator Tubusbaugruppe </td><td> Sigma </td><td> # A5177-5EA </td><td></td></tr><tr><td> Einwegfilter </td><td> Venturi oder örtlichen Apotheke </td><td> nicht verfügbar </td><td> Standard Zigarettenfilter </td></tr><tr><td> Roundstock opthalmic Messer (15 Grad stab Messer) </td><td> World Precision Instruments, Inc. </td><td> # 500250 </td><td></td></tr><tr><td> 35mm Glasboden Kulturschale </td><td> MatTek Corp </td><td> # P35G-1.5-14-C </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Platin-Iridium-Draht </td><td> Tritech Forschung </td><td> # PT-9010-010-3FT </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Track-Etch Membrane </td><td> Whatman </td><td> # 09-300-57 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Solution </td><td> Fisher Scientific </td><td> # SH30031.FS </td><td></td></tr><tr><td> Iridektomie Scissors </td><td> Fine Science Tools </td><td> # 15000-02 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of cerebrospinal fluid from rodent embryos for use with dissected cerebral cortical explants

Das GFK ist eine komplexe Flüssigkeit mit einer sich dynamisch ändernden Proteom während der Entwicklung und im Erwachsenenalter. Während der embryonalen Entwicklung unterscheidet der naszierenden CSF aus dem Fruchtwasser bei Schließen des vorderen Neuralrohr. CSF Volumen steigt dann über den folgenden Tagen als neuroepithelialen Vorläuferzellen entlang der Herzkammern und die Plexus generate CSF. Die embryonalen CSF Kontakte der apikale, ventrikuläre Oberfläche der neuralen Stammzellen des sich entwickelnden Gehirns und des Rückenmarks. CSF bietet entscheidende Flüssigkeitsdruck für den Ausbau des sich entwickelnden Gehirns und vertreibt wichtige wachstumsfördernde Faktoren auf neurale Vorläuferzellen in einem zeitlich-spezifische Weise. Um die Funktion der CSF zu untersuchen, ist es wichtig, reine Proben von embryonalen CSF ohne Kontamination aus Blut oder der Entwicklungswalze telencephalen Gewebe isolieren. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um relativ reine Proben von ventrikulären embryonalen CSF, die verwendet werden kann für isoliereneine Vielzahl von experimentellen Untersuchungen, wie Massenspektrometrie, Protein-Elektrophorese und der Zelle und primären Explantatkultur. Wir zeigen, wie zu sezieren und Kultur kortikalen Explantate auf porösen Polycarbonatmembranen um die Entwicklung kortikalen Gewebe mit reduzierten Volumina von Medien oder CSF wachsen. Mit diesem Verfahren kann unter Verwendung von Experimenten CSF aus unterschiedlichen Alters oder Bedingungen, um die biologische Aktivität des CSF Proteom auf Zielzellen zu untersuchen.

Die CSF Sammlung sollte ergeben einen klaren, transparenten Flüssigkeit. Es sollte keine Anzeichen von Kontamination aus Blut sein, wie durch einen rot oder gelb gefärbten Flüssigkeit in der Ansaug und in der Eppendorf-Röhrchen nachgewiesen. Es sollte auch keine Hinweise auf Gewebe in dem Aspirat und Eppendorf Rohr sein. Wenn der CSF zentrifugiert wird, kann man auch die für das CSF mikroskopisch um sicherzustellen, dass es keine Kontamination. Bei Anzeichen von Verunreinigungen sind, sollte die CSF verworfen werde...

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Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Kammerunterstützungsgerät Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) taucht die neuroepithelialen und zerebralen Kortex Vorläuferzellen während der frühen Entwicklung des Gehirns im Embryo. Hier beschreiben wir die Methode entwickelt, um ventrikuläre CSF aus Nagetier Embryonen unterschiedlichen Alters zu isolieren, um seine biologische Funktion untersucht. Darüber hinaus zeigen wir unsere zerebralen Kortex Explantat Dissektion und Kultur Technik, die für Explantat Wachstum ermöglicht mit minimalem Volumen von Kulturmedium oder CSF.

Isolierung von Liquor aus Rodent Embryonen für die Verwendung mit Dissected Cerebral Kortikale Explantate

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

22.8K Aufrufe.  VA Greater Los Angeles Healthcare System. Kammerunterstützungsgerät Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) taucht die neuroepithelialen und zerebralen Kortex Vorläuferzellen während der frühen Entwicklung des Gehirns im Embryo. Hier beschreiben wir die Methode entwickelt, um ventrikuläre CSF aus Nagetier Embryonen unterschiedlichen Alters zu isolieren, um seine biologische Funktion untersucht. Darüber hinaus zeigen wir unsere zerebralen Kortex Explantat Dissektion und Kultur Technik, die für Explantat Wachstum e...

Serie: Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and associated extracellular matrix. Because they provide a suitable organotypic environment, cortical slice explants are often used to investigate those interactions that control neuronal differentiation and development. Although beneficial, the slice explant model can suffer from drawbacks including aberrant cellular lamination and migration. Here we report a whole cerebral hemisphere explant system for studies of early cortical development that is easier to prepare than cortical slices and shows consistent organotypic migration and lamination. In this model system, early lamination and migration patterns proceed normally for a period of two days in vitro, including the period of preplate splitting, during which prospective cortical layer six forms. We then developed an ex utero electroporation (EUEP) approach that achieves ~80% success in targeting GFP expression to neurons developing in the dorsal medial cortex.
The whole hemisphere explant model makes early cortical development accessible for electroporation, pharmacological intervention and live imaging approaches. This method avoids the survival surgery required of in utero electroporation (IUEP) approaches while improving both transfection and areal targeting consistency. This method will facilitate experimental studies of neuronal proliferation, migration and differentiation.

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

This protocol describes an improved explant procedure that involves ex utero electroporation, dissection and culture of entire cerebral hemispheres from the embryonic mouse. The preparation facilitates pharmacological studies and assays of gene function during early cortical development.

Ex utero Elektroporation und Whole Hemisphäre Explantate: A Simple Experimentelle Methode für Studien der frühen kortikalen Entwicklung

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

Isolation und Kultur der Dissoziierte sensorischen Neuronen aus Hühnerembryonen

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed method based on molecular weight cut-off (MWCO) filtration and mass spectrometric analysis was combined with an offline high-pH reverse phase HPLC pre-fractionation step.
Secretion into CSF is the main pathway for removal of molecules shed by cells of the central nervous system. Thus, many processes in the central nervous system are reflected in the CSF, rendering it a valuable diagnostic fluid. CSF has a complex composition, containing proteins that span a concentration range of 8 - 9 orders of magnitude. Besides proteins, previous studies have also demonstrated the presence of a large number of endogenous peptides. While less extensively studied than proteins, these may also hold potential interest as biomarkers.
Endogenous peptides were separated from the CSF protein content through MWCO filtration. By removing a majority of the protein content from the sample, it is possible to increase the sample volume studied and thereby also the total amount of the endogenous peptides. The complexity of the filtrated peptide mixture was addressed by including a reverse phase (RP) HPLC pre-fractionation step at alkaline pH prior to LC-MS analysis. The fractionation was combined with a simple concatenation scheme where 60 fractions were pooled into 12, analysis time consumption could thereby be reduced while still largely avoiding co-elution.
Automated peptide identification was performed by using three different peptide/protein identification software programs and subsequently combining the results. The different programs were complementary rather than comparable with less than 15% of the identifications overlapped between the three.

A method for mass spectrometric analysis of endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF) is presented. By employing molecular weight cut-off filtration, chromatographic pre-fractionation, mass spectrometric analysis and a subsequent combination of peptide identification strategies, it was possible to expand the known CSF peptidome nearly ten-fold compared to previous studies.

Probenvorbereitung für die Endopeptidomic Analyse im menschlichen Liquor cerebrospinalis

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central nervous system and thus, can be used to analyze the diseased state of the brain or spinal cord without directly accessing these tissues. However, in mice it is difficult to obtain from the cisterna magna due to its closeness to blood vessels, which often contaminate samples. The area for CSF collection in mice is also difficult to dissect to and often only small samples are obtained (maximum of 5-7 &#181;L or less). This protocol describes in detail a technique that improves on current methods of collection to minimize contamination from blood and allow for the abundant collection of CSF (on average 10-15 &#181;L can be collected). This technique can be used with other dissection methods for tissue collection from mice, as it does not impact any tissues during CSF extraction. Thus, the brain and spinal cord are not affected with this technique and remain intact. With greater CSF sample collection and purity, more analyses can be used with this fluid to further aid neuroscience research and better understand diseases affecting the brain and spinal cord.

This protocol describes an improved technique for the abundant collection of cerebrospinal fluid (CSF) with no contamination from blood. With greater sample collection and purity, more analyses can be performed using CSF to further our understanding of diseases that affect the brain and spinal cord.

Ein verbessertes Verfahren zur Sammlung von Liquor cerebrospinalis aus narkotisierten Mäuse

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

Isolierung der zerebralen Kapillaren aus frischem menschlichen Hirngewebe

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and death, caused by white matter lesions in the spinal cord and cerebellum, as well as by demyelination in grey matter. Whilst conventional models of experimental allergic encephalomyelitis are suitable for the investigation of the cell-mediated inflammation in the spinal and cerebellar white matter, they fail to address grey matter pathologies. Here, we present the experimental protocol for a novel rat model of cortical demyelination allowing the investigation of the pathological and molecular mechanisms leading to cortical lesions. The demyelination is induced by an immunization with low-dose myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) in an incomplete Freund&#39;s adjuvant followed by a catheter-mediated intracerebral delivery of pro-inflammatory cytokines. The catheter, moreover, enables multiple rounds of demyelination without causing injection-induced trauma, as well as the intracerebral delivery of potential therapeutic drugs undergoing a preclinical investigation. The method is also ethically favorable as animal pain and distress or disability are controlled and relatively minimal. The expected timeframe for the implementation of the entire protocol is around 8 - 10 weeks.

The protocol presented here allows the reproduction of a widespread grey matter demyelination of both cortical hemispheres in adult male Dark Agouti rats. The method comprises of intracerebral implantation of a catheter, subclinical immunization against myelin oligodendrocyte glycoprotein, and intracerebral injection of a pro-inflammatory cytokine mixture through the implanted catheter.

Rattenmodell der weit verbreiteten zerebralen kortikalen Demyelinisierung, induziert durch eine intrazerebrale Injektion von entzündungsfördernden Zytokinen

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

Auswirkungen der Explosion-induzierte Neurotrauma auf Druck Nagetier mittlerer Hirnarterien

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) have enabled in vivo quantification of CSF flow but they are limited by reduced imaging volumes and low spatial resolution, respectively. Recent work has found that CSF enters the brain parenchyma through a network of perivascular spaces surrounding the pial and penetrating arteries of the rodent cortex. This perivascular entry of CSF is a primary driver of the glymphatic system, a pathway implicated in the clearance of toxic metabolic solutes (e.g., amyloid-&#946;). Here, we illustrate a new macroscopic imaging technique that allows real-time, mesoscopic imaging of fluorescent CSF tracers through the intact skull of live mice. This minimally-invasive method facilitates a multitude of experimental designs and enables single or repeated testing of CSF dynamics. Macroscopes have high spatial and temporal resolution and their large gantry and working distance allow for imaging while performing tasks on behavioral devices. This imaging approach has been validated using two-photon imaging and fluorescence measurements obtained from this technique strongly correlate with ex vivo fluorescence and quantification of radio-labeled tracers. In this protocol, we describe how transcranial macroscopic imaging can be used to evaluate glymphatic transport in live mice, offering an accessible alternative to more costly imaging modalities.

Transcranial optical imaging allows wide-field imaging of cerebrospinal fluid transport in the cortex of live mice through an intact skull.

In Vivo Imaging von Cerebrospinalfluid Transport durch den intakten Mausschädel mittels Fluoreszenz-Makroskopie

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Chinesische Massagetechniken: Verbesserung der motorischen Funktion bei Ratten mit Zerebralparese

Abdominal Massage to Improve Motor Dysfunction in Rats with Cerebral Palsy

Cerebral palsy (CP) is a disease with a high disability rate and morbidity. The clinical symptoms of cerebral palsy are motor dysfunction and abnormal posture development, often accompanied by cognitive impairment. Massage, a traditional Chinese Medicine therapy, can coordinate Zang and Fu, regulate Qi and blood, make the viscera work more smoothly, and calm Yin and Yang. Furthermore, it has been an effective method for CP in clinical. This paper summarizes a set of simple and standardized manipulations of massage for young rats with CP, which is easy to follow. The procedure follows: first, massage of four limb acupoints, including Quchi (LI11) and Zusanli (ST36); second, massage of the abdomen acupoints Zhongwan (RN12), Tianshu (ST25), Guanyuan (CV4), and Qihai (CV6); and finally, massage of the abdomen of the rats. This set of massage methods considerably improved the motor function of young rats with CP and is simple, standardized, and easy to follow. We adapted this set of manipulation methods in animal models to promote the internationalization and standardization of massage.

Autor im Rampenlicht: Erforschung des Potenzials der Massagetherapie bei Zerebralparese anhand von Tiermodellen 

Here, we present a set of massage manipulations in the rat model of cerebral palsy that can considerably improve the motor function of cerebral palsy rats.

Bauchmassage zur Verbesserung der motorischen Dysfunktion bei Ratten mit Zerebralparese

Cerebral palsy (CP) is a disease with a high disability rate and morbidity. The clinical symptoms of cerebral palsy are motor dysfunction and abnormal ...