Diese Arbeit wurde Zuschüsse aus NINDS (NS066071) und der NIAAA unterstützt. (P50AA017823) an ECO. Die Autoren danken Dr. Robert Quinn und das Personal in der Abteilung für Versuchstierkunde Ressourcen für Tierpflege. Wir danken Judson Belmont für den technischen Support, Nicole Belletier für die Unterstützung als Sommer Undergraduate Research Fellow (SURF). Wir danken auch Dr. David Cameron für Kommentare und Änderungen auf eine frühere Version des Manuskripts.

1. Ex utero Elektroporationen mit Green Fluorescent Protein Expression Plasmid <ol><li> Plasmid-DNA werden mit Injektionslösungen CAG-eGFP DNA 27 verdünnt, um die endgültige Arbeitskonzentration von 0,33 mg / ml in ddH 2 O zubereitet Endo-Free Qiagen Maxi-Präparationen verwendet werden, um das Plasmid aus den transformierten Bakterien zu reinigen. Schnelle grünen Farbstoff bei ~ 0,02% (w / v endgültige) mit der DNA-Lösung als Injektion Tracer zugegeben. </li><li> Um den OP-Bereich vorzubereiten, abspritzen Labor-und Binokular Bühne mit einer 70% igen Ethanol-Lösung und trocken wischen. Sprühen chirurgische Scheren und Zangen mit 70% Ethanol vor Dissektion und trocken wischen. </li><li> Timed Schwangere Swiss / Webster Dämme auf E13 durch Überführung in eine Kammer mit CO 2 aus einer Druckflasche gefüllt und der Damm wird überwacht geopfert, bis alle Bewegung für mindestens 1 min gestoppt wurde. Nach der Tötung durch CO 2-Inhalation werden die Embryonen aus dem Uterus entfernt und ineine 10 cm Petrischale mit eiskaltem Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS). </li><li> Sorgfältig sezieren jeden Embryo aus den umliegenden extraembryonalen Membranen und halten in eiskaltem HBSS. </li><li> Übertragen jedes Embryo einzeln mit einem zweiten 10 cm Petrischale mit kaltem HBSS. Verwenden einer Hamilton-Spritze auf 2-3 ul der DNA schnell Grünmischung in den Ventrikel des linken Großhirnhemisphäre injizieren, wobei darauf zu in einer kortikalen Bereich räumlich getrennt von dem kortikalen Bereich für zukünftige Analysen injizieren. </li><li> Um elektroporieren, halten den Embryo vorsichtig mit Pinzette und leicht zu platzieren die positive Paddel des Pinzette Elektrode auf der dorsalen Mittellinie des Kopfes zu platzieren und leicht die negative Paddel unterhalb des Embryos Kinn. Elektroporationen mit einem BTX830 Elektroporator programmiert zu fünf 30 V Impulse von 50 ms Dauer von 950 ms Intervalle getrennt liefern erreicht. Diese Einstellungen sind für die BTX830 Modell. Andere Systeme können nach Herstellerangaben instructio verwendet werdenns. </li></ol> 2. Whole Hemisphäre Explantatherstellung <ol><li> Nach der Elektroporation werden die Embryonen wieder in eiskaltem HBSS platziert. Das Gehirn wird entfernt, indem zwei # 5 Juwelier Zange, um die Haut und knorpeligen Schädels aus dem Embryo Kopf zu entfernen. Eine Pinzette wird dann rutschte unterhalb des Gehirns, um das intakte Gehirn aus dem Schädel zu entfernen. Das elektroporierte Halbkugel (links) wird dann von dem Gehirn seziert und die angeschlossenen mittleres Hirngewebe entfernt wird. Während der Dissektion Verfahren wird darauf geachtet, nicht zu beschädigen die Hirnhäute, die über dem linken kortikalen Hemisphäre. </li><li> Sobald seziert jeder Embryo in HBSS mit einer Pipette mit einem Schnitt 1 ml Pipettenspitze übertragen wird. Die Halbkugel wird vorsichtig auf ein Kollagen beschichteten Kulturplatten Einsatz vertrieben. Bis zu sechs Hemisphäre Explantate medialen Seite angeordneten sich auf jeweils 24 mm Einsatz. Einmal angeordnet, überschüssiges HBSS wird von dem Einsatz entfernt und der Einsatz wird dann in eine 35-mm-Well einer 6-Well-Schale gegeben. Der Brunnen enthält exactly 2,7 ​​ml Medium: DMEM-F12 Medium mit Glutamax und ergänzt mit 2% B-27, 1% G5 und 1% Penicillin-Strep. Ein paar Tropfen der Medien aus dem Brunnen können übereinander Explantat pipettiert werden, aber nicht hinzufügen media über der ursprünglichen 2,7 ml pro Vertiefung. </li><li> Sobald die Explantate auf Collagen Filter platziert wurden die 6 Well-Platte, welche die Explantate in eine Billups Rothenberg (BR) Kammer (das auch eine Schale mit Wasser befeuchtet) platziert. A 95% / 5% Sauerstoff / CO 2-Gasmischung in die Kammer für mindestens 1 min vor Abdichten der Kammer geschlossen und Abklemmen der 95% / 5% Sauerstoff / CO 2 Gaszufuhrrohr infundiert. Das BR Kammer wird dann in einem 37 ° C Inkubator für Gewebekultur den Rest der Kulturperiode, 1-2 DIV platziert. </li></ol> 3. Fixierung Explantatgewebe für die Histologie <ol><li> In einem Abzug vorbereiten Pagano Fixierung Lösung erster machende 8 g Paraformaldehyd in 100 ml vorgewärmtes (~ 80 &amp; deg; C) ddH 2 O. Fügen Sie 1-3 Tropfen konzentrierte NaOH die Solubilisierung zu fördern und vorsichtig umrühren. Sobald solubilisiert mischen 8% Paraformaldehydlösung 1:1 mit einer Lösung, die 500 mM Saccharose, 100 mM Hepes, pH 7,4, 50 mM MgCl 2, 5 mM KCl für eine Endkonzentration von 4% Paraformaldehyd in 250 mM Saccharose 50 mM Hepes ist , 25 mM MgCl 2, 2,5 mM KCl, pH 7,4. </li><li> Um dies zu beheben die Explantate erwärmen Pagano fix Lösung auf 37 ° C. Schnelles Entfernen meisten DMEM/F12 Medien aus jeder Kultur gut und 5 ml Pagano Fix zu jeder Vertiefung der Explantate. Achten Sie darauf, jedes Explantat vollständig bedecken in fix. Fix für 1 Stunde bei RT. Entfernen Sie nicht Explantate aus dem Filter vor 1 Stunde der Fixierung. </li><li> Nach der Fixierung entfernen Pagano fix Lösung und ersetzen Pagano Lösung ohne fix (250 mM Saccharose 50 mM Hepes, 25 mM MgCl 2, 2,5 mM KCl, pH 7,4). Fügen Sie ein paar Tropfen 10% Natriumazid und bei 4 ° C bis Einbettung. </li></ol> 4. Einbettung und Sectioning für die Histologie <ol><li> Eine 10% ige Kalbshaut Gelatinelösung durch Solubilisieren 10 g Kalbshaut Gelatine in 100 ml warmem Wasser (55-60 ° C). Zeigen Gelatinelösung auf einer Heizplatte auf 60 ° C und wirbeln in regelmäßigen Abständen, bis solubilisiert. </li><li> Gießen etwa 10 ml der 10% igen Gelatine-Lösung in den Boden einer 10 cm-Petrischale und erlauben 30 min zu verfestigen. Dadurch wird ein &quot;pad&quot; für die Einbettung der Explantate bilden. Diese Pads können vorbereitete Tage im Voraus und bei 4 ° C. Verwenden Sie ein Lineal, um ein Raster auf dem Boden der Petrischale zu ziehen und zu übertragen einzelnen Explantate in jedem Feld des Gitters. Rückstände von Pagano Lösung und mit einer Pipette auf jede Explantat mit warmen 10% igen Gelatinelösung und lassen sich zu verfestigen. Fortsetzen langsame Zugabe von Gelatinelösung, bis jede Explantat vollständig von Gelatine umgeben, dabei nicht um das Kissen durch die Zugabe von zu viel erwärmen Gelatine sofort schmilzt. Lassen Sie für die Gelatine zu härten für ~ 1 Stunde. Nach Aushärtung der einzelUAL Explantate können in kleine Blöcke von Gelatine geschnitten werden. Die Blöcke werden dann in Pagano-fixiert verfassen fix für 24-48 Stunden vor dem Schneiden mit einem Vibratom. </li><li> Explantate in Gelatine Blöcke Riechkolben positioniert und geschnitten in der koronalen Ebene bei 100 mu m Dicke. Die Abschnitte werden gesammelt und in PBS + 0,1% Natriumazid bei 4 ° C bis immunhistochemische Verarbeitung. Gespeicherten </li><li> Immunhistochemischen Nachweis erfolgt durch die Übertragung Abschnitten in eine 24-Well-Platte (2-3 Abschnitte pro Well) durchgeführt. Erster Block unspezifische Antikörperbindung durch Zugabe von 0,5 ml PBST + B (PBS + 0,5% Triton X 100 und 2% BSA) in jede Vertiefung, inkubieren 1 h unter leichtem Schütteln. Die entsprechenden primären Antikörper wird dann in PBST + B verdünnt und 0,4 ml pro Vertiefung wird für eine Inkubation über Nacht bei RT zugegeben. Der primäre erfolgt mit PBS 3X wäscht und für mindestens 10 min gewaschen. Der sekundäre Antikörper und 2 ug / ml Hoechst 33342 Nuklearfarbstoff werden dann in PBST + B verdünnt und die Proben werden für 2 h bei RT inkubiertunter leichtem Schütteln. Drei Wäschen PBS (10 min jeweils) werden durchgeführt und dann werden die Schnitte auf Objektträger unter Verwendung eines 90% Glycerin 50 mM Tris, pH 7,4, Eindeckmitteln montiert. </li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Wir haben verbessert und ausgewertet eines experimentellen Modells - ganzen Hemisphäre Explantate - zur Untersuchung der frühen Entwicklung kortikalen (E13-E15). Das Modell hat sich für die Analyse der Migration und Differenzierung des exzitatorischen Neurons Linie, die Schicht 6 aus der Großhirnrinde 25,37 bildet nützlich. Die prinzipiellen Vorteile des Systems sind: 1) organotypischen Wachstum für 2 DIV, 2) Einfachheit der Zubereitung, und 3) experimentellen Zugang zu den Neuronen für die Elektropora...

Die Säugerzellen Großhirnrinde Formen durch den abgestimmten Proliferation, Migration und Differenzierung von nacheinander erzeugten Neuronen. Jedes Neuron in der ventrikulären Zone (VZ) geboren und wandert von der VZ in die Zwischenzone (IZ), Bilden des kortikalen Platte (CP) ein. Als sie durch die verschiedenen kortikalen Bereichen passieren, zeigen die Migration Neuronen mehrere Modi der Migration 2,3, die auf die extrazelluläre Umgebung und andere zelluläre Elemente (zB radiale Gliazellen) innerhalb des sich entwickelnden Gewebes ab. Kortikalen Neuronen dann verhaften Migration an der Spitze der bildenden kortikalen Platte in den zusammenfallenden Prozesse der neuronalen Migration Verhaftung und dendritogenesis 4. Kortikalen Entwicklung zwischen embryonalen Tag 11-13 (E11-13) 5 durch die Einrichtung des Ur plexiformen Schicht 6 oder Vorbeschichtungszyklus (PP), eine Schicht des Pioniers Neuronen, die über der VZ eingeleitet. ProspektivSchicht 6 kortikalen Neuronen (dh die ersten kortikalen Neuronen im VZ geboren), dann orientieren ihre Somata in einem stereotypen Muster und verbinden sich zu einer deutlichen Schicht innerhalb des PP 7. Diese Ereignisse spaltete die Vorbeschichtungszyklus in eine oberflächliche marginal (zukünftige kortikale Schicht 1) und einer tiefen Zone, die letztere Plattenaufbau Zellen (transiente kortikale Schicht 7) zusammen. Dieser Vorgang, genannt Vorbeschichtungszyklus Spaltung, ist ein grundlegendes Ereignis in der Zukunft Wachstum der Großhirnrinde 8. Viele genetische Mutationen identifiziert worden, die stören, die verschiedenen Aspekte der kortikalen Entwicklung 9. Kortikalen Entwicklung kann sich auch negativ durch die Exposition gegenüber aufgenommenen Gifte wie Kokain 10 und Alkohol 11 beeinflusst werden. Da kortikalen Fehlbildungen, die während der Entwicklung entstehen wahrscheinlich Beitragszahler neurologischen Erkrankungen (zB Autismus, Schizophrenie), sind empirische Untersuchungen von Störungen auf kortikalen Entwicklung inhärentenders wichtig. Es ist daher von großer Bedeutung, um Ansätze zu etablieren, um kortikalen Entwicklung, die eine schnelle Tests von genetischen oder Toxin Effekte erlauben die aber auch die Erhaltung der möglichen Wechselwirkungen zwischen differenzierenden Neuronen, andere Zelltypen und der extrazellulären Matrix (ECM) in dieser frühen Phase der Entwicklung des Gehirns 12 studierst . Scheibe Explantate 13 haben ein solches System zur Verfügung gestellt und sind weit Assay kortikalen Neuronen Entwicklung 14-16 verwendet. Allerdings kann Slice Assays unter dem Nachteil, dass neuronale Migration und Laminierung kann als abnormal 17 möglicherweise durch die Zellen, die den meningealen entwickelnden Gehirns und der radiale Anker glialen Stützgerüst umgeben beschädigen leiden. Als radiale Gliafasern ein wichtiger Substrat für kortikale Neuronen Migration 18 Störung der Basallamina durch Schneiden sind lokal zu stören radialen Gliazellen Architektur und führen zu veränderten kortikalen Migration. Neben der SLIced Oberflächen Explantate stellt einen Bereich aus toten Zellen, die den normalen Zusammensetzung der ECM in diesen Bereichen verändert werden kann. Neuere Ansätze haben ihre Analyse auf Zellen tief in der Scheibe, die durch geeignete gesunde Zelltypen und ECM umgeben befinden konzentriert. Jedoch kann in einigen Fällen diese neueren Ansätze können erfordern, dass die ursprüngliche Dicke kultivierten Slice Kryo-oder Paraffin-Schnitt geschnitten werden nach Fixierung, so daß die relativ normal Inneren der Scheibe zur Verfügung gestellt wird zur Analyse 19-21. Sowohl der ursprüngliche Vibratom Schneiden, um die Live-Scheiben für Kultur sowie der anschließenden Kryoschneiden von festen Scheiben für die Analyse vorzubereiten erfordern Sorgfalt und Mühe für diese Assays zu arbeiten. Um einen einfachen, ergänzenden Ansatz für Studien der frühen kortikalen Entwicklung, haben wir modifiziert eine bestehende Scheibe Ansätze 13 Studien der frühen kortikalen Entwicklung zu erleichtern. Wir haben eine wh entwickeltole Hemisphäre Explantat-Modell ähnlich einem bestehenden E14 ganzen Hemisphäre Modell, das geschüttelte Kulturen bei 65 Umdrehungen pro Minute und erlaubt organotypischen Wachstum für 16-18 Stunden 22,23 involviert. In unserem Ansatz werden ganzen Hemisphäre Explantate auf semipermeable Membran 13 mit einem hohen Sauerstoff-Atmosphäre Kultur 21,24 angeordnet, um organotypischen kortikalen Wachstum für 48 Stunden verlängern. Dieser Ansatz ermöglicht eine konsistente Elektroporation entwickelt kortikalen Neuronen. Die Embryonen werden aus der Gebärmutter entfernt und elektroporiert, Plasmid-DNA einzuführen und die Telencephalon wird dann seziert. Jede Hemisphäre wird isoliert und medialen Seite nach unten auf eine Kollagen-beschichtete Filter. Das Explantat wird dann für einen Zeitraum von 48 Stunden, eine Periode, die Vorbeschichtungszyklus Aufspaltung 8 umfasst kultiviert. Während der Anzucht, entwickeln L6 Neuronen aus Vorläuferzellen zu unterscheiden Neuron 25, richtig positioniert in der kortikalen Platte. Während dieser Zeit ist die Entwicklung vonNeuron wird durch die entsprechende ECM und Zelltypen, die die entsprechende Zelle in vivo zu konfrontieren würde umgeben. Dieses System hat sich bereits in der Entschlüsselung der zellulären Vorgänge, die Ethanol Toxizität 26, Schicht 6 Bildung und Vorbeschichtungszyklus Aufspaltung 7,25 zugrunde wertvoll.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10565</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 Supplement 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503-012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen / Strep Liquid 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 500 ml</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert collagen coated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3492</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine skin gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX 830 Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes 10mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Billups Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 uL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-04</td>
			<td>Specify 1" and style 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors Tough Cut 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development

Kortikalen Entwicklung beinhaltet komplexe Interaktionen zwischen Neuronen und nicht-neuronalen Elemente, einschließlich Vorläuferzellen, Blutgefäße, Hirnhäute und die damit verbundenen extrazellulären Matrix. Weil sie eine geeignete organotypischen Umfeld zu schaffen, sind kortikale Schicht Explantate oft verwendet, um die Wechselwirkungen, die neuronale Differenzierung und Entwicklung steuern zu untersuchen. Obwohl von Vorteil, kann die Scheibe Explantat-Modell von Nachteilen einschließlich aberrante zelluläre Laminieren und Migration leiden. Hier berichten wir über eine ganze Gehirnhälfte Explantat für Studien der frühen kortikalen Entwicklung, die einfacher herzustellen als kortikale Scheiben und zeigt konsistente organotypischen Migration und Laminierung. In diesem Modellsystem, frühe Laminierung und Migrationsmuster der Regel über eine Zeitspanne von zwei Tagen in vitro, einschließlich der Dauer der Vorbeschichtungszyklus Splitting, bei denen Interessenten Rindenschicht sechs Formen. Wir entwickelten eine ex utero Elektroporation (EUEP)Ansatz, ~ 80% Erfolg bei der Ausrichtung der GFP-Expression zu Neuronen entwickeln im dorsalen medialen Kortikalis erreicht. Die ganze Hemisphäre Explantat Modell macht frühen kortikalen Entwicklung zugänglich für die Elektroporation, pharmakologische Intervention und Live-Bildgebung. Dieses Verfahren vermeidet die Überlebensrate Chirurgie in utero Elektroporation (IUEP) erforderlich ist, während Ansätze Verbesserung sowohl Transfektion und Flächendichte Targeting Konsistenz. Dieses Verfahren erleichtert experimentelle Untersuchungen von neuronalen Proliferation, Migration und Differenzierung.

Die embryonale Nager Cortex weist eine quer neurogenetischen Gradienten in der Entwicklungsphase ist, so dass seitliche Neocortex ungefähr 1 Tag reifer als dorsalen medialen Neocortex 28. Die Masse der Schicht 6 Neuronen so erzeugte (dh weisen ihre endgültige S-Phase) auf E12 in seitlichen Kortex (auch als Feld 40 5) und bei E13 in der dorsalen medialen Kortex (auch als Feld 1 5). Vorbeschichtungszyklus Aufspaltung beginnt etwa 1 Tag nach Layer 6 Neuron Generation und wird som...

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Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Dieses Protokoll beschreibt eine verbesserte Explantat Verfahren, das umfasst<em&gt; Ex utero</em&gt; Elektroporation, Dissektion und Kultur des gesamten zerebralen Hemisphären aus dem embryonalen Maus. Die Vorbereitung erleichtert pharmakologischen Studien und Untersuchungen von Genfunktionen in der frühen kortikalen Entwicklung.

Ex utero Elektroporation und Whole Hemisphäre Explantate: A Simple Experimentelle Methode für Studien der frühen kortikalen Entwicklung

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

12.8K Aufrufe.  SUNY Upstate Medical University. Dieses Protokoll beschreibt eine verbesserte Explantat Verfahren, das umfasst Ex utero Elektroporation, Dissektion und Kultur des gesamten zerebralen Hemisphären aus dem embryonalen Maus. Die Vorbereitung erleichtert pharmakologischen Studien und Untersuchungen von Genfunktionen in der frühen kortikalen Entwicklung.

Serie: Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero Elektroporation gefolgt von primären neuronalen Kultur für ein Studium Gene Function in Subset von kortikalen Neuronen

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Forschung

Neurowissenschaften

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

Erzeugung von Aktuell transgenen Ratten durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation und<em&gt; In-vivo-</em&gt; Biolumineszenz Screening

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF differentiates from the amniotic fluid upon closure of the anterior neural tube. CSF volume then increases over subsequent days as the neuroepithelial progenitor cells lining the ventricles and the choroid plexus generate CSF. The embryonic CSF contacts the apical, ventricular surface of the neural stem cells of the developing brain and spinal cord. CSF provides crucial fluid pressure for the expansion of the developing brain and distributes important growth promoting factors to neural progenitor cells in a temporally-specific manner. To investigate the function of the CSF, it is important to isolate pure samples of embryonic CSF without contamination from blood or the developing telencephalic tissue. Here, we describe a technique to isolate relatively pure samples of ventricular embryonic CSF that can be used for a wide range of experimental assays including mass spectrometry, protein electrophoresis, and cell and primary explant culture. We demonstrate how to dissect and culture cortical explants on porous polycarbonate membranes in order to grow developing cortical tissue with reduced volumes of media or CSF. With this method, experiments can be performed using CSF from varying ages or conditions to investigate the biological activity of the CSF proteome on target cells.

The ventricular cerebrospinal fluid (CSF) bathes the neuroepithelial and cerebral cortical progenitor cells during early brain development in the embryo. Here we describe the method developed to isolate ventricular CSF from rodent embryos of different ages in order to investigate its biological function. In addition, we demonstrate our cerebral cortical explant dissection and culture technique that allows for explant growth with minimal volumes of culture medium or CSF.

Isolierung von Liquor aus Rodent Embryonen für die Verwendung mit Dissected Cerebral Kortikale Explantate

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

Subtyp-selektive Elektroporation kortikaler Inter

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of intellectual disability and account for 20-40% of drug-resistant epilepsy in childhood. High-resolution brain imaging has facilitated in vivo identification of a large group of MCD phenotypes. Despite the advances in brain imaging, genomic analysis and generation of animal models, a straightforward workflow to systematically prioritize candidate genes and to test functional effects of putative mutations is missing. To overcome this problem, an experimental strategy enabling the identification of novel causative genes for MCD was developed and validated. This strategy is based on identifying candidate genomic regions or genes via array-CGH or whole-exome sequencing and characterizing the effects of their inactivation or of overexpression of specific mutations in developing rodent brains via in utero electroporation. This approach led to the identification of the C6orf70 gene, encoding for a putative vesicular protein, to the pathogenesis of periventricular nodular heterotopia, a MCD caused by defective neuronal migration.

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Periventricular nodular heterotopia (PNH) is the most common form of malformation of cortical development (MCD) in adulthood but its genetic basis remains unknown in most sporadic cases. We have recently developed a strategy to identify novel candidate genes for MCDs and to directly confirm their causative role in vivo.

Eine neuartige Strategie verbindet Array-CGH, ganze Exome Sequenzierung und In Utero Elektroporation bei Nagetieren verursachenden Gene für Hirnfehlbildungen identifizieren

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

In Utero Ansätze Elektroporation die Erregbarkeit neuronaler Subpopulationen und Einzelzell - Konnektivität zu studieren

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

Elektrophysiologische Methode für Ganzzell-Spannungsklemmen Aufnahmen von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

Hochauflösende konfokale Bildgebung der Blut - Hirn-Schranke: Bildgebung, 3D-Rekonstruktion und Quantifizierung der Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...