Diese Arbeit wurde durch ein National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (NARSAD) Young Investigator Award und National Institutes of Health gewähren R01NS073635 AV unterstützt.

1. Vorbereitung der Reagenzien und Lösungen <ol><li> Beschichtung von 35 mm Kulturschale: Kollagen Typ 1-Lösung wird als wässrige Lösung in 20 mM Essigsäure (~ 100 mg Protein / Röhrchen) zugeführt. Verdünnen Sie eine entsprechende Volumen der Kollagenlösung zu einer Arbeitskonzentration von 0,01% mit sterilen Gewebekultur-Wasser. Mantel Gerichte mit 1 ml Kollagenlösung für 3-4 Stunden bei Raumtemperatur (RT) oder 37 ° C oder über Nacht bei 2-8 ° C. Entfernen Sie überschüssige Lösung von der beschichtete Schale und lassen Sie es über Nacht trocknen. Spülen Sie die Schale mit Gewebekultur-Wasser oder PBS vor der Zugabe Medien. Beschichtete Platten können bei 4 ° C für einen Monat gelagert werden. </li><li> Bereiten komplette Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium (DMEM). Ergänzen das DMEM (500 ml) mit 10% FBS und Antibiotika-Antimykotika-Lösung (1x Konzentration; 1 ml/100 ml). Komplettem DMEM bei 4 ° C für zwei Monate gelagert werden. </li><li> Vorbereitung eines Aliquots (50 ml) DMEM mit DNase I (0,001 mg / ml) (als D bezeichnetMEM-DNase I). </li><li> Vorbereitung weiteres Aliquot (10 ml) DMEM mit Kollagenase und Dispase (1 mg / ml) (als DMEM-collagenase/dispase bezeichnet). </li><li> Vorbereitung Endothelzell-Kulturmedium (ECCM, 500 ml), mit EGF (5 &amp;mgr; g) ergänzt, ECGS (100 mg) und 5 &amp;mgr; l von Antibiotika-Antimykotika-Lösung. ECCM können bei 4 ° C für zwei Monate gelagert werden. </li><li> Vorwärmen alle Medien vor dem Gebrauch. </li><li> Vorbereitung Reinigungspuffer: PBS, pH 7,2 mit 0,5% BSA und 2 mM EDTA. Halten Puffer kalt (2-8 ° C). </li></ol> 2. Entfernung von Embryonen und Präparation der Telen Alle Experimente mit Labortieren durch die Tierpflege und die Nutzung Ausschüsse des McLean-Krankenhaus zugelassen und entsprechen den NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren. <ol><li> Verwenden zeitlich schwanger CD1-Mäuse (embryonalen Tag 15). Der Tag der Vaginalpfropf Entdeckung gilt als embryonale Tag 0 (E0). CD1 Staudämme produzieren im Allgemeinen große Würfe, so 10-12 Embryos werden von einer schwangeren Damm erwartet. </li><li> Für hysterotomy, betäuben trächtige Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (100 mg / kg) / Xylazin (5 mg / kg). Bei Mäusen ca. 20-30 g, liefern 0,3 ml einer 10 ml / kg Ketamin / Xylazin Anästhesielösung und sicherzustellen, dass Schmerzen und Leiden ist minimal, während die intraperitoneale Injektion des Narkosemittels. Verwenden Sie Handstütze für die Injektionen. </li><li> Überprüfen tiefe Narkose durch Zehe Prise. Embryonen entfernen tief narkotisierten Mäusen. Köpfen jedem Embryo sofort nach der Entfernung von der Mutter. Legen Sie die embryonalen Köpfe in sterilen Petrischalen in eiskaltem PBS. </li><li> Folgen Hysterektomie durch sofortige Euthanasie mit Narkosedosis (130 mg / kg Pentobarbital, ip), ein Verfahren zur Euthanasie, die im Einklang mit den Richtlinien für die AVMA Euthanasie von Tieren ist: 2013 Edition. </li><li> Unter einem Stereomikroskop, entfernen Sie das Gehirn aus dem Kopf mit feinen Mikro Schere und feinen Pinzette. Hinweis: Eine hohe Qualität sezierenIonen ist wichtig, die Pia-Membran erfolgreich aus dem embryonalen Gehirn zu entfernen. Dies wird durch die Praxis erreicht. Feinen Pinzette und Schere Mikrospitze sind ebenfalls wichtige Werkzeuge für einen guten Präparation. </li><li> Verwenden Sie die Pinzette, um einen festen Griff auf das Gehirn und die Mikro Schere bekommen abziehen der Pia-Membran. Entfernen Sie die Hirn und metencephalon und Isolierung des Telen. Übertragen Pia frei Telen von allen Embryonen auf eine 35 mm Kulturschale mit 2 ml PBS im Eis. </li></ol> 3. Zellisolierung <ol><li> Mince das Telen in 1-2 mm Fragmente mit einer Skalpellklinge und sammeln Gewebe in einem 15 ml Falcon-Röhrchen mit 2 ml komplettem DMEM. </li><li> Distanzieren Gewebe vorsichtig, aber gründlich mit einer 1 ml-Pipette bis Klumpen verschwinden und eine milchige Suspension erreicht. </li><li> Zentrifuge dissoziierte Zellen bei 800-1.000 x g für 5 min bei RT. </li><li> Den Überstand und Pellet erneut in DMEM-DNase I. vorsichtig entfernen Sie vorsichtig distanzieren die cells erneut mit 1 ml Pipette und Zentrifuge bei 800-1.000 x g für 5 min bei RT. </li><li> Das Pellet in warmen kompletten DMEM. Filterzellen durch ein steriles 70 um Nylon-Mesh. Sammeln gefiltert Zellen und halten im Eis. </li><li> Sammle die Zellen-Bereiche auf dem Sieb zurückgehalten und zu verdauen ferner mit DMEM-collagenase/dispase (2 ml) für 1-2 min bei RT. Waschen der Zellen 3x in DMEM-DNase durch Zentrifugation bei 800-1000 x g für 5 min bei RT. Bündeln diese Zellen mit dem filtrierten Zellen in Schritt 3.5 gesammelt. Waschen Gesamt Zellen einmal mit komplettem DMEM. Gehen Sie auf die Zellzahl und magnetischen Markierungsschritte bestimmen. Hinweis: Es ist wichtig, um eine Einzelzellsuspension vor der magnetischen Markierung zu erhalten. </li></ol> 4. Magnetische Beschriftungs <ol><li> Dieses Protokoll zeigt die magnetische Kennzeichnung 10 7 Zellen. Für Zellzahlen von weniger als 10 7, das gleiche Volumen und Reagenz für Zellzahlen von mehr als 10 7, Scale-up alle Reagenzienvolumina und Gesamtvoluminaentsprechend (zB für 2 x 10 7 Zellen insgesamt, verwenden Sie zweimal die Lautstärke aller angegebenen Reagenzien). Halten Sie alle Reagenzien und Zellen im Eis. </li><li> Bestimmen der Zellzahl mit einer Zählkammer. </li><li> Zentrifuge Zellsuspension bei 300 × g für 10 min bei RT. Absaugen des Überstandes. </li><li> Hinzufügen 90 μl/10 7 Zellen Reinigungspuffer zu dem Zellpellet, gefolgt von 10 ul CD31-MicroBeads. Die vom Hersteller bereitgestellten Mikroperlen sind konjugierte monoklonale anti-Maus-CD31-Antikörpers. </li><li> Gut mischen und die Proben für 15 min in den Kühlschrank stellen. Hinweis: Höhere Temperaturen und / oder längere Inkubationszeit während magnetische Markierung kann unspezifische Bindung führen. </li><li> Waschen der Zellen durch Zugabe von 1-2 ml/10 7-Zellen der Reinigung Puffer und Zentrifuge bei 300 g für 10 min. Überstand entfernen und resuspendieren Zellen in 500 &amp;mgr; l Reinigungspuffer. Gehen Sie zur magnetischen Trennung oder Reinigungsschritt. </li></ol> 5. Purification <ol><li> Platzieren MS Säule in das Magnetfeld des MACS Separator. </li><li> Spülen Säule mit 500 ul Reinigungspuffer. </li><li> Gelten Zellsuspension auf die Säule. Legen entsprechende Anzahl von Zellen in MS-Spalte als höhere Zellzahl kann die Spalte verstopfen. Achtung: Jeder MS-Spalte kann eine maximale Anzahl von 2 x 10 7 Zellen, für eine höhere Zellzahl aufnehmen, verwenden Sie mehr Spalten. </li><li> Sammeln und entsorgen Durchfluss unmarkierten Zellen enthält. </li><li> Mit 500 ul Reinigungspuffer dreimal waschen Spalte. Während der Waschschritte, stellen Sie sicher, dass die Spalte Behälter leer ist, bevor die anschließende Reinigung Puffer Aliquots. </li><li> Entfernen Spalte aus der MACS-Separator und legen Sie es auf einem 15 ml Falcon-Röhrchen. </li><li> Ein Kolben ist mit dem MS-Säule zugeführt. Je 1 ml Reinigungspuffer auf die Säule MS und sofort spülen die magnetisch markierten Zellen durch festes Drücken Sie den Kolben in die Spalte. </li><li> Teller cells auf einer 35 mm Kulturschale mit Kollagen Typ 1 schwemmt und wachsen Zellen in ECCM in einem Inkubator auf 37 ° C mit 95% O 2 und 5% CO 2 eingestellt. </li><li> Ändern Sie das Medium alle vier Tage. Verwenden PVECs für Experimente oder Subkultur nach 10-12 Tagen, wenn der Teller ist konfluent. </li></ol> 6. Subkultur von PV-ECS <ol><li> Entfernen Sie die ECCM und spülen Sie die Monolage von PVECS mit 1-2 ml sterilem PBS. </li><li> Sanft fügen 1,5 ml 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung, um die Zellschicht zu bedecken. </li><li> Gibt die Schale in den Inkubator. Innerhalb von 5-7 Minuten, werden die Zellen von der Oberfläche der Schale zu lösen. </li><li> Nachdem die Zellen abgelöst, sofort das gleiche Volumen von Trypsin-Inhibitor und verreiben mehrmals. </li><li> Übertragen der Zellen in ein steriles 15 ml Falcon-Röhrchen. Das Röhrchen bei 500 xg für 5 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in 1 ml vorgewärmten ECCM. </li><li> Samen, die Zellen für den Ausbau der Kultur, imAlterung oder andere Tests. </li></ol>

<ol>
	<li>Shen, Q., S, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+stimulate+self-renewal+and+expand+neurogenesis+of+neural+stem+cells.">Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells.</a> Science. 304, 1338-1340 (2004).</li><li>Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three-dimensional+system+to+study+interactions+between+endothelial+cells+and+neural+cells+of+the+developing+central+nervous+system.">A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system.</a> BMC Neurosci. 8, 3 (2007).</li><li>Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+of+primary+neural+progenitor+and+endothelial+cells+in+a+macroporous+gel+promotes+stable+vascular+networks+in+vivo.">Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo.</a> 19, 1469-1485 (2008).</li><li>Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+transcription+factors+orchestrate+angiogenesis+gradients+in+the+embryonic+brain.">Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain.</a> Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).</li><li>Vasudevan, A., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+the+embryonic+CNS:+a+new+twist+on+an+old+tale.">Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale.</a> Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).</li><li>Won, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+vascular+networks+synchronize+GABA+neuron+migration+in+the+embryonic+forebrain.">Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain.</a> Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).</li><li>Dong, Q. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissues.+Characterization+of+two+endothelial+cell+lines+from+the+murine+lung+and+subcutaneous+sponge+implants.">A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).</li><li>Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+colony+stimulation+factor-1+receptor+results+in+loss+of+microglia,+disrupted+brain+development+and+olfactory+deficits.">Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Young+neurons+from+medial+ganglionic+eminence+disperse+in+adult+and+embryonic+brain.">Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain.</a> 2, 461-466 (1999).</li><li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling.">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li><li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+form+a+migratory+scaffold+in+the+rostral+migratory+stream.">Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

PVEC sind mehr als physiologisch relevanten erwachsenen Gehirn Endothelzellen und ECs von anderen Gewebequellen für Studien, die sich auf neurovaskulären Interaktionen und auch therapeutisches Potenzial. Für PVEC Vorbereitung ist es wichtig, zu Beginn mit Dissektion um schneller zu arbeiten, um eine gute Rentabilität zu erreichen, da tote Zellen unspezifisch an CD31 MicroBeads binden. Darüber hinaus, wenn Einzelzellsuspension wird nicht vor der magnetischen Markierungsschritt erreicht, wird diese bei der Fehlersuch...

Angiogenese, Neurogenese und neuronale Migration sind kritische Ereignisse im zentralen Nervensystem (ZNS), Entwicklung, Reparatur und Regeneration. Mehrere elegant Studien haben gezeigt, dass Endothelzellen neuronalen Proliferation und umgekehrt stimulieren durch Freisetzung von löslichen Faktoren und durch direkten Kontakt. Wir fanden es merkwürdig, dass in der Mehrzahl dieser Studien 1-3, während die neuronalen Vorläuferzellen / neuralen Stammzellen aus dem embryonalen Gehirn isoliert, sie sind mit Endothel-Zellen aus dem erwachsenen Gehirn, andere erwachsene Gewebequellen oder mit einer endothelialen Zelllinien kokultiviert. Dies kann zum Teil aufgrund der technischen Schwierigkeiten bei der Isolierung und Kultivierung reine Populationen von Endothelzellen aus dem embryonalen Gehirn. , Angiogenese, Neurogenese und neuronale Migration sind jedoch gleichzeitigen Veranstaltungen in Größenordnungen robuster im embryonalen Gehirn auftreten als in der normalen erwachsenen Gehirn. Die periventrikulärer Gefäßnetz des embryonic Vorderhirn (Telencephalon) stammt von einem Schiff in den Basalganglien Primordium gelegen und entwickelt sich in Form einer geordneten Gradienten von ventral Telen von embryonalen Tag 11 (E11) 4,5 dorsal. Dieses Geflecht von Schiffen der periventrikulären Gefäßnetz unterscheiden sich von Pia-Gefäße basierend auf Herkunft, anatomische Lage, Wachstumsmuster und Entwicklungsregulation 4,5. Die Ausbreitungsrichtung der periventrikulären Angiogenese Steigung entspricht der neurogenetischen Quer telencephalic Steigung. Innerhalb der Telen, die periventrikuläre Angiogenese Steigung und das Gefälle der GABA-Neuronen Migration tangential überlappt räumlich als auch 6. In Bezug auf Timing, ist die Angiogenese Gradienten im Vorfeld der neurogenetischen Gradienten-und GABA-Neuronen Gradienten von etwa einem Tag. So sind periventrikuläre Endothelzellen räumlich und zeitlich gut positioniert, um kritische Hinweise liefern, um telencephalic Neurogenese zu unterstützen undneuronalen Migration 4,6. Daher würde die Verwendung von embryonalen periventrikulärer Endothelzellen in Kokultur Experimente mit neuronalen Vorläuferzellen und / oder Neuronen eines günstigeren Modell zum Studium der Wechselwirkungen neurovaskuläre und Entwicklung neuer Wege für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen oder ischämischer / traumatische Gehirnverletzung ist. Wir unterstreichen die Bedeutung der Entfernung der Pia-Membran, nicht nur um epithelialen Zellkontamination zu begrenzen, sondern auch auf Pia-Endothelzellen, die molekular und funktionell von Endothelzellen der Gefäßnetz periventrikulärer 4,6 (bezeichnet als PVECs von Pia-ECs zu unterscheiden) sind zu trennen . Hier beschreiben wir die Methode, die wir verwenden in unserem Labor routinemäßig, um einen reichen und Reinausbeute von PVECs erhalten. Diese Endothelzellen aus embryonalen Vorderhirn von einem Einzelzeit-schwangeren Maus isoliert vorbereitet. Sie können für die zukünftige Nutzung erweitert werden, subkultiviert und frorene erfolgreich.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="768">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">DNase I</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">D-4527</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen, Type 1 solution from rat tail </td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS</td>
			<td>Quality Biologicals</td>
			<td style="width:147px;">114057-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M4055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS column</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD31 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-097-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACS multi stand</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell strainer 70 &#181;m</td>
			<td style="width:183px;">BD Bioscience</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic and antimycotic solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase/Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">DMEM </td>
			<td style="width:183px;">Lonza</td>
			<td>12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm culture dish</td>
			<td style="width:183px;">BD Bioscience</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 ml falcon tube </td>
			<td style="width:183px;">BD Bioscience</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml falcon tube</td>
			<td style="width:183px;">BD Bioscience</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">ECCM kit</td>
			<td style="width:183px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:147px;">355054</td>
			<td>Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF and Soybean Trypsin Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)</td>
			<td style="width:183px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:147px;">354006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RBECGM</td>
			<td style="width:183px;">Cell applications </td>
			<td style="width:147px;">R819-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM F12 </td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glutamax</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">305050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">tissue culture grade water</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">15230162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">0.25% Trypsin</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">15050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Soyabean trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:183px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:147px;">5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Matrigel</td>
			<td style="width:183px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:147px;">354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qtracker 655 Cell Labeling Kit</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">Q25021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">C10608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Biotinylated Isolectin B4 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">L2140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Anti-Von Willebrand factor</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Anti-CD31/PECAM-1</td>
			<td style="width:183px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:147px;">550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Vectashield Hardset Mounting media with DAPI</td>
			<td style="width:183px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:147px;">H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Ketamine</td>
			<td style="width:183px;">Butler Schein Animal Health Supply</td>
			<td style="width:147px;">44028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Xylazine</td>
			<td style="width:183px;">Lloyd Laboratories</td>
			<td style="width:147px;">1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:183px;">Motic</td>
			<td style="width:147px;">SMZ-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">hemocytometer</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">inverted microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus CK-40</td>
			<td style="width:147px;">CK-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Flouroscent microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus FSX-100</td>
			<td style="width:147px;">FSX-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Fine forceps</td>
			<td style="width:183px;">Roboz surgical instrument</td>
			<td>7 inox</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Fine microtip scissors</td>
			<td style="width:183px;">Roboz surgical instrument</td>
			<td>RS5611</td>
			<td></td>
		</tr>
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isolation and culture of endothelial cells from the embryonic forebrain

Embryonale Endothelzellen des Gehirns kann als ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung der Angiogenese und neurovaskulären Entwicklung und Wechselwirkungen dienen. Die beiden Gefäßnetze der embryonalen Vorderhirn, Pia und periventrikuläre, räumlich markante und haben unterschiedliche Ursprünge und Wachstumsmuster. Endothelzellen aus der Pia-und periventrikuläre Gefäßnetze haben einzigartige Genexpressionsprofilen und Funktionen. Hier präsentieren wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Isolierung, Kultur, und die Überprüfung der reine Populationen von Endothelzellen aus der periventrikulären Gefäßnetz (PVECs) der embryonalen Vorderhirn (Telencephalon). In diesem Ansatz wird Telen ohne Pia Membran aus embryonalen Tag 15 Mäusen zerkleinert, mit Collagenase / Dispase verdaut und mechanisch in eine Einzelzellsuspension dispergiert. PVECs werden aus Zellsuspension mit positiven Selektion mit anti-CD-31/PECAM-1 Antikörper MicroBeads konjugiert mit einem starken Magnet gereinigtTrennverfahren. Gereinigte Zellen auf Kollagen 1 beschichtet Kulturschalen in endothelialen Zellkulturmedium kultiviert, bis sie konfluent und weitere Subkultur geworden. PVECs erhalten mit diesem Protokoll Ausstellung mit Kopfsteinpflaster und spindelförmigen Phänotypen, wie Phasenkontrast-Lichtmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Die Reinheit der Kulturen wurde mit PVEC Endothelzellmarker etabliert. In unseren Händen, diese Methode zuverlässig und konsequent ergibt reine Populationen PVECs. Dieses Protokoll wird mechanistische Studien an gewinnen Einblicke in Vorderhirn Angiogenese, Verständnis PVEC Wechselwirkungen und Quer Gespräche mit neuronalen Zelltypen und hält ein enormes Potenzial für therapeutische Angiogenese gerichtet profitieren.

Die phänotypische Charakterisierung von PVECs von Tag 1-12 wird durch Phasenkontrast-Lichtmikroskopie (Abbildung 2) gezeigt. Die Zellen in die Schale am Tag 1 zeigen charakteristische Morphologie der Zellteilung (2A) befestigt. Zwischen 5-8 Tage, PVECs Übergang von Kopfstein typisch für Endothelzellen und eher an seine in vivo-Zustand (2B und 2C) förmige Morphologie an der Spindel. Am Tag 12 der Kultur erreicht PVEC volle Zusammenfluss <str...

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Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Dieses Video zeigt eine einfache und zuverlässige Strategie zur Herstellung von Reinkulturen von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn innerhalb von 10-12 Tagen und wird nützlich für die Forschung über viele Aspekte der Gehirn Angiogenese konzentriert sein.

Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

isolation-culture-endothelial-cells-from-embryonic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.3K Aufrufe.  Harvard Medical School.  Dieses Video zeigt eine einfache und zuverlässige Strategie zur Herstellung von Reinkulturen von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn innerhalb von 10-12 Tagen und wird nützlich für die Forschung über viele Aspekte der Gehirn Angiogenese konzentriert sein. 

Serie: Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

Isolation und Kultur von Neural Crest Stem Cells aus menschlichen Haarfollikeln

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. Neuroepithelial cells of the neural tube that express Nkx6.1 are the unique precursor cells for spinal motoneurons1. Though postmitotic motoneurons move towards their final position and organize themselves into columns along the spinal tract2,3. More than 90% of all these differentiated and positioned motoneurons express the transcription factors Islet 1/2. They innervate the muscles of the limbs as well as those of the body and the inner organs. Among others, motoneurons typically express the high affinity receptors for brain derived neurotrophic factor (BDNF) and Neurotrophin-3 (NT-3), the tropomyosin-related kinase B and C (TrkB, TrkC). They do not express the tropomyosin-related kinase A (TrkA)4. Beside the two high affinity receptors, motoneurons do express the low affinity neurotrophin receptor p75NTR. The p75NTR can bind all neurotrophins with similar but lower affinity to all neurotrophins than the high affinity receptors would bind the mature neurotrophins. Within the embryonic spinal cord, the p75NTR is exclusively expressed by the spinal motoneurons5. This has been used to develop motoneuron isolation techniques to purify the cells from the vast majority of surrounding cells6. Isolating motoneurons with the help of specific antibodies (panning) against the extracellular domains of p75NTR has turned out to be an expensive method as the amount of antibody used for a single experiment is high due to the size of the plate used for panning. A much more economical alternative is the use of lectin. Lectin has been shown to specifically bind to p75NTR as well7. The following method describes an alternative technique using wheat germ agglutinin for a preplating procedure instead of the p75NTR antibody. The lectin is an extremely inexpensive alternative to the p75NTR antibody and the purification grades using lectin are comparable to that of the p75NTR antibody. Motoneurons from the embryonic spinal cord can be isolated by this method, survive and grow out neurites.

An alternative way of isolating mouse embryonic motoneurons from the spinal cord is described. The method takes into account the fact that lectin can bind to the low affinity nerve growth factor receptor p75NTR. This lectin-based preplating allows a purification similar to that with a specific antibody against the p75NTR.

Lectin-basierte Isolierung und Kultivierung von embryonalen Maus-Motoneuronen

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolierung und Kultivierung von Neuronen im Hippocampus von Mäusen Pränatale

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

Isolierung und Kultivierung von embryonalen Ratten-Nervenzellen: ein Quick-Protokoll

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

Isolierung von primären murinen Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus der Maus subcallosa Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.