Teile dieser Arbeit wurden durch die National Institutes of Health (NIH) unter dem Förderkennzeichen 44 R AI072784 unterstützt. Wir danken Dr. Kirsten St. George, Sara B. Griesemer, Daryl Lamson und Amy Dean des Labors für Viruskrankheiten, Wadsworth Center in New York State Dept of Health für quantifiziert Influenza-Virionen und Zugang zu klinisch validiert Influenza Echtzeit PCR-Assays.

<ol>
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Die Autoren sind Mitarbeiter von Akonni Biosystems, Inc., die Materialien, die in diesem Artikel verwendet zu produzieren. Freier Zugang und Produktion dieses Artikels wird durch Akonni Biosystems, Inc. gesponsert

Die Einfachheit des TruTip Konzept und Workflow (Abbildung 1) machen es leicht angepasst, automatisierte, effiziente und effektive für eine Reihe von klinischen Probenmatrices, Eingang Probenvolumina und Liquid-Handling-Systeme. Es sollte jedoch erkannt werden, dass jede klinische Probe einzigartig ist, und eine mit der nächsten in der Viskosität, Partikel, Schleim, Oberflächenverunreinigungen, mikrobiellen und / oder menschlichen genetischen Hintergründen variieren. Angesichts erwarteten Variationen in der klinischen Probe Zusammensetzung und Verwendungen von einer automatisierten Probenvorbereitung TruTip Protokoll, kann es daher notwendig sein, bestimmte Schritte in einer TruTip Verfahren zu modifizieren, um die gewünschten Ergebnisse für eine bestimmte Art Probe zu erreichen. Unabhängig von der Art der Probe enthalten jedoch TruTip Parameter, die haben in der Regel den größten Einfluss auf Nukleinsäure Reinheit und / oder Verwertung: <ol><li> Beispiel Mischen und Homogenisieren mit Lysepuffer (und Alkohol). Während TruTips eine erneute habenlativ große Porengröße Probenhomogenisierung und Verflüssigung ist sehr wichtig für eine effiziente Lyse und nachfolgende Bindung Schritte zum TruTip Monolith. Mit einer homogenen und gut Flüssiggas Lysat können Proben durch die TruTip mit höheren Flussraten, die die gesamte Probe Bearbeitungszeit reduziert bewegen. Das große Volumen Plasma-Protokoll zeigt das Potenzial für die Nutzer, um gründlich zu homogenisieren und zu verflüssigen schwierigen Proben (on-line oder off-line), trotz der großen Eingang Probenvolumen. </li><li> Flussraten. Langsamer Flussraten während Nukleinsäurebindung oder Elution der Regel in höheren Ausbeuten führen Nukleinsäure, wenn auch auf Kosten der gesamten Bearbeitungszeit. Langsamer Strömungsgeschwindigkeiten kann auch die Ausdehnung der DNA Scherung. </li><li> Zyklus-Nummern. Die optimale Anzahl der Aspiration und verzichten Zyklen abhängig ist Probe Typ, total Probenvolumen und Strömungsgeschwindigkeiten. Schritt 1 in 1 ist typischerweise der Punkt, an dem Zyklus numbers (und Strömungsgeschwindigkeiten) kann einige empirische Optimierung, mit Proben wie Nasen-Rachen absaugen (Abb. 5), die eine der schwierigeren Lysate auf Grund des Angebotes von NPA Viskositäten von verschiedenen Patienten zu optimieren. </li><li> Trocknen. Vollständige Trocknung der TruTip Monolith ist zwingend notwendig, um das restliche organische Lösungsmittel aus co-eluiert mit der gereinigten Nukleinsäure-Probe und hemmende Folgeprozesse oder Tests zu verhindern. Da TruTip nicht über Zentrifugieren oder Vakuumfiltration getrocknet, ist es wichtig, sowohl die Strömungsgeschwindigkeit und Taktzahlen während der Trocknungsstufe zu maximieren. Manchmal gibt es ein Restrisiko Tropfen Waschlösung auf der Endstation der TruTip nach der Trocknung Zyklen abgeschlossen sind. Die Hamilton Roboter hat die Fähigkeit, eine &quot;Tip Touch&quot; auf der Seite der Vertiefung, um die Tröpfchen Freilegung, wodurch eine lösungsmittelfreie Elution. Die epMotion System nicht über diese Funktion, sondern eine der TruTip Terminus in el Vorspülenution Puffers programmiert ist, den gleichen Effekt zu erzielen. </li></ol> Da die Geometrie Pipettenspitze Material und Befestigungsart der Roboter-Arm-Kanal einzigartig für jedes Instrument Hersteller sind, ist eine andere TruTip Konstrukt für jede Liquid-Handling-System erforderlich. Die TruTip Monolith Abmessungen (Durchmesser, Dicke und Porengröße) haben mit Nukleinsäure-bindende Kapazität (und Elution Wirkungsgrade) korrelieren, ist wie bei jedem Festphasenextraktion Technik erwartet. Während dicke (&gt; 4 mm) Matrizen zu einer 1 ml TruTip auf Nukleinsäure-bindende Kapazität für großvolumige Proben zu erhöhen und / oder die Bindung auszugleichen Kapazität über spezifische TruTip Formate eingebettet sein kann, gibt es einen Kompromiss zwischen TruTip Dicke und Flussraten während die anfängliche Bindung Schritt (in Gegenwart von Rohlysaten). Daher ist es manchmal vorteilhaft, größeren Durchmesser Monolithen in größerem Volumen Pipettenspitzen einzubetten für die ersten Schritte eines automatisierten Protokoll (zB &lt;/ Em&gt; die 5 ml Hamilton / Akonni TruTips für großvolumige Extraktionen). Angesichts der spezifischen TruTip Konfigurationen durch die Hersteller von Liquid Handling-Roboter diktiert, jedoch haben wir nicht unbedingt erwarten TruTip Nukleinsäure Renditen identisch sein über Liquid Handling-Plattformen verschiedener Hersteller, oder über verschiedene TruTip Größen. Klinische Proben (per Definition) enthalten erhebliche Mengen an humaner genomischer DNA, wenn sie aus einer normalerweise sterilen Websites (zB Rückenmarksflüssigkeit) erworben werden. Manchmal ist die humane genomische DNA gewünscht wird (wie in 6), während in anderen Anwendungen der menschlichen DNA stellt einen unerwünschten Hintergrund Genom (wie bei Figur 5). Die Anwesenheit von Hintergrund-DNA ist in der Regel unproblematisch, solange die Gesamtmenge von Nucleinsäure in der Probe nicht mehr als die Bindungskapazität des Monolithen und die Hintergrund-DNA als Träger zu dienen, wenn das gewünschte Ziel-NukleinsäureSäure ist in Spuren vorhanden. Das Ziel des hochvolumigen Plasmaextraktion Protokoll (Fig. 7) zu isolieren (fragmentierten) fötale DNA in Gegenwart einer 10-20 fachen Überschuß der mütterlichen DNA, die ähnlich wie die Probenvorbereitung Ziel Infektionskrankheit Tests ist, außer dass die Sequenzen hohe Kongruenz und kann nur durch sehr spezifische molekulare Tests und / oder Größe Diskriminierung unterscheiden. In diesem Fall wird die gesamte Umlauf-DNA isoliert mit einer 5 ml TruTip und anschließende hochmolekularen und niedermolekularen fetalen DNA durch getrennt nachfolgende Bindung und Elution mit einem 1 ml TruTip durch Veränderung der Bindung Pufferbedingungen. Selektive Größe Trennung und Anreicherung von Ziel-Nukleinsäuren auf ihre Bindung und Elution Eigenschaften auf eine Silica-Monolith basiert, ist ein deutlich anderen Wirkmechanismus als durch Membranen oder Größenausschluss-Spin-Säulen erreicht. Größe Trennung und Anreicherung von mikrobieller DNA aus humanen genomischen DNA kann eine seinccomplished in zukünftigen Anwendungen über Customizing TruTip verbindlich und Elutionspuffer. Die automatisierten Protokolle gezeigt betonen die Nützlichkeit der TruTip Monolith selbst zum Verarbeiten diverse klinische Proben, und wie sie für große Mengen und spezifischen Liquid-Handling-Roboter angepasst werden. Die optimierte Methoden in der Regel schneller Extraktion Protokolle im Vergleich zu anderen automatisierten Systemen führen. Die Einfachheit des TruTip Technologie, aber auch bietet einige Kostenvorteile für die Interessenten in den Kauf eines neuen, automatisierten Aufreinigung von Nukleinsäure-System, weil die primären Hardware für die Automatisierung TruTip Verfahren erforderlich ist die Pipettenkanal Arm selbst eher als magnetische Stäbe, Vakuum-Systeme oder On-Board-Zentrifugen. Verwendung Fertigspritze Reagenz Platten können auch zu einer Verminderung Raum und erforderlichen Verbrauchsmaterialien und die doppelte Durchsatz pro Lauf. Minimierung Deck mit TruTip Protokolle ermöglicht auch fortgeschrittene Anwender zu integrieren stromaufwärts oder downstream automatisierte Prozesse mit dem TruTip. Zum Beispiel Hamiltons easyBlood Lösung zur Fraktionierung Vollblut können mit dem automatisierten TruTip Extraktionsverfahren, die deutlich straffen würde Bio-Banking-Prozesse integriert werden. Post-Extraktionsverfahren wie Nukleinsäure Quantifizierung, Normalisierung, PCR Set-up, oder DNA-Sequenzierung sind auch leicht mit TruTip auf den größeren Liquid-Handling-Plattformen integriert.

Nukleinsäure-Aufreinigung notwendig ist für die meisten molekularen Diagnostik, Forschung nur zu verwenden, und Life-Science-Anwendungen. Verschiedene Ansätze wurden seit der Zeit der Phenol / Chloroform Extraktionen entstanden, von denen viele auf dem grundlegenden Prinzip der Nukleinsäure-Bindung an Silica in der Gegenwart chaotroper Salze 1 basiert. Die Extraktion wurde gestrafft und automatisiert durch den Einsatz von verschiedenen Perlen-und Membran-basierte Formate, mit Spin Filter, magnetische Kügelchen und verwandte Ansätze dominieren die Life Sciences-Industrie (siehe Beispiele in 2-13). Während wirksam, haben Partikel und Membranen Einschränkungen bekannt, wann mit herausfordernden klinischen Matrizen konfrontiert. Zum Beispiel, Membranen und Kügelchen Säulen auf-konform sind, haben kleine Porengrößen (also hohen Gegendrücken) und erfordern irgendeine Art von Unterstützung, um durch eine Zentrifuge oder Vakuum verarbeitet werden. Die physikalischen Eigenschaften von Membranen und Kügelchen Spalten einesignifikante Strömungswiderstand, der die Art der Proben, die effizient, ohne zu verstopfen die Verbrauchsmaterialien und / oder die Gesamtmenge (Eingang) Probenvolumen, die uni-direktional verarbeitet durch den Strömungsweg können verarbeitet werden begrenzt. Umgekehrt muß magnetischen Teilchen in der Probe durch Rühren verteilt. Die Notwendigkeit, die homogen verteilen magnetischen Teilchen in einer Lösung schränkt die insgesamt eingesetzten Probenmenge, die mit vielen magnetischen Kügelchen Verbrauchsmaterialien verarbeitet werden können. Klinische Probe Attribute (wie Viskosität oder Komplexität) zu ineffizienten Magnetpartikel-Konzentration auf der Seite eines Rohres oder Stabes führen. Darüber hinaus können Silica Feinstaub brechen der Perlen während der Extraktion, verlieren ihre Magnetisierung und verunreinigen das letzte Probe. Die TruTip Technologie wurde entwickelt, um einige dieser Nukleinsäure-Probe Verarbeitung Auflagen und Beschränkungen 14 zu überwinden. Durch die Einbettung eines porösen Monolithen innerhalb einerPipettenspitze, Fluidik Gegendruck abgesenkt, die Ablaufsteuerung ermöglicht durch Vakuum (dh Pipette Aspiration). Diese Funktion ermöglicht die Extraktion und Instrumentierung benötigt, um Nukleinsäuren aus schwierigen Probe Typen zu reinigen, um stark vereinfacht werden (Abbildung 1). Die Geometrie und die Porosität des Monolithen wird hergestellt, um ein Verstopfen zu minimieren, während die Dicke des Monolithen ausreichende Nukleinsäure Bindungskapazität für Probenvolumina im Bereich von 1,0 bis 5,0 ml. Durchfluss in beide Richtungen während Probe Aufnahme und Abgabe ermöglicht längere Verweilzeiten zwischen der Probenlösung und der Monolith für eine effiziente Bindung Nukleinsäuregewinnung und Elution und ermöglicht relativ große Probenvolumina verarbeitet, dass mehr als die Volumenkapazität der Pipettenspitze selbst sein. Wir bereits berichtet die Entwicklung und Anwendung eines manuellen TruTip Verfahren zur Reinigung von Influenza-RNA aus Nasen-Rachen-Proben unter Verwendung eines Single-oder Multi-Channel-Rainin Pipette 15. Equivalent Extraktionseffizienzen wurden zwischen automatisierten und manuellen QIAcube TruTip Methoden bei 10 6 Genkopien Influenza A pro ml Nasen-Rachen absaugen erhalten. Das Ziel dieser Studie war es, mittel-und High-Throughput-, automatisierte TruTip Nukleinsäurereinigung Verfahren zur Nasen-Rachen absaugen (NPA) und anderen klinisch relevanten Probenarten mit Liquid-Handling-Roboter häufig in Bezug klinischen Laboratorien gefunden zu demonstrieren.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips)</td>
			<td>Akonni Biosystems, Inc.</td>
			<td>300-11120</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC615110040</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99% Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270725-4L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir, 30 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>960050100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep well plate 96/2,000 &mu;l</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>30502302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 &mu;l</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>960050100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epMotion 5070 System</td>
			<td rowspan="3">Eppendorf</td>
			<td>5070 000.000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing tool TM1000-8</td>
			<td>960001061</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir rack</td>
			<td>960002148</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips)</td>
			<td>Akonni Biosystems, Inc.</td>
			<td>300-20341</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC615110040</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>AMRESCO LLC</td>
			<td>E195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>235905</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>235904</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Reagent Trough</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>187297</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Well 2 ml plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1896-2800</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96 DWP-2 ml</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>27874</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Trough</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-222-412</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton STAR System</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173027</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173081/173050</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml 96-channel head</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>199090</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182085</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Carriers/Inserts</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173400/182238</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182090</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiflex Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188039</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HHS2 Heater Shaker Unit</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>199033</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips)</td>
			<td>Akonni Biosystems, Inc.</td>
			<td>Call to inquire</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459828-1L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC327270010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>AMRESCO LLC</td>
			<td>E195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered 4 ml Tips</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>184022</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unfiltered 1 ml Tips</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>235939</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Deep Well Plates</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1896-2800</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tubes</td>
			<td>Corning/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-526B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Reagent Troughs</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>187297</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 ml Reagent Troughs</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182703</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Volume 96-Pos Reagent Troughs</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-222-412</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173025/190012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Independent Pipette Channels / Arm</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173081/173052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Independent Channel / Modular Arm</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>184090/173050</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182090</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiflex Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188039</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 ml Reagent trough carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>185290</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182085</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Tube Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182245</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Position Sample Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173400</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 Position Sample Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173410</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput, automated extraction of dna and rna from clinical samples using trutip technology on common liquid handling robots

TruTip ist eine einfache Extraktion von Nukleinsäuren Technologie, bei der eine poröse, monolithische Bindematrix in eine Pipettenspitze eingesetzt ist. Die Geometrie des Monolithen können nach bestimmten Pipettenspitzen Bereich im Volumen von 1,0 bis 5,0 ml angepasst werden. Die große Porosität des Monolithen ermöglicht viskosen oder komplexen Proben zu leicht durch sie hindurch mit minimalem Fluidik Gegendruck. Bi-direktionale Flow maximiert Verweilzeit zwischen dem Monolith und Probe und ermöglicht große Probenvolumina innerhalb eines einzigen TruTip verarbeitet werden. Die grundlegenden Schritte, unabhängig von Probenvolumen oder TruTip Geometrie gehören Zell-Lyse, Nukleinsäure-Bindung an den inneren Poren des TruTip Monolith, Waschen entfernt ungebundenen Bestandteile der Probe und Lysepuffern und Eluieren gereinigt und konzentriert Nukleinsäuren in einem geeigneten Puffer. Die Attribute und Anpassungsfähigkeit der TruTip sind in drei automatischen klinischen Probe Verarbeitung Protokolle unter Verwendung einer Eppendorf epMotion 5070 gezeigt, Hamilton STAR und STARPLUS Liquid-Handling-Roboter, einschließlich RNA-Isolation aus Nasopharynx absaugen, genomische DNA-Isolierung aus Vollblut und fetalen DNA-Extraktion und Anreicherung von großen Mengen im mütterlichen Plasma (jeweils).

Echtzeit-PCR-Daten für Influenza RNA Extraktion aus NPA sind in 5A gezeigt. Geschätzte Nukleinsäure-Extraktion Effizienz ist vergleichbar zu den Ergebnissen mit der manuellen Version des Protokolls 15 erhalten. Eine lineare Abhängigkeit der durchschnittlichen C t-Werte beobachtet wird zwischen 10 4 und 10 6 ml -1 Genkopien Influenza geändert (R 2 = 0,99 und 0,98 für Influenza A und B bezeichnet), mit Standardabweichungen der durchschnittlichen C T-Werte von weniger als 1 Zyklus. Das Fehlen einer Kreuzkontamination mit der epMotion System ist in Abbildung 5B, wo 12 positive Proben, die NPA 10 6 ml -1 Genkopien NPA mit 12 Puffer Rohlinge durchsetzt demonstriert. Die durchschnittliche C t für die positiven Kontrollen war 30,16 ± 0,14, und alle Puffer Rohlinge waren negativ. Die gesamte Verarbeitung Probe beträgt 16, 28 und 40 min für 8, 16 und 24 Proben.Da eine typische klinische Nasen-Rachen absaugen oder Tupfer enthält 10 7 Genkopien ml -1 (vorausgesetzt 1000 Virionen pro KID 50 16 und&gt; 10 4 TCID 50 ml -1 Influenza 17), wird die automatisierte epMotion Protokoll voraussichtlich auf eine Mehrheit wirksam von klinischen Proben NPA. Da der Bereich der molekularen Tests auf humane genomische DNA durchgeführt wird, ist das primäre Ziel der Nukleinsäure-Extraktion aus Vollblut in schadstofffreier, hochmolekulare genomische DNA zu erzeugen. Die automatisierte Protokoll für 96 Proben innerhalb 1 h, was eine Verbesserung gegenüber anderen automatisierten Systemen (zB Promega MagneSil = 90 min und Qiagen QIAamp DNA Blood BioRobot MDx System = 2,5 h). 6A zeigt die UV / Vis-Absorption Profile für abgeschlossen 45 positive Blutproben gleichzeitig mit 45 Reagenzleerwerte auf der Hamilton STAR-Protokoll verarbeitet, mit einer durchschnittlichen A <sub&gt; 260/280 Verhältnis von 1,96 und die durchschnittliche A 260/230 Verhältnis von 1,93. Ein A ​​260/280 Verhältnis zwischen 1,7-2,0 und A 260/230 Verhältnis&gt; 1,7 sind in der Regel sehr bezeichnend für reine DNA, frei von restlichem Salze, Proteine ​​oder Lösungsmittel, und akzeptabel für die meisten nachgeschalteten molekularen Anwendungen. Die 1%-igen Agarosegel in 6B zeigt, dass die resultierende gDNA mit hohem Molekulargewicht (&gt; 24 kb) mit minimaler Scherung. Die durchschnittliche Nukleinsäure Ausbeute aus dem vollen Satz von 45 positiven Proben beträgt 5,26 ± 0,46 ug menschlichen DNA pro 200 ul Vollblut, basierend auf dem Life Technologies Quantifiler Menschliche DNA Quantifizierung Kit. Kreuzkontamination Studien ähnlich wie in 5B gezeigt sind, wurden mit Puffer Negativkontrolle Rohlinge mit der positiven Proben vermischt und extrahiert parallel durchgeführt, alle Rohlinge wurden erneut negativ durch PCR (nicht gezeigt). Das gereinigte gDNA eignet sich auch für zahlreiche andere PCR-Analysen (nicht gezeigt). Ergebnisse in Echtzeit aus acht Replikatproben einer gepoolten mütterlichen Plasma Probe mit dem großvolumigen TruTip Verfahren verarbeitet werden in 7 gezeigt. Der vollständige Protokoll (einschließlich off-line Proteinase K Inkubation) wird in etwa 2,5 Stunden, ähnlich dem Qiagen Handbuch zirkulierenden Nukleinsäuren Kit (keine vergleichbaren automatisierten Extraktion Kits sind noch nicht verfügbar) beendet. Die durchschnittlichen C t-Werte über alle Wiederholungen sind 34,58 ± 0,66 und 29,76 ± 0,50 für fetale männlich (CHY) und insgesamt (CH1) DNA verbunden, die sehr gute Reproduzierbarkeit des automatisierten Extraktionsverfahren demonstriert. Die Konzentration an fötaler DNA in der Gesamt-DNA-Pool (der Genom-Äquivalente) wird auf der Grundlage fit Punktanalyse Vergleich mit Standards berechnet, wobei die resultierende durchschnittliche% fötaler DNA in allen Proben von 2,8%. Die tatsächliche% fetalen DNA für diese Probe ist unbekannt, weil Proben vor der Durchführung der Extraktion wurden gepoolt. Fetal DNA-Zusammensetzungin nicht-gepoolten Plasma-Proben wurde mit Hilfe der TruTip Verfahren sind in der Regel 1,5-fach höher im Vergleich zu den Ergebnissen mit einem Qiagen Circulating Nucleic Acids Kit (nicht gezeigt). <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die TruTip Extraktion und Workflow, unabhängig von der Liquid-Handling-System. Andere Probenvorbereitung und Liquid-Handling Schritte können in automatisierte Routinen abhängig von den Fähigkeiten des jeweiligen Instruments und Liquid-Handling-Software eingearbeitet werden. <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2.jpg" /> Abbildung 2. (A) Eppendorf epMotion 5070 Probenteller Layout. (B) Arrangement von Reagenzien / ConsumaBles auf dem Arbeitstisch. Die Probe Platte kann konfiguriert werden für bis zu 24 Proben (Spalten 1, 5 bzw. 9), obwohl die epMotion nur bearbeiten, werden maximal 8 Proben gleichzeitig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3.jpg" /> Abbildung 3. Hamilton STAR Deckslayout zur Reinigung von genomischer DNA aus Vollblut (nicht maßstabsgetreu) Deck Position 1 = 1 ml Hamilton gefiltert Tipps;. 2 = 1 ml Hamilton nicht gefilterten Tipps, 3 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 2 mm TruTips; 4 = Eingang Blutprobe Trägern (Blutentnahme-oder Mikrozentrifugengefäße); 5-9 = 290 ml Reagenz Tröge für Lysis Buffer F, Ethanol, Waschpuffer J, K Wash Buffer und Elution Buffer A2, bzw., 10 = 96 dEEP gut Binding Platte; 11 = 96 Tiefbrunnen waschen J; 12 = 96 Tiefbrunnen waschen K; 13 = 96 Tiefbrunnen Elution Platte; 14 = Hamilton HHS2 Heizung / Shaker mit Nunc 96 Tiefbrunnen Inkubationsplatte; 15 = 50 ml Reagenz Trog Zusatz von Proteinase K. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig3large.jpg" target="_blank">Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4.jpg" /> Abbildung 4. Hamilton STARPLUS Deckslayout zur Reinigung von DNA aus großvolumigen Plasma-Proben (nicht maßstabsgetreu). Das System ist mit 8 x 5 ml Kanälen und 8 x 1 ml Kanäle (nicht in der Deck-Layout dargestellt) ausgestattet. Deck Position 1 = Hamilton 4 ml filtriert Tipps, 2 = Akonni / Hamilton 5 ml TruTips; 3 = Quelle Plasmaproben, 4 = 50 ml konische Röhrchen, 5 = 120 ml Reagenz Tröge mit CN-W1, W2 und CN-CN-W4 Reagengen; 6 = Low-Volume-Reagenz Tröge mit Proteinase K, CN-B2, CN-B3, EBA2, EBB und CN-W3 Reagenzien; 7 = 290 ml Reagenz Trog mit CN-L1 Reagenz, 8 = 290 ml Reagenz Trog mit CN B1-Reagenz, 9 = 96 Deep Well Platten für Schritt 1, 10 = 96 Deep Well Platten für Schritt 2; 11 = Probenträger für gereinigten Endprodukt; 12 = 1 ml Hamilton ungefilterten Tipps; 13 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 4 mm TruTips. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig4large.jpg" target="_blank">Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5.jpg" /> Abbildung 5. (A). Echtzeit-PCR-Ergebnisse von automatisierten TruTip Extraktion von Influenza-Virus ergänzt in Nasen-Rachen absaugen (NPA). Eingang NPA volume = 100 ul, Elutionsvolumen = 50 ul. Ergebnisse sind der Durchschnitt von 3 replizieren extractions von 5 verschiedene Hintergründe NPA (n = 15) pro Verdünnung Ebene und Grippe vorbei. qPCR wurde auf dem LightCycler ® 480 System mit Assaybedingungen zuvor beschrieben 15 durchgeführt. (B) Keine Kreuzkontamination wird erkannt, wenn 12 positive Proben ohne NPA-Template-Kontrollen und vorbehaltlich der automatisierten Extraktion durchsetzt sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig5large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6.jpg" /> Abbildung 6. Ergebnisse von menschlicher genomischer DNA Extraktion aus Vollblut. A) UV-Vis-Spuren aus einem ND-1000 (ThermoFisher) von 10 zufällig ausgewählten repliziert. B) 1% Agarosegel von TruTip gereinigte gDNA. M = Fisher 24 kb Max DNA Ladder. Die Bahnen 1 - 4 = ~ 100 ng gereinigte gDNA aus vier zufällig ausgewählte repliziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig6large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 7" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7.jpg" /> Abbildung 7. Echtzeit-PCR-Ergebnisse aus acht replizieren TruTip Extraktionen frei zirkulierender DNA aus Plasma. Proben durch Sternchen (* oder **) bezeichnet wurden an unterschiedlichen Tagen extrahiert. CHY quantifiziert männlichen fetalen DNA quantifiziert und CH1 Gesamt-DNA vorhanden ist (Mutter und Kind). qPCR wurde auf einem LightCycler 480 System (Roche) mit bisher veröffentlichten Tests Targeting CHY und CH1 18 durchgeführt.

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High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip ist eine einfache Extraktion von Nukleinsäuren Technologie, bei der eine poröse, monolithische Bindematrix in eine Pipettenspitze eingesetzt ist. Folglich ist die Probenvorbereitung Format kompatibel mit den meisten Liquid Handling Geräte, und kann für viele mittel-bis High-Throughput-klinische Anwendungen und Probe-Typen verwendet werden.

Hochdurchsatz-, Automated Extraktion von DNA und RNA aus klinischen Proben mit TruTip Technologie Gemeinsames Liquid Handling Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

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34.4K Aufrufe.  Akonni Biosystems, Inc.. TruTip ist eine einfache Extraktion von Nukleinsäuren Technologie, bei der eine poröse, monolithische Bindematrix in eine Pipettenspitze eingesetzt ist. Folglich ist die Probenvorbereitung Format kompatibel mit den meisten Liquid Handling Geräte, und kann für viele mittel-bis High-Throughput-klinische Anwendungen und Probe-Typen verwendet werden.

Serie: High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: Eine Hochdurchsatz-96-Well-Plattform für Mess DNA-Schäden in menschlichen Zellen Microarray

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Forschung

Biotechnik

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Verwendung Tomoauto: Ein Protokoll für die Hochdurchsatz-Automated Kryo-Elektronentomographie

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Automatisierte Roboter Liquid Handling Versammlung Modular DNA-Geräte

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of bioprocess conditions. One important aspect is the improvement of cultivation medium to provide an optimal environment for microbial formation of the product of interest. It is well accepted that the media composition can dramatically influence overall bioprocess performance. Nutrition medium optimization is known to improve recombinant protein production with microbial systems and thus, this is a rewarding step in bioprocess development. However, very often standard media recipes are taken from literature, since tailor-made design of the cultivation medium is a tedious task that demands microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, fast product analytics, as well as support by lab robotics to enable reliability in liquid handling steps. Furthermore, advanced mathematical methods are required for rationally analyzing measurement data and efficiently designing parallel experiments such as to achieve optimal information content.
The generic nature of the presented protocol allows for easy adaption to different lab equipment, other expression hosts, and target proteins of interest, as well as further bioprocess parameters. Moreover, other optimization objectives like protein production rate, specific yield, or product quality can be chosen to fit the scope of other optimization studies. The applied Kriging Toolbox (KriKit) is a general tool for Design of Experiments (DOE) that contributes to improved holistic bioprocess optimization. It also supports multi-objective optimization which can be important in optimizing both upstream and downstream processes.

This manuscript describes a generic approach for tailor-made design of microbial cultivation media. This is enabled by an iterative workflow combining Kriging-based experimental design and microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, which is supported by lab robotics to increase reliability and speed in liquid handling media preparation.

Generischen Protokoll zur Optimierung der heterologen Proteinproduktion mit automatisierten Microbioreactor Technologie

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or lethality. However, the probability of a synthetic small molecule being bioactive is low; therefore, thousands of molecules must be tested in order to find those of interest. Liquid handling robotics systems are designed to handle large numbers of samples, increasing the speed with which a chemical library can be screened in addition to minimizing/standardizing error. To achieve a high-throughput forward chemical genetics screen of a library of 50,000 small molecules on Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocols using a bench-top multichannel liquid handling robot were developed that require minimal technician involvement. With these protocols, 3,271 small molecules were discovered that caused visible phenotypic alterations. 1,563 compounds induced short roots, 1,148 compounds altered coloration, 383 compounds caused root hair and other, non-categorized, alterations, and 177 compounds inhibited germination.

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

A high throughput screen of synthetic small molecules was conducted on the model plant species, Arabidopsis thaliana. This protocol, developed for a liquid handling robot, increases the speed of forward chemical genetics screens, accelerating the discovery of novel small molecules affecting plant physiology.

Optimierung der Nutzung eines Liquid Handling Roboters, einen hohen Durchsatz nach vorn Chemische Genetik Bildschirm von Arabidopsis Thaliana durchzuführen

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Einsatz von Hochdurchsatz-automatisierte Microbioreactor-System für die Produktion des Modells IgG1 in CHO-Zellen

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain selection and by developing bioprocess parameters. Shake flasks have been used for this purpose. They, however, lack the capability to control the process parameters such as pH and dissolved oxygen (DO). This limitation can be overcome with the help of an automated micro-bioreactor. These bioreactors mimic cultivation at a larger scale. One of the major advantages of this system is the integration of the Design of Experiment (DOE) in the software. This integration enables establishing a design where multiple process parameters can be varied simultaneously. The critical process parameters and optimum bioprocess conditions can be analyzed within the software. The focus of the work presented here is to introduce the user to the steps involved in process design in the software and incorporation of the DOE within the cultivation run.

Here, we present a detailed procedure to run a Design of Experiment in an automated micro-bioreactor followed by cell harvest and protein quantification using a Protein A column.

Prozessoptimierung mit automatisierten Mikro-Bioreaktoren mit hohem Durchsatz in der chinesischen Hamster-Ovarialzell-Kultivierung

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

Hefestamm-Phänotypisierung mit Droplet-basierter RNA-Sequenzierung mit hohem Durchsatz

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Analyse der optogenetischen Reaktion der Hefe mit der Lusto-Automatisierungstechnik

High-Throughput Optogenetics Experiments in Yeast Using the Automated Platform Lustro

Optogenetics offers precise control over cellular behavior by utilizing genetically encoded light-sensitive proteins. However, optimizing these systems to achieve the desired functionality often requires multiple design-build-test cycles, which can be time-consuming and labor-intensive. To address this challenge, we have developed Lustro, a platform that combines light stimulation with laboratory automation, enabling efficient high-throughput screening and characterization of optogenetic systems.
Lustro utilizes an automation workstation equipped with an illumination device, a shaking device, and a plate reader. By employing a robotic arm, Lustro automates the movement of a microwell plate between these devices, allowing for the stimulation of optogenetic strains and the measurement of&#160;their response. This protocol provides a step-by-step guide on using Lustro to characterize optogenetic systems for gene expression control in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. The protocol covers the setup of Lustro&#39;s components, including the integration of the illumination device with the automation workstation. It also provides detailed instructions for programming the illumination device, plate reader, and robot, ensuring smooth operation and data acquisition throughout the experimental process.

Autor im Rampenlicht: Förderung der Optogenetik-Forschung mit Lustro 

This protocol outlines the steps for utilizing the automated platform Lustro to perform high-throughput characterization of optogenetic systems in yeast.

Hochdurchsatz-Optogenetik-Experimente in Hefe mit der automatisierten Plattform Lustro

Optogenetics offers precise control over cellular behavior by utilizing genetically encoded light-sensitive proteins. However, optimizing these systems to ...