Parti di questo lavoro sono stati sostenuti dal National Institutes of Health (NIH) in concessione R 44 AI072784. Ringraziamo il Dr. Kirsten San Giorgio, Sara B. Griesemer, Daryl Lamson e Amy Dean del Laboratorio di virologia, Wadsworth Center, New York State Dipartimento di Sanità per virioni influenzali quantificati e l&#39;accesso ai clinicamente validato influenza in tempo reale PCR.

<ol>
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Gli autori sono dipendenti di Akonni Biosystems, Inc. che producono materiali utilizzati in questo articolo. Accesso libero e produzione di questo articolo è sponsorizzato da Akonni Biosystems, Inc.

La semplicità del concetto TruTip e workflow (Figura 1) lo rendono facilmente adattabile, automatizzato, efficiente ed efficace per una serie di matrici di campioni clinici, volumi di campionamento in ingresso, e sistemi di manipolazione dei liquidi. Va riconosciuto, tuttavia, che ogni campione clinico è unico, e varierà uno all&#39;altro in viscosità, particolati, muco, contaminanti, microbici, e / o sfondi genetiche umane. Dato variazioni previste nella composizione del campione clinico e usi previsti per un protocollo di preparazione del campione TruTip automatizzato, può quindi essere necessario modificare alcuni passaggi in una procedura TruTip al fine di ottenere i risultati desiderati per un tipo specifico campione. Indipendentemente dal tipo di campione, tuttavia, TruTip parametri che in genere hanno l&#39;impatto più significativo sulla purezza dell&#39;acido nucleico e / o recupero comprendono: <ol><li> Campione miscelazione ed omogeneizzazione con tampone di lisi (e alcool). Mentre TruTips hanno una rilatively grande dimensione dei pori, omogeneizzazione del campione e liquefazione è molto importante per la lisi cellulare efficiente, e le successive fasi di legame alla TruTip monolito. Con un lisato omogeneo e ben liquefatto, i campioni possono muoversi attraverso il TruTip con portate maggiori, il che riduce il tempo di elaborazione del campione complessivo. Il grande volume di plasma protocollo dimostra il potenziale per gli utenti di omogeneizzare accuratamente e liquefare campioni difficili (on-line o off-line), nonostante il volume del campione di ingresso di grandi dimensioni. </li><li> Portate. Portate più lenti durante legame dell&#39;acido nucleico o l&#39;eluizione tipicamente producono una maggiore resa di acido nucleico, sia pure a scapito del tempo di elaborazione totale. Portate più lenti possono anche ridurre l&#39;entità del taglio del DNA. </li><li> Numero di cicli. Il numero ottimale di aspirazione e dispensazione dei cicli dipende dal tipo di campione, il volume totale del campione e le portate. Fase 1 nella figura 1 è tipicamente il punto in cui il ciclo numbers (e portata) può richiedere alcuni ottimizzazione empirica, con campioni come nasofaringeo (Figura 5) rappresenta uno dei lisati più impegnative per ottimizzare dovuto la gamma di NPA viscosità da pazienti diversi. </li><li> Asciugatura. Completa asciugatura della TruTip monolite è indispensabile per evitare che residui di solventi organici da co-eluizione con il campione di acido nucleico purificato e processi a valle inibendo o prove. Perché TruTip non viene essiccato tramite centrifugazione o filtrazione sotto vuoto, è importante massimizzare sia la portata e numeri del ciclo durante la fase di essiccazione. A volte c&#39;è una goccia residuo di soluzione di lavaggio sul capolinea del TruTip dopo i cicli di essiccazione sono stati completati. La Hamilton robot ha la capacità di effettuare un &quot;tocco punta&quot; sul lato del pozzo per rilasciare la gocciolina, assicurando così una eluizione solventi. Il sistema epMotion non ha questa funzione, ma un pre-risciacquo del capolinea TruTip a elution tampone può essere programmato per ottenere lo stesso effetto. </li></ol> Perchè la geometria, materiale pipetta punta, e il metodo di fissaggio ai bracci robotici canale sono unici per ogni marca di strumenti, è richiesto un diverso costrutto TruTip per ogni sistema di gestione dei liquidi. Le dimensioni monolite TruTip (diametro, spessore e dimensione dei pori) sono correlate con l&#39;acido nucleico capacità di legame (e l&#39;efficienza di eluizione), come previsto per qualsiasi tecnica di estrazione in fase solida. Mentre spessi (&gt; 4 mm), matrici possono essere incorporati in un TruTip 1 ml di acido nucleico per aumentare capacità di legame per campioni di grande volume e / o equalizzare la capacità di legame di tutti i formati TruTip specifici, vi è un compromesso tra lo spessore TruTip e portate durante la fase di legame iniziale (in presenza di lisati greggio). Così, a volte è vantaggioso incorporare monoliti di diametro maggiore in grandi volumi puntali per le fasi iniziali di un protocollo automatizzato, (ad es &lt;/ Em&gt; i 5 ml Hamilton / Akonni TruTips per estrazioni di grande volume). Date le configurazioni TruTip specifiche dettate dai costruttori di robot di manipolazione dei liquidi, tuttavia, non necessariamente aspettiamo TruTip rendimenti di acidi nucleici per essere identici per tutte le piattaforme di gestione dei liquidi di diversi produttori, o attraverso diverse dimensioni TruTip. Campioni clinici (per definizione) conterranno quantità significative di DNA genomico umano a meno che non sono acquisite da siti normalmente sterili (ad esempio liquido cerebro-spinale). A volte il DNA genomico umano è desiderato (come in figura 6), mentre in altre applicazioni del DNA umano rappresenta un fondo genomico indesiderato (come per la Figura 5). La presenza di DNA di sfondo non è solitamente problematico finché la quantità totale di acido nucleico nel campione non supera la capacità di legame del monolito, e il DNA sfondo può servire come un trasportatore, se il nucleico target desideratoacido è presente in tracce. L&#39;obiettivo del protocollo di estrazione del plasma ad alta disponibilità (Figura 7) è isolare (frammentato) DNA fetale in presenza di un eccesso di piega 10-20 DNA materno, che è simile all&#39;obiettivo preparazione del campione di test di malattie infettive tranne che le sequenze sono altamente congruenti e possono essere distinti da collaudo molecolare altamente specifico e / o di discriminazione dimensione. In questo caso, il DNA totale circolante viene isolato utilizzando un 5 ml TruTip, e successiva DNA fetale peso molecolare elevato e basso peso molecolare vengono separati mediante eluizione e successivo legame ad un 1 ml TruTip alterando le condizioni del tampone di legame. Separazione dimensionale selettivo e arricchimento di acidi nucleici bersaglio in base alle loro proprietà di legame e di eluizione di un monolito di silice è una modalità di azione significativamente diverso rispetto raggiunto da membrane o esclusione dimensionale colonne di rotazione. Separazione dimensione e l&#39;arricchimento del DNA microbico da DNA genomico umano può essere unccomplished in future applicazioni tramite la personalizzazione TruTip vincolante e tamponi di eluizione. I protocolli automatizzati dimostrato qui sottolineare l&#39;utilità del TruTip monolite stesso per l&#39;elaborazione di diversi campioni clinici, e come può essere adattato per grandi volumi e specifiche robot di manipolazione dei liquidi. I metodi semplificati di solito sfociano in protocolli di estrazione più veloce rispetto ad altri sistemi automatizzati. La semplicità della tecnologia TruTip, tuttavia, offre anche alcuni vantaggi di costo per coloro che sono interessati all&#39;acquisto di un nuovo sistema automatizzato di purificazione acido nucleico, perché l&#39;hardware primaria necessaria per l&#39;automazione delle procedure TruTip è il braccio pipetta canale stesso, piuttosto che barrette magnetiche, sistemi per il vuoto , oppure a bordo centrifughe. Utilizzando le piastre dei reagenti preriempite può anche ridurre lo spazio e materiali di consumo necessari, e raddoppiare la velocità per corsa. Riducendo al minimo spazio della piattaforma con i protocolli TruTip consente inoltre agli utenti avanzati di integrare a monte o dprocessi automatizzati ownstream con il TruTip. Per esempio soluzione easyBlood di Hamilton al sangue intero frazionare può essere incorporato con il metodo di estrazione TruTip automatizzato, che sarebbe snellire significativamente i processi bio-banking. Processi di post-estrattivi, come la quantificazione degli acidi nucleici, la normalizzazione, PCR set-up, o sequenziamento del DNA sono anche facilmente integrati con TruTip sulle grandi piattaforme di gestione dei liquidi.

Nucleico purificazione acido è necessario per la diagnostica molecolare più, uso di ricerca, e le applicazioni delle scienze della vita. Vari approcci sono emerse dopo il tempo di fenolo / cloroformio, molte delle quali sono basate sul principio fondamentale di legame alla silice in presenza di sali di acido nucleico caotropici 1. Il processo di estrazione è stato semplificato e automatizzato attraverso l&#39;uso di vari formati di perline e membrana a base, con filtri rotativi, perline magnetiche e approcci connessi dominano il settore delle scienze della vita (vedi esempi in 2-13). Mentre efficace, le particelle e le membrane hanno conosciuto limiti quando si confronta con le matrici clinici difficili. Per esempio, le membrane e colonne bead-based sono compliant, hanno piccole dimensioni dei pori (quindi, elevate pressioni di schiena), e richiedere un certo tipo di sostegno al fine di essere trasformati con un sistema di centrifugazione o di vuoto. Le caratteristiche fisiche di membrane e colonne tallone risultato insignificativa resistenza fluida, che limita il tipo di campioni che possono essere elaborati in modo efficiente senza intasare il consumo, e / o il volume totale (input) di esempio che può essere unidirezionalmente elaborati attraverso il percorso di flusso. Viceversa, particelle magnetiche devono essere distribuiti in tutto il campione mediante agitazione. La necessità di distribuire omogeneamente particelle magnetiche all&#39;interno di una soluzione limita il volume del campione totale di ingresso che può essere elaborato con i materiali di consumo di perline più magnetici. Esempio di attributi clinici (quali viscosità o complessità) può portare ad una concentrazione inefficiente particella magnetica sul lato di un tubo o asta. Inoltre, silice polveri sottili possono staccarsi delle perline durante il processo di estrazione, perdendo la loro magnetizzazione e contaminare il campione finale. La tecnologia TruTip stata sviluppata per superare alcuni di questi vincoli di acido nucleico campione e limiti di lavorazione 14. Incorporando un monolite poroso all&#39;interno di unpunta di pipetta, fluidico contropressione si abbassa, che permette il controllo del flusso di aspirazione (cioè pipetta di aspirazione). Questa caratteristica consente al processo di estrazione e strumentazione necessaria per purificare acidi nucleici da tipi di campioni difficili essere notevolmente semplificato (Figura 1). La geometria e la porosità del monolito è su misura per minimizzare intasamento, mentre lo spessore del monolito fornisce sufficiente acido nucleico capacità di legame per volumi di campione che vanno 1,0-5,0 ml. Flusso bidirezionale durante l&#39;aspirazione del campione e di erogazione consente tempi di residenza prolungati tra il campione e il monolito vincolante per efficiente recupero di acido nucleico e di eluizione, e consente relativamente grandi volumi di campione da lavorare che superi la capacità di volume del puntale stesso. Abbiamo precedentemente riportato lo sviluppo e l&#39;applicazione di una procedura TruTip manuale per la purificazione di RNA di influenza da campioni del rinofaringe utilizzando un singolo o multi-canale Rainin pipetta 15. Efficienze di estrazione equivalenti sono stati ottenuti tra automatizzato QIAcube e metodi TruTip manuali a 10 6 copie del gene influenza A per ml aspirato nasofaringeo. L&#39;obiettivo di questo studio era di dimostrare a medio e alto-rendimento, automatizzati TruTip nucleici procedure di purificazione di acidi per aspirato nasofaringeo (NPA) e altri tipi di campioni clinicamente rilevanti, utilizzando robot di manipolazione dei liquidi che si trovano comunemente nei laboratori clinici di riferimento.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips)</td>
			<td>Akonni Biosystems, Inc.</td>
			<td>300-11120</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC615110040</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99% Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270725-4L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir, 30 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>960050100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep well plate 96/2,000 &mu;l</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>30502302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 &mu;l</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>960050100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epMotion 5070 System</td>
			<td rowspan="3">Eppendorf</td>
			<td>5070 000.000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing tool TM1000-8</td>
			<td>960001061</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir rack</td>
			<td>960002148</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips)</td>
			<td>Akonni Biosystems, Inc.</td>
			<td>300-20341</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC615110040</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>AMRESCO LLC</td>
			<td>E195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>235905</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>235904</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Reagent Trough</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>187297</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Well 2 ml plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1896-2800</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96 DWP-2 ml</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>27874</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Trough</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-222-412</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton STAR System</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173027</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173081/173050</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml 96-channel head</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>199090</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182085</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Carriers/Inserts</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173400/182238</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182090</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiflex Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188039</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HHS2 Heater Shaker Unit</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>199033</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips)</td>
			<td>Akonni Biosystems, Inc.</td>
			<td>Call to inquire</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459828-1L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC327270010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>AMRESCO LLC</td>
			<td>E195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered 4 ml Tips</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>184022</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unfiltered 1 ml Tips</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>235939</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Deep Well Plates</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1896-2800</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tubes</td>
			<td>Corning/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-526B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Reagent Troughs</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>187297</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 ml Reagent Troughs</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182703</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Volume 96-Pos Reagent Troughs</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-222-412</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173025/190012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Independent Pipette Channels / Arm</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173081/173052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Independent Channel / Modular Arm</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>184090/173050</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182090</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiflex Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188039</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 ml Reagent trough carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>185290</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182085</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Tube Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182245</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Position Sample Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173400</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 Position Sample Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173410</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput, automated extraction of dna and rna from clinical samples using trutip technology on common liquid handling robots

TruTip è una tecnologia semplice estrazione degli acidi nucleici in cui una porosa, monolitica matrice legante viene inserito in una punta di pipetta. La geometria del monolite può essere adattato per specifici puntali variano nel volume di 1,0-5,0 ml. La grande porosità del monolite consente campioni viscosi o complessi di passare facilmente attraverso di esso con la minima contropressione fluidico. Flusso bidirezionale massimizza il tempo di permanenza tra il monolito e il campione, e consente grandi volumi di campione da elaborare all&#39;interno di un singolo TruTip. I passi fondamentali, indipendentemente dal volume di campione o geometria TruTip, includono la lisi cellulare, vincolante per i pori interni della TruTip monolite acido nucleico, lavando via i componenti del campione non legato e buffer di lisi e eluizione di acidi nucleici purificati e concentrati in un tampone appropriato. Gli attributi e le capacità di adattamento di TruTip sono dimostrate in tre protocolli di trattamento del campione clinici automatici utilizzando un epMotion Eppendorf 5070, STARPLUS robot di manipolazione dei liquidi, inclusi l&#39;isolamento dell&#39;RNA da aspirato nasofaringeo, estrazione di DNA genomico da sangue intero, e l&#39;estrazione del DNA fetale e arricchimento da grandi volumi di plasma materno (rispettivamente) e Hamilton STAR.

Dati real-time PCR per l&#39;influenza RNA da NPA sono mostrati in Figura 5A. Acido nucleico efficienza di estrazione stimato è simile ai risultati ottenuti con la versione manuale del protocollo 15. Una risposta lineare in media valori di C t è osservata tra 10 4 e 10 6 copie del gene ml -1 modificato influenza (R 2 = rispettivamente 0,99 e 0,98 per l&#39;influenza A e B,), con deviazioni standard in media C t valori inferiori a 1 ciclo. L&#39;assenza di contaminazione incrociata con il sistema epMotion è dimostrato in Figura 5B, dove 12 campioni NPA positivi contenenti 10 6 copie del gene ml -1 NPA sono stati intervallati con 12 spazi tampone. Il C t media per i controlli positivi era 30,16 ± 0,14, e tutti gli spazi del buffer sono stati negativi. Il tempo di elaborazione totale del campione è 16, 28 e 40 min per 8, 16 e 24 campioni, rispettivamente.Poiché un tipico nasofaringeo clinico o tampone conterrà 10 7 gene copie ml -1 (supponendo 1.000 virioni per TCID 50 16 e&gt; 10 4 TCID 50 ml -1 influenzale 17), il protocollo epMotion automatizzata dovrebbe essere efficace su una maggioranza di esemplari NPA clinici. Data la gamma dei test molecolari condotti su DNA genomico umano, l&#39;obiettivo primario di estrazione degli acidi nucleici da sangue intero è produrre senza contaminanti, ad alto peso molecolare del DNA genomico. Il protocollo automatizzato per 96 campioni è completata entro 1 ora, che è un miglioramento rispetto altri sistemi automatizzati (ad es Promega MagneSil = 90 min e Qiagen QIAamp DNA Sangue BioRobot sistema MDx = 2,5 hr). Figura 6A mostra i profili di assorbanza UV / Vis per 45 campioni di sangue positivi trattati contemporaneamente con 45 reagenti bianchi sul protocollo Hamilton STAR, con una media A <sub&gt; 260/280 rapporto di 1,96 e media A 260/230 rapporto di 1,93. Un A 260/280 rapporto tra 1,7-2,0 e A 260/230 rapporto&gt; 1,7 sono in genere indicativo di DNA molto pura, priva di sali residui, proteine ​​o solventi, e accettabile per le applicazioni molecolari più a valle. Il gel di agarosio 1% in Figura 6B mostra che il gDNA risultante è di alto peso molecolare (&gt; 24 kb), con minima tranciatura. La resa media di acido nucleico, dal set di 45 campioni positivi è 5,26 ± 0,46 mg di DNA umano per 200 ml di sangue intero, sulla base della Life Technologies Quantifiler umana quantificazione Kit DNA. Studi cross-contaminazione simili a quelli mostrati nella Figura 5B sono state effettuate con sbozzati tampone controllo negativo intervallati da campioni positivi ed estratta in parallelo; tutti gli spazi erano nuovamente negativi mediante PCR (non mostrato). Il gDNA purificato è inoltre adatto per numerose altre analisi basate sulla PCR (non mostrato). Risultati in tempo reale da otto campioni replicati di un campione di plasma materno pooled processato con la procedura TruTip grande volume sono mostrati in Figura 7. Il protocollo completo (compreso off-line proteinasi K incubazione) è finito in circa 2,5 ore, simile al manuale Qiagen circolazione nucleici Kit Acids (senza kit di estrazione automatizzati comparabili sono ancora disponibili). I valori medi C t oltre tutte le repliche sono 34,58 ± 0,66 e 29,76 ± 0,50 per il maschio fetale (CHY) e DNA totale (CH1), rispettivamente, che dimostra eccellente ripetibilità del metodo di estrazione automatica. La concentrazione di DNA fetale all&#39;interno della piscina DNA totale (in equivalenti genoma), viene calcolata sulla base del confronto analisi punto di adattamento agli standard, con la conseguente% DNA fetale media per tutti i campioni di 2,8%. Il DNA fetale effettivo% per questo campione è sconosciuto poiché i campioni sono stati aggregati prima di eseguire l&#39;estrazione. Composizione del DNA fetalecampioni di plasma in non aggregati estratti utilizzando il metodo TruTip sono tipicamente 1,5 volte superiore rispetto ai risultati con un kit Qiagen circolazione Acidi Nucleici (non mostrato). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1.jpg" /> Figura 1. Il processo di estrazione TruTip e flusso di lavoro, indipendentemente dal sistema di gestione dei liquidi. Altra preparazione del campione o fasi di manipolazione di liquidi possono essere incorporati nella routine automatizzate seconda delle capacità dello strumento di gestione dei liquidi e software specifici. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2.jpg" /> Figura 2. (A) Eppendorf epMotion 5070 campione layout di piastra. (B) Disposizione dei reagenti / ConsumaBles sul piano di lavoro. piatto del campione può essere configurato per un massimo di 24 campioni (colonne 1, 5 e 9, rispettivamente), anche se il epMotion elaborerà solo un massimo di 8 campioni simultaneamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3.jpg" /> Figura 3. Hamilton STAR disposizione della piattaforma per la purificazione di DNA genomico da sangue intero (non in scala) Deck posizione 1 = Hamilton 1 ml suggerimenti filtrato. 2 = Hamilton 1 ml suggerimenti non filtrati, 3 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 2 millimetri TruTips; 4 = ingresso vettori campione di sangue (provette o tubi microcentrifuga); 5-9 = 290 ml depressioni reagenti per Lysis Buffer F, Etanolo, il tampone di lavaggio J, K e il tampone di lavaggio tampone di eluizione A2, rispettivamente; 10 = 96 dEEP piastra ben Binding; 11 = 96 pozzo profondo Lavare J; 12 = 96 pozzo profondo Lavare K; 13 = 96 Piatto fondo eluizione bene; 14 = Hamilton HHS2 riscaldatore / shaker con Nunc 96 profondo piastra di incubazione bene; 15 = 50 ml di reagente trogolo contenente proteinasi K. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4.jpg" /> Figura 4. Hamilton STARPLUS disposizione della piattaforma per purificare il DNA da campioni di plasma di grande volume (non in scala). Il sistema è dotato di 8 x 5 canali e 8 ml x 1 ml canali (non mostrato nel layout ponte). Deck Posizione 1 = Hamilton 4 ml punte filtrati; 2 = Akonni / Hamilton 5 ml TruTips; 3 = campioni di plasma di origine; 4 = 50 ml provette coniche; 5 = 120 ml depressioni reagenti contenenti CN-W1, W2 e CN-CN-W4 Reagenti; 6 = depressioni reagente a basso volume contenente proteinasi K, CN-B2, CN-B3, EBA2, EBB e CN-W3 reagenti; 7 = 290 ml attraverso reagente contenente reagente CN-L1; 8 = 290 ml di reagente recipiente contenente CN -B1 reagente; 9 = 96 pozzetti profondi per la Fase 1, 10 = 96 piatti fondi e per la fase 2, 11 = porta campioni per purificato, prodotto finale; 12 = Hamilton 1 ml suggerimenti non filtrate; 13 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 4 TruTips mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5.jpg" /> Figura 5. (A). PCR in tempo reale i risultati di estrazione TruTip automatizzata del virus dell&#39;influenza aggiunte in aspirato nasofaringeo (NPA). INPUT VOLUME NPA = 100 l, volume di eluizione = 50 ml. Risultati sono la media di 3 replicare extractions da 5 distinti ambiti di NPA (n = 15) per livello di diluizione e di destinazione influenza. qPCR è stata eseguita sul sistema LightCycler 480 con condizioni descritte in precedenza 15. (B) n contaminazione incrociata viene rilevata quando 12 campioni NPA positivi si alternano senza controlli template e sulla base della procedura di estrazione automatica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6.jpg" /> Figura 6. Risultati di estrazione di DNA genomico umano da sangue intero a.) Tracce UV-visibile da un NanoDrop 1000 (ThermoFisher) di 10 selezionati in modo casuale repliche. B) 1% gel di TruTip purificato gDNA. M = Fisher 24 kb Max DNA Ladder. Lanes 1-4 = ~ 100 ng purificato gDNA da quattro selezionati casualmente repliche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 7" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7.jpg" /> Figura 7. PCR in tempo reale i risultati di otto replica TruTip estrazioni di DNA circolante liberamente dal plasma. Campioni indicati da asterischi (* o **) sono stati estratti in giorni separati. CHY quantifica il DNA fetale maschio e CH1 quantifica il DNA totale presente (fetale e materna). qPCR è stata eseguita su un sistema 480 LightCycler (Roche) con saggi precedentemente pubblicati rivolte CHY e CH1 18.

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High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip è una tecnologia semplice estrazione degli acidi nucleici in cui una porosa, monolitica matrice legante viene inserito in una punta di pipetta. Conseguentemente, il formato preparazione del campione è compatibile con gli strumenti di manipolazione più liquidi, e può essere utilizzato per molte applicazioni cliniche medio-alto throughput e tipi di campione.

Ad alta velocità, l&#39;estrazione automatizzata di DNA e RNA da campioni clinici utilizzando la tecnologia TruTip su Robot Gestione liquidi comuni

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

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34.4K Views.  Akonni Biosystems, Inc.. TruTip è una tecnologia semplice estrazione degli acidi nucleici in cui una porosa, monolitica matrice legante viene inserito in una punta di pipetta. Conseguentemente, il formato preparazione del campione è compatibile con gli strumenti di manipolazione più liquidi, e può essere utilizzato per molte applicazioni cliniche medio-alto throughput e tipi di campione.

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CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: A High-throughput di 96-Well Piattaforma per la misurazione dei danni cagionati DNA in cellule umane Microarrayed

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

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Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Usando Tomoauto: un protocollo per High-throughput automatizzato Cryo-elettrone Tomografia

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Automatizzato robot Liquid Handling Assembly di dispositivi modulari del DNA

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of bioprocess conditions. One important aspect is the improvement of cultivation medium to provide an optimal environment for microbial formation of the product of interest. It is well accepted that the media composition can dramatically influence overall bioprocess performance. Nutrition medium optimization is known to improve recombinant protein production with microbial systems and thus, this is a rewarding step in bioprocess development. However, very often standard media recipes are taken from literature, since tailor-made design of the cultivation medium is a tedious task that demands microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, fast product analytics, as well as support by lab robotics to enable reliability in liquid handling steps. Furthermore, advanced mathematical methods are required for rationally analyzing measurement data and efficiently designing parallel experiments such as to achieve optimal information content.
The generic nature of the presented protocol allows for easy adaption to different lab equipment, other expression hosts, and target proteins of interest, as well as further bioprocess parameters. Moreover, other optimization objectives like protein production rate, specific yield, or product quality can be chosen to fit the scope of other optimization studies. The applied Kriging Toolbox (KriKit) is a general tool for Design of Experiments (DOE) that contributes to improved holistic bioprocess optimization. It also supports multi-objective optimization which can be important in optimizing both upstream and downstream processes.

This manuscript describes a generic approach for tailor-made design of microbial cultivation media. This is enabled by an iterative workflow combining Kriging-based experimental design and microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, which is supported by lab robotics to increase reliability and speed in liquid handling media preparation.

Protocollo generico per l'ottimizzazione della produzione di proteine eterologhe utilizzando tecnologia automatizzata di Microbioreactor

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or lethality. However, the probability of a synthetic small molecule being bioactive is low; therefore, thousands of molecules must be tested in order to find those of interest. Liquid handling robotics systems are designed to handle large numbers of samples, increasing the speed with which a chemical library can be screened in addition to minimizing/standardizing error. To achieve a high-throughput forward chemical genetics screen of a library of 50,000 small molecules on Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocols using a bench-top multichannel liquid handling robot were developed that require minimal technician involvement. With these protocols, 3,271 small molecules were discovered that caused visible phenotypic alterations. 1,563 compounds induced short roots, 1,148 compounds altered coloration, 383 compounds caused root hair and other, non-categorized, alterations, and 177 compounds inhibited germination.

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

A high throughput screen of synthetic small molecules was conducted on the model plant species, Arabidopsis thaliana. This protocol, developed for a liquid handling robot, increases the speed of forward chemical genetics screens, accelerating the discovery of novel small molecules affecting plant physiology.

Ottimizzare l'utilizzo di un Robot di manipolazione liquido per condurre un alto Throughput avanti chimica genetica schermo di Arabidopsis thaliana

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Uso di High-Throughput Microbioreactor sistema automatizzato per la produzione del modello IgG1 in cellule CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain selection and by developing bioprocess parameters. Shake flasks have been used for this purpose. They, however, lack the capability to control the process parameters such as pH and dissolved oxygen (DO). This limitation can be overcome with the help of an automated micro-bioreactor. These bioreactors mimic cultivation at a larger scale. One of the major advantages of this system is the integration of the Design of Experiment (DOE) in the software. This integration enables establishing a design where multiple process parameters can be varied simultaneously. The critical process parameters and optimum bioprocess conditions can be analyzed within the software. The focus of the work presented here is to introduce the user to the steps involved in process design in the software and incorporation of the DOE within the cultivation run.

Here, we present a detailed procedure to run a Design of Experiment in an automated micro-bioreactor followed by cell harvest and protein quantification using a Protein A column.

Ottimizzazione dei processi mediante microreattori automatizzati ad alta velocità effettiva nella coltivazione delle cellule ovaio dell'ammasso cinese

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

Phenotipizzazione del ceppo di lievito ad alta velocità effettiva con sequenziamento dell'RNA basato su droplet

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Generazione di condizioni ambientali dinamiche utilizzando un dispositivo microfluidico ad alta produttività

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Analisi della risposta optogenetica del lievito utilizzando la tecnica di automazione Lustro

High-Throughput Optogenetics Experiments in Yeast Using the Automated Platform Lustro

Optogenetics offers precise control over cellular behavior by utilizing genetically encoded light-sensitive proteins. However, optimizing these systems to achieve the desired functionality often requires multiple design-build-test cycles, which can be time-consuming and labor-intensive. To address this challenge, we have developed Lustro, a platform that combines light stimulation with laboratory automation, enabling efficient high-throughput screening and characterization of optogenetic systems.
Lustro utilizes an automation workstation equipped with an illumination device, a shaking device, and a plate reader. By employing a robotic arm, Lustro automates the movement of a microwell plate between these devices, allowing for the stimulation of optogenetic strains and the measurement of&#160;their response. This protocol provides a step-by-step guide on using Lustro to characterize optogenetic systems for gene expression control in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. The protocol covers the setup of Lustro&#39;s components, including the integration of the illumination device with the automation workstation. It also provides detailed instructions for programming the illumination device, plate reader, and robot, ensuring smooth operation and data acquisition throughout the experimental process.

Autore in primo piano: Far progredire la ricerca in optogenetica con Lustro 

This protocol outlines the steps for utilizing the automated platform Lustro to perform high-throughput characterization of optogenetic systems in yeast.

Esperimenti di optogenetica ad alto rendimento nel lievito utilizzando la piattaforma automatizzata Lustro

Optogenetics offers precise control over cellular behavior by utilizing genetically encoded light-sensitive proteins. However, optimizing these systems to ...