חלקים מעבודה זו נתמכו על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) במסגרת המענק R 44 AI072784. אנו מודים לד&quot;ר קירסטן סנט ג&#39;ורג&#39;, שרה ב &#39;Griesemer, דריל Lamson ואיימי דיקן המעבדה למחלות ויראליות, Wadsworth Center, מחלקת מדינת ניו יורק בריאות לשפעת virions לכמת וגישה קלינית לתוקף שפעת בזמן אמת מבחני ה-PCR.

<ol>
	<li>Boom, R., Sol, C. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li><li>Baker, M. P., Mitchell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+genomic+DNA+from+blood+using+a+novel+filter-based+DNA+purification+technology.">Isolation of genomic DNA from blood using a novel filter-based DNA purification technology.</a> BioTechniques. 31, 142-145 (2001).</li><li>Sinclair, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+bead+or+not+to+bead:+applications+of+magnetic+bead+technology.">To bead or not to bead: applications of magnetic bead technology.</a> The Scientist. 12, 17-24 (1998).</li><li>Dederich, D. A., Okwuonu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glass+bead+purification+of+plasmid+template+DNA+for+high+throughput+sequencing+of+mammalian+genomes.">Glass bead purification of plasmid template DNA for high throughput sequencing of mammalian genomes.</a> Nucl. Acids Res. 30, e32 (2002).</li><li>Levison, P. R., Badger, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+of+magnetic+beads+for+use+in+nucleic+acid+purification.">Recent developments of magnetic beads for use in nucleic acid purification.</a> J. Chromatogr. A. 816, 107-111 (1998).</li><li>Hourfar, M. K., Schmidt, M., Seifried, E., Roth, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+automated+high-volume+extraction+method+for+viral+nucleic+acids+in+comparison+to+a+manual+procedure+with+preceding+enrichment.">Evaluation of an automated high-volume extraction method for viral nucleic acids in comparison to a manual procedure with preceding enrichment.</a> Vox Sang. 89, 71-76 (2005).</li><li>Perelle, S., Cavellini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+robotic+RNA+purification+protocol+based+on+the+NucliSens+easyMAG+for+real-time+RT-PCR+detection+of+hepatitis+A+virus+in+bottled+water.">Use of a robotic RNA purification protocol based on the NucliSens easyMAG for real-time RT-PCR detection of hepatitis A virus in bottled water.</a> J. Virol. Methods. 157, 80-83 (2009).</li><li>Riemann, K., Adamzik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+manual+and+automated+nucleic+acid+extraction+from+whole-blood+samples.">Comparison of manual and automated nucleic acid extraction from whole-blood samples.</a> J. Clin. Lab. Anal. 21, 244-248 (2007).</li><li>Hukari, K. W., Shultz, M., Isely, N., Milson, R., West, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+completely+automated+sample+preparation+instrument+and+consumable+device+for+isolation+and+purification+of+nucleic+acids.">A completely automated sample preparation instrument and consumable device for isolation and purification of nucleic acids.</a> J. Lab. Autom. 16, 355-365 (2011).</li><li>Kessler, H., M&#252;hlbauer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+nucleic+acid+extraction.">Fully automated nucleic acid extraction.</a> MagNA Pure LC. Clin. Chem. 47, 1124-1126 (2001).</li><li>Miller, S., Seet, H., Khan, Y., Wright, C., Nadarajah, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+QIAGEN+automated+nucleic+acid+extraction+methods+for+CMV+quantitative+PCR+testing.">Comparison of QIAGEN automated nucleic acid extraction methods for CMV quantitative PCR testing.</a> Am. J. Clin. Pathol. 133, 558-563 (2010).</li><li>Dundas, N., Leos, N. K., Mitui, M., Revell, P., Rogers, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+automated+nucleic+acid+extraction+methods+with+manual+extraction.">Comparison of automated nucleic acid extraction methods with manual extraction.</a> J. Mol. Diagn. 10, 311-316 (2008).</li><li>Kruh&#248;ffer, M., Voss, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+QIAsymphony+SP+workstation+for+magnetic+particle-based+nucleic+acid+purification+from+different+sample+types+for+demanding+downstream+applications.">Evaluation of the QIAsymphony SP workstation for magnetic particle-based nucleic acid purification from different sample types for demanding downstream applications.</a> J. Lab. Autom. 15, 41-51 (2010).</li><li>Belgrader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparatus,+system,+and+method+for+purifying+nucleic+acids.">Apparatus, system, and method for purifying nucleic acids.</a> United States Patent. , (2010).</li><li>Chandler, D. P., Griesemer, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+simple+influenza+RNA+extraction+from+nasopharyngeal+samples.">Rapid, simple influenza RNA extraction from nasopharyngeal samples.</a> J. Virol. Methods. 183, 8-13 (2012).</li><li>Chan, K. H., Lai, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+sensitivity+of+rapid+influenza+antigen+detection+tests+for+swine-origin+influenza+virus+(H1N1).">Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1).</a> J. Clin. Virol. 45, 205-207 (2009).</li><li>Chan, K. H., Lama, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analytical+sensitivities+of+six+rapid+influenza+A+antigen+detection+test+kits+for+detection+of+influenza+A.">Comparative analytical sensitivities of six rapid influenza A antigen detection test kits for detection of influenza A.</a> subtypes H1N1, H3N2 and. 38, 169-171 (2007).</li><li>Fan, H. C., Blumenfeld, Y. J., Chitkara, U., Hudgins, L., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+diagnosis+of+fetal+aneuploidy+by+shotgun+sequencing+DNA+from+maternal+blood.">Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 16266-16271 (2008).</li></ol>

הכותבים הם עובדים של Akonni Biosystems, Inc המייצרים חומרים המשמשים במאמר זה. הגישה החופשית ולהפקתו של מאמר זה היא בחסות Akonni Biosystems, Inc

הפשטות של מושג TruTip וזרימת העבודה (איור 1) להפוך אותו להתאים בקלות, אוטומטי, יעיל ואפקטיבי למספר מטריצות קליניות לדוגמה, כרכי מדגם קלט, ומערכות טיפול נוזל. יש להכיר בכך, עם זאת, כי בכל דגימה קלינית היא ייחודית, ומשתנה אחד למשנהו בצמיגות, חלקיקים, ליחה, משטח מזהמים, חיידקים, ו / או רקע גנטי אנושי. בהתחשב וריאציות צפויות בהרכב מדגם קליני ושימושים מיועדים של פרוטוקול הכנת מדגם TruTip אוטומטי, זה עשוי להיות לכן, יש לשנות את שלבים מסוימים בהליך TruTip על מנת להשיג תוצאות רצויות עבור סוג מדגם מסוים. ללא קשר לסוג המדגם, לעומת זאת, TruTip פרמטרים שיש להם השפעה המשמעותית ביותר על טוהר חומצות גרעין ו / או התאוששות כוללים בדרך כלל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמא ערבוב וhomogenization עם מאגר תמוגה (ואלכוהול). אמנם יש לי TruTips מחדשגודל latively גדול נקבובית, homogenization המדגם ועיבוי חשוב מאוד לתמוגה תא יעילה, ומחייבים צעדים הבאים למונולית TruTip. עם lysate הומוגנית והמעובה היטב, דגימות יכולות לעבור TruTip עם ספיקות גבוהות יותר, אשר מפחיתה את זמן עיבוד הדגימה הכולל. הנפח הגדול הפלזמה הפרוטוקול מדגים את הפוטנציאל למשתמשים homogenize יסודיות ונזל דגימות קשות (on-line או off-line), למרות נפח דגימת הקלט הגדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספיקות. ספיקות איטיות יותר במהלך מחייבים חומצות גרעין או elution בדרך כלל לגרום לתשואות גבוהות יותר חומצות גרעין, אם כי על חשבון זמן עיבוד כולל. ספיקות איטיות יותר עשויות גם להפחית את היקף גז ה-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספרי מחזור. המספר האופטימלי של שאיפה ולוותר מחזורים תלוי בסוג המדגם, כלל מדגם נפח, וספיקות. שלב 1 באיור 1 הוא בדרך כלל הנקודה שבה המחזור numbeRS (וספיקות) עשוי לדרוש אופטימיזציה אמפירית, עם דגימות כגון לשאוב אף ולוע (איור 5) המייצג את אחד מlysates המאתגרים יותר כדי לייעל בשל מגוון של צמיגויות NPA מחולים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבוש. ייבוש מלא של מונולית TruTip הוא הכרחי כדי למנוע ממסים אורגניים שיורית משיתוף עם משחררי מדגם מטוהר חומצות הגרעין ותהליכים במורד הזרם עיכוב או בדיקות. בגלל TruTip לא התייבש באמצעות צנטריפוגה או סינון ואקום, חשוב על מנת למקסם את שניהם קצב הזרימה ומספרי מחזור במהלך שלב הייבוש. לפעמים יש טיפת שייר של פתרון לשטוף בתחנה הסופית של TruTip לאחר מחזורי הייבוש הושלמו. יש המילטון הרובוט את היכולת לבצע &quot;מגע קצה&quot; בצד של הבאר לשחרר הטיפה, ובכך להבטיח elution חופשי ממס. מערכת epMotion אין תכונה זו, אך לפני שטיפה של התחנה הסופית TruTip באלחיץ ution ניתן לתכנת כדי להשיג את אותו האפקט. </li></ol> בגלל הגיאומטריה, חומר קצה פיפטה, ושיטת ההצמדה לזרועות רובוטיות הם הערוץ ייחודיים לכל יצרן מכשיר, מבנה TruTip שונה נדרש עבור כל מערכת טיפול נוזלית. ממדי מונולית TruTip (קוטר, עובי וגודל נקבובית) אין לתאם עם יכולת קשירת חומצות גרעין (ויעילות elution), כצפוי לכל טכניקת מיצוי שלב מוצקה. אמנם עבה (&gt; 4 מ&quot;מ) מטריצות עשויות להיות מוטבעים TruTip 1 מ&quot;ל להגדלת קיבולת מחייב חומצות גרעין לדגימות גדול בנפח ו / או להשוות את יכולת הקשירה על פני פורמטי TruTip ספציפיים, יש איזון בין עובי TruTip וספיקות במהלך הצעד המחייב הראשוני (בנוכחות lysates הגולמי). לכן, זה לפעמים יתרון להטביע פסלים גדול בקוטר לטיפי פיפטה בנפח גדול יותר לצעדים הראשונים של פרוטוקול אוטומטי, (לדוגמה: &lt;/ Em&gt; 5 מ&quot;ל TruTips המילטון / Akonni לעקירות בהיקפים גדולים). בהתחשב בתצורות TruTip הספציפיות המוכתבות על ידי היצרנים של רובוטים טיפול נוזל, לעומת זאת, אנחנו לא מצפים בהכרח תשואות חומצות גרעין TruTip להיות זהות על פני פלטפורמות טיפול נוזל מיצרנים שונים, או על פני גדלי TruTip שונים. דגימות קליניות (על פי הגדרה) יכילו כמויות משמעותיות של הדנ&quot;א הגנומי אדם אלא אם כן הם נרכשו מבדרך כלל אתרים סטריליים (נוזל השדרה מוחין לדוגמה). לפעמים הדנ&quot;א הגנומי האדם הוא רצוי (כמו באיור 6), ואילו ביישומים אחרים ה-DNA האנושי מייצגת רקע גנטי לא רצוי (כמו לאיור 5). נוכחותו של ה-DNA הרקע היא בדרך כלל לא בעייתית, כל עוד הסכום הכולל של חומצות גרעין במדגם אינו עולה על יכולת הקשירה של מונולית, ואת ה-DNA הרקע יכול לשמש כספק אם גרעין היעד הרצויחומצה מצויה בכמויות זעירות. המטרה של פרוטוקול חילוץ הפלזמה בנפח גבוה (איור 7) היא לבודד (מקוטע) ה-DNA העוברי בנוכחות עודפת של פי 10-20 של ה-DNA האימהי, שהוא דומה למדגם האובייקטיבי הכנת בדיקות מחלות זיהומיות פרט לכך הרצפים חופפים מאוד וניתן להבחין רק על ידי בדיקה ספציפית מאוד מולקולרית ו / או אפליה גודל. במקרה זה, ה-DNA במחזור הכוללת היא מבודדת באמצעות 5 מ&quot;ל TruTip, וה-DNA העוברי במשקל מולקולרי גבוהה ונמוכה מולקולרי הבא מופרדים באמצעות כבילה שלאחר מכן וelution לTruTip מיליליטר 1 על ידי שינוי תנאי המאגר המחייבים. הפרדת גודל סלקטיבית והעשרה של חומצות גרעין המבוססות על יעד מחייבם ומאפייני elution למונולית סיליקה היא מצב שונה באופן מהותי מפעולה מושגת על ידי קרום או עמודות ספין גודל הרחקה. הפרדה והעשרה של גודל ה-DNA של חיידקים מהדנ&quot;א הגנומי אדם עשויה להיותccomplished ביישומים עתידיים באמצעות התאמה אישית מחייב TruTip ומאגרי elution. הפרוטוקולים האוטומטיים הפגינו כאן מדגישים את התועלת של מונולית TruTip עצמו לעיבוד דגימות קליניות שונות, ואיך זה יכול להיות מותאם לכמויות גדולות ורובוטים טיפול נוזל ספציפיים. השיטות יעילה בדרך כלל לגרום לפרוטוקולי חילוץ מהירים יותר בהשוואה למערכות אוטומטיות אחרות. הפשטות של טכנולוגית TruTip, לעומת זאת, גם מעניקה כמה יתרונות עלות למי שמעוניין ברכישת מערכת חדשה, אוטומטי טיהור חומצות גרעין, משום שהחומרה העיקרית הנדרשת למיכון תהליכי TruTip היא זרוע פיפטה הערוץ עצמו ולא מוטות מגנטיות, מערכות ואקום , או על לוח צנטריפוגות. ניצול צלחות מגיב מראש מלאות יכול גם להפחית את השטח ומתכלה נדרשים, ולהכפיל את התפוקה לכל טווח. צמצום שטח סיפון עם פרוטוקולי TruTip גם מאפשר למשתמשים מתקדמים לשילוב במעלה הזרם או דתהליכים אוטומטיים ownstream עם TruTip. לדוגמא פתרון easyBlood של המילטון לדם כל fractionate יכול להיות משולב עם שיטת חילוץ TruTip האוטומטית, אשר הייתי לייעל באופן משמעותי את התהליכים ביו בנקאיים. תהליכים שלאחר המיצוי כגון quantitation חומצות גרעין, נורמליזציה, PCR ההגדרה, או רצפי DNA גם משולבים בקלות עם TruTip על פלטפורמות טיפול נוזל הגדולות יותר.

טיהור חומצות גרעין היא הכרחית לאבחון המולקולרי ביותר, מחקר משתמש רק, ויישומים במדעי חיים. גישות שונות התפתחו מאז ימיו של עקירות פנול / כלורופורם, שרבים מהם מבוססים על עיקרון היסוד של חומצות גרעין מחייבים לסיליקה בנוכחות מלחי chaotropic 1. תהליך החילוץ התייעל ואוטומטי באמצעות השימוש בפורמטים מבוססי קרום חרוז ושונים, עם מסנני ספין מגנטיים, חרוזים וגישות הקשורות שולטות בתעשיית מדעי החיים (ראה דוגמאות ב2-13). אמנם יעיל, חלקיקים וקרומים ידעו מגבלות כאשר התעמתו עם מטריצות קליניות מאתגרות. לדוגמה, קרומים ועמודות מבוססות חרוז תואמים, יש לי גודל נקבובית קטן (ובכך, גב לחצים גבוהים), ודורש איזה סוג של תמיכה כדי להיות מעובד על ידי מערכת צנטריפוגות או ואקום. המאפיינים הפיסיים של קרומים ותוצאת עמודות בחרוזהתנגדות fluidic משמעותית, אשר מגבילה את הסוג של דגימות שניתן לעבד בצורה יעילה ללא סתימה מתכלה, ו / או נפח הדגימה הכולל (קלט) שיכול להיות חד כיוונית מעובד דרך נתיב הזרימה. לעומת זאת, חלקיקים מגנטיים חייבים להיות מופצים בכל רחבי המדגם על ידי תסיסה. צריך להפיץ חלקיקים מגנטיים homogenously במסגרת פתרון מגביל את נפח דגימת הקלט הכולל שיכול להיות מעובד עם חומרים מתכלים חרוז מגנטי ביותר. תכונות לדוגמה קליניות (כגון צמיגות או מורכב) יכולות להוביל לריכוז חלקיקים מגנטיים לא יעיל בצד של צינור או מוט. בנוסף, סיליקה חלקיקים זעירים יכולים לשבור את של החרוזים בתהליך החילוץ, מאבדים את המגנטיזציה שלהם ומזהמים את המדגם הסופי. טכנולוגית TruTip פותחה כדי להתגבר על חלק מאילוצים אלה חומצות גרעין מדגם העיבוד ומגבלות 14. על ידי הטבעת מונולית נקבובית בתוךפיפטה קצה, backpressure fluidic הוא הוריד, המאפשר בקרת זרימה על ידי ואקום (כלומר שאיפת פיפטה). תכונה זו מאפשרת את תהליך החילוץ והמכשור הנדרש כדי לטהר את חומצות גרעין מסוגי מדגם קשים להיות פשוטים מאוד (איור 1). הגיאומטריה והנקבובית של מונולית מותאמת כדי למזער את סתימה, ואילו העובי של מונולית מספק קיבולת כבילה מספיק חומצות גרעין לכרכי מדגם נעים 1.0-5.0 מ&quot;ל. זרימה דו כיוונית בזמן שאיפת מדגם והניפוק מאפשרת פעמים מגורים ממושכות בין תמצית המדגם ומונולית מחייבת להתאוששות חומצות גרעין יעילה וelution, ומאפשרת כרכי מדגם גדולים יחסית לעיבוד שתעלה את קיבולת הנפח של קצה פיפטה עצמו. אנחנו דיווחו על הפיתוח והיישום של הליך TruTip ידני לטיהור RNA שפעת מדגימות אף ולוע באמצעות ראי חד או רב ערוצים בעברנין pipettor 15. יעילות מיצוי מקבילה התקבלו בין אוטומטי QIAcube ושיטות TruTip הידניות ב 10 6 עותקי גן שפעת מ&quot;ל לשאוב לאף ולוע. מטרת המחקר הייתה להדגים כיצד מתבצע פעולות לטווח בינוניות ותפוקה גבוהה, אוטומטיות TruTip חומצות גרעין לטיהור לשאוב אף ולוע (רשות טבע וגנים) וסוגי מדגם רלוונטיים קליני אחרים, שימוש ברובוטי טיפול נוזל נמצאים בדרך כלל בהתייחסות למעבדות קליניות.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips)</td>
			<td>Akonni Biosystems, Inc.</td>
			<td>300-11120</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC615110040</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99% Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270725-4L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir, 30 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>960050100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep well plate 96/2,000 &mu;l</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>30502302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 &mu;l</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>960050100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epMotion 5070 System</td>
			<td rowspan="3">Eppendorf</td>
			<td>5070 000.000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing tool TM1000-8</td>
			<td>960001061</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir rack</td>
			<td>960002148</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips)</td>
			<td>Akonni Biosystems, Inc.</td>
			<td>300-20341</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC615110040</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>AMRESCO LLC</td>
			<td>E195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>235905</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>235904</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Reagent Trough</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>187297</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Well 2 ml plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1896-2800</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96 DWP-2 ml</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>27874</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Trough</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-222-412</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton STAR System</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173027</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173081/173050</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml 96-channel head</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>199090</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182085</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Carriers/Inserts</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173400/182238</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182090</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiflex Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188039</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HHS2 Heater Shaker Unit</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>199033</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips)</td>
			<td>Akonni Biosystems, Inc.</td>
			<td>Call to inquire</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459828-1L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC327270010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>AMRESCO LLC</td>
			<td>E195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered 4 ml Tips</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>184022</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unfiltered 1 ml Tips</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>235939</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Deep Well Plates</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1896-2800</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tubes</td>
			<td>Corning/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-526B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Reagent Troughs</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>187297</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 ml Reagent Troughs</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182703</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Volume 96-Pos Reagent Troughs</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-222-412</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173025/190012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Independent Pipette Channels / Arm</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173081/173052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Independent Channel / Modular Arm</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>184090/173050</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182090</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiflex Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188039</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 ml Reagent trough carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>185290</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182085</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Tube Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182245</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Position Sample Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173400</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 Position Sample Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173410</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput, automated extraction of dna and rna from clinical samples using trutip technology on common liquid handling robots

TruTip הוא טכנולוגית מיצוי חומצות גרעין פשוטה לפי מטריצה ​​נקבובית, מונוליטי מחייבת מוכנסת לתוך קצה פיפטה. הגיאומטריה של מונולית יכולה להיות מותאמת לטיפים פיפטה ספציפיים הנעים בנפח 1.0-5.0 מ&quot;ל. הנקבוביות הגדולה של מונולית מאפשר דגימות צמיגות או מורכבות בקלות לעבור דרכו עם backpressure fluidic מינימאלי. זרימה דו כיוונית למקסימום זמן מגורים בין מונולית והמדגמת, ומאפשרת כרכי מדגם גדולים להיות מעובד בתוך TruTip אחת. את הצעדים הבסיסיים, ללא קשר לנפח דגימה או הגיאומטריה TruTip, כוללים תמוגה תא, חומצות גרעין מחייבים את הנקבוביות הפנימיות של מונולית TruTip, שטיפת רכיבי מדגם מאוגד וחוצצי תמוגה, ומשחררי חומצות גרעין מטוהרים ומרוכזות במאגר מתאים. את התכונות וההתאמה של TruTip הם הפגינו בשלושה פרוטוקולי עיבוד מדגם קליניים אוטומטיים באמצעות epMotion Eppendorf 5070, המילטון STAR ורובוטים טיפול נוזל STARplus, כוללים בידוד RNA מן לשאוב אף ולוע, בידוד הדנ&quot;א הגנומי מדם כולו, ומיצוי DNA עוברי והעשרה מכמויות גדולות של פלזמה אימהית (בהתאמה).

מידע בזמן אמת PCR לשפעת RNA חילוץ מNPA מוצג באיור 5 א. יעילות מיצוי חומצות גרעין משוערת דומה לתוצאות שהושגו עם הגרסה הידנית של פרוטוקול 15. תגובה ליניארי בערכי t C הממוצע היא 10 נצפתה בין 4 ל 10 6 גן עותקי מ&quot;ל -1 תוקנה שפעת (R 2 = 0.99 ו0.98 לשפעת A ו-B, בהתאמה), עם סטיות תקן בממוצע C t הערכים פחות מ 1 מחזור. העדר הזיהום צולב עם מערכת epMotion מודגם באיור 5, שבו 12 דגימות חיוביות NPA המכילות 10 גנים 6 עותקי מ&quot;ל -1 רשות טבע וגנים שביניהם עם 12 כדורי סרק חיץ. T C הממוצע לבקרות החיוביות היה 30.16 ± 0.14, וכל החסר החיץ היה שלילי. סה&quot;כ זמן עיבוד המדגם הוא 16 דקות, 28 ו -40 ל8, 16 ו -24 דגימות, בהתאמה.בגלל לשאוב או ספוגית אף ולוע קליניים טיפוסיים תכיל 10 7 עותקי גן מ&quot;ל -1 (בהנחת 1,000 virions לTCID 50 16 ו&gt; 10 4 TCID 50 מ&quot;ל -1 שפעת 17), פרוטוקול epMotion האוטומטי צפוי להיות יעיל ברוב דגימות NPA קליניות. בהינתן מגוון של בדיקות מולקולריות שבוצעו על הדנ&quot;א הגנומי אדם, המטרה העיקרית של מיצוי חומצות גרעין מדם כולו היא לייצר דנ&quot;א מזהם ללא, משקל מולקולרי גבוה הגנומי. הפרוטוקול האוטומטי למשך 96 דגימות הושלם בתוך שעה 1, שמהווה שיפור של מערכות אוטומטיות אחרות (למשל Promega MagneSil = 90 דקות וQiagen QIAamp DNA דם BioRobot MDX מערכת = 2.5 שעות). איור 6 א מציג את הפרופילים ספיגת UV / Vis עבור 45 דגימות דם חיוביות מעובד בו זמנית עם 45 כדורי סרק מגיב על המילטון STAR הפרוטוקול, עם ממוצע <sub&gt; יחס 260/280 של 1.96 ויחס ממוצע 260/230 של 1.93. 260/280 יחס בין 1.7-2.0 ויחס 260/230&gt; 1.7 הם בדרך כלל מעידים על הדנ&quot;א טהור מאוד, ללא מלחים, חלבונים שיורית או ממסים, ומתקבל על דעת עבור יישומים במורד הזרם מולקולריים ביותר. 1% agarose ג&#39;ל באיור 6 מראה כי gDNA המתקבל הוא של משקל מולקולרי גבוה (&gt; 24 KB), עם גז מינימאלי. התשואה ממוצעת חומצות הגרעין מסט המלא של 45 דגימות חיוביות היא 5.26 ± 0.46 מיקרוגרם דנ&quot;א אנושי לכל 200 דם כל μl, המבוסס על ערכת החיים Quantifiler טכנולוגיות ה-DNA אנושי כימות. מחקרי זיהום צולב דומים לאלה שמוצג באיור 5 בוצעו עם כדורי סרק חיץ בקרה שליליים וביניהם את הדגימות החיוביות והוציאו במקביל; כל החסר היו שלילי שוב על ידי PCR (לא מוצג). מטוהרים gDNA מתאים גם לניתוחים המבוססים על PCR רבים אחרים (לא מוצג). תוצאות בזמן אמת משמונה דגימות לשכפל של מדגם פלזמה אימהי נקווה מעובד עם הליך TruTip בהיקפים גדולים מוצגות באיור 7. פרוטוקול המלא (כולל דגירה K proteinase מחוץ לקו) הוא סיים בכ 2.5 שעות, בדומה לQiagen המדריך למחזור ערכת חומצות גרעין (אין ערכות חילוץ אוטומטיות דומות הן זמינות עדיין). ערכי t C מעל הממוצע כל משכפל הם 34.58 ± 0.66 ו29.76 ± 0.50 לזכר העובר (Chy) וה-DNA הכולל (CH1), בהתאמה, אשר מדגים את הדירות מצוינת של שיטת החילוץ האוטומטית. הריכוז של ה-DNA העוברי בתוך בריכת DNA הכוללת (בשווה הגנום), מחושב על בסיס השוואת ניתוח נקודת התאמה לתקנים, עם ה-DNA עוברי% כתוצאה הממוצעת בכל הדגימות של 2.8%. ה-DNA עוברי% בפועל למדגם זה אינו ידוע משום שדגימות היו נקוות לפני ביצוע החילוץ. הרכב ה-DNA עוברידגימות פלזמה שבאינם אספו מופקים בשיטת TruTip הם בדרך כלל גבוהים יותר פי 1.5 בהשוואה לתוצאות עם ערכת חומצות גרעין Qiagen מחזור (לא מוצג). <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1.jpg" /> איור 1. תהליך חילוץ TruTip וזרימת עבודה, ללא קשר למערכת הטיפול הנוזלי. הכנת מדגם אחרת או שלבי טיפול נוזל יכולים להיות משולב בתוך שגרה אוטומטית בהתאם ליכולות של מכשיר טיפול הנוזל הספציפי ותוכנה. <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2.jpg" /> איור 2. (א) פריסת מדגם Eppendorf epMotion 5070 צלחת. (ב) הסדר של חומרים כימיים / consumaBles על שולחן העבודה. מדגם הצלחת יכולה להיות מוגדר לתקופה של עד 24 דגימות (1 עמודים, 5 ו -9, בהתאמה), אם כי epMotion יהיה לעבד רק עד 8 ​​דגימות בו זמנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3.jpg" /> איור 3. 2 = 1. TruTips 3 Akonni / המילטון מ&quot;ל LPT מ&quot;מ;; פריסת סיפון STAR המילטון לטיהור הדנ&quot;א הגנומי מהדם כולו (שלא בקנה מידה) עמדת 1 סיפון = המילטון טיפים 1 מ&quot;ל מסונן; 2 = 1 מ&quot;ל המילטון טיפים שלא סונן 4 = ספקי תשומות דם מדגם (צינורות איסוף דם או צינורות microcentrifuge); 5-9 = 290 מ&quot;ל לשקתות מגיב F מאגר תמוגה, אתנול, שטוף המאגר J, K ושטפי הצפת A2 הצפת elution, בהתאמה; 10 = 96 דצלחת גם עקידת יפ; 11 = 96 באר עמוק לשטוף J; 12 גם = 96 עמוקה לשטוף K; 13 = 96 צלחת Elution גם עמוקה; 14 = המילטון HHS2 דוד / ייקרתי עם 96 Nunc צלחת דגירה גם עמוקה; = שוקת מגיב 50 מ&quot;ל 15 מכיל proteinase ק <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4.jpg" /> איור 4. פריסת המילטון STARplus סיפון לטיהור DNA מדגימות פלזמה בנפח גדולה (לא בקנה מידה). המערכת מצוידת עם 8 ערוצי 5 מ&quot;ל ו 8 x ערוצי 1 מ&quot;ל (לא מוצג בפריסת הסיפון). מיקום 1 סיפון = המילטון 4 טיפים מ&quot;ל מסוננים; 2 = 5 מ&quot;ל TruTips Akonni / המילטון, 3 = דגימות פלזמה מקור; 4 = 50 צינורות חרוטי מ&quot;ל; 5 = 120 מ&quot;ל המכילים שקתות מגיב CN-W1, CN-W2 וCN-W4 ריאדNTS; 6 = שקתות בנפח נמוכה מגיב המכילות proteinase K, CN-B2, CN-B3, EBA2, גאות וCN-W3 ריאגנטים; 7 = 290 מ&quot;ל המכילה שוקת מגיב מגיב CN-L1; 8 CN = שוקת המכיל 290 מיליליטר מגיב B1-מגיב; 9 = 96 צלחות גם עמוקות לשלב 1, 10 = 96 צלחות עמוקות גם עבור שלב 2; 11 = נושאות מדגם למטוהרים, מוצר סופי; 12 = המילטון טיפים מסוננים 1 מ&quot;ל; 13 = Akonni / המילטון 1 מיליליטר LPT 4 TruTips מ&quot;מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5.jpg" /> איור 5. (). תוצאות בזמן אמת PCR ממיצוי TruTip האוטומטי של נגיף שפעת הוסיפו ללשאוב אף ולוע (רשות טבע וגנים). רשות טבע וגנים בנפח קלט = 100 μl, נפח elution = 50 μl. תוצאות הן ממוצעת של 3 דואר לשכפלxtractions מ 5 רקעים שונים NPA (n = 15) לרמת דילול ויעד שפעת. qPCR בוצע על מערכת LightCycler 480 עם תנאי assay שתוארו לעיל 15. (ב) לא זיהום צולב הוא זוהה כאשר 12 דגימות NPA חיוביות וביניהם לא שולט תבנית ובכפוף להליך המיצוי האוטומטי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig5large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6.jpg" /> איור 6. תוצאות של מיצוי DNA הגנומי אנושי מדם כולו. A) עקבות-UV לעין מ1000 NanoDrop (ThermoFisher) מ 10 שנבחרו באקראי משכפל. ב &#39;) 1% agarose ג&#39;ל של TruTip המטוהר gDNA. M = פישר 24 KB מקסימאלי Dסולם NA. נתיבים 1 - 4 = ~ 100 ng המטוהר gDNA מארבעה נבחר באופן אקראי משכפל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig6large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 7" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7.jpg" /> איור 7. תוצאות בזמן אמת PCR משמונה עקירות TruTip לשכפל מחזור של ה-DNA באופן חופשי מפלזמה. דוגמאות המסומנות בכוכביות (* או **) שהוצאו בימים נפרדים. Chy מכמת-DNA של עובר הזכר וCH1 מכמת הווה DNA כולל (עוברי ואימהי). qPCR בוצע על מערכת LightCycler 480 (רוש) עם מבחני שפורסמו בעבר מיקוד Chy וCH1 18.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots at JoVE.com

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip הוא טכנולוגית מיצוי חומצות גרעין פשוטה לפי מטריצה ​​נקבובית, מונוליטי מחייבת מוכנסת לתוך קצה פיפטה. כתוצאה מכך, את תבנית הכנת המדגם תואמת למכשירי טיפול הנזילים ביותר, וניתן להשתמש בו למדיום רבים ליישומים קליניים תפוקה גבוהה וסוגי מדגם.

הפקת תפוקה גבוהה, אוטומטית של DNA ו-RNA מדגימות קליניות באמצעות הטכנולוגיה TruTip על רובוטים טיפול נוזל נפוצים

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

high-throughput-automated-extraction-dna-rna-from-clinical-samples

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Bioengineering

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

34.4K Views.  Akonni Biosystems, Inc.. TruTip הוא טכנולוגית מיצוי חומצות גרעין פשוטה לפי מטריצה ​​נקבובית, מונוליטי מחייבת מוכנסת לתוך קצה פיפטה. כתוצאה מכך, את תבנית הכנת המדגם תואמת למכשירי טיפול הנזילים ביותר, וניתן להשתמש בו למדיום רבים ליישומים קליניים תפוקה גבוהה וסוגי מדגם.

Video: High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: תפוקה גבוהה 96-ובכן פלטפורמה למדידת נזק לדנ&quot;א בתאי Microarrayed אדם

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

באמצעות Tomoauto: פרוטוקול לתפוקה גבוהה אוטומטית קריו אלקטרון טומוגרפיה

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

אוטומטית רובוטית טיפול בנוזלים הרכבה של התקנים DNA מודולרי

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of bioprocess conditions. One important aspect is the improvement of cultivation medium to provide an optimal environment for microbial formation of the product of interest. It is well accepted that the media composition can dramatically influence overall bioprocess performance. Nutrition medium optimization is known to improve recombinant protein production with microbial systems and thus, this is a rewarding step in bioprocess development. However, very often standard media recipes are taken from literature, since tailor-made design of the cultivation medium is a tedious task that demands microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, fast product analytics, as well as support by lab robotics to enable reliability in liquid handling steps. Furthermore, advanced mathematical methods are required for rationally analyzing measurement data and efficiently designing parallel experiments such as to achieve optimal information content.
The generic nature of the presented protocol allows for easy adaption to different lab equipment, other expression hosts, and target proteins of interest, as well as further bioprocess parameters. Moreover, other optimization objectives like protein production rate, specific yield, or product quality can be chosen to fit the scope of other optimization studies. The applied Kriging Toolbox (KriKit) is a general tool for Design of Experiments (DOE) that contributes to improved holistic bioprocess optimization. It also supports multi-objective optimization which can be important in optimizing both upstream and downstream processes.

This manuscript describes a generic approach for tailor-made design of microbial cultivation media. This is enabled by an iterative workflow combining Kriging-based experimental design and microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, which is supported by lab robotics to increase reliability and speed in liquid handling media preparation.

פרוטוקול גנרי עבור אופטימיזציה של ייצור החלבון Heterologous באמצעות טכנולוגיית Microbioreactor אוטומטיות

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or lethality. However, the probability of a synthetic small molecule being bioactive is low; therefore, thousands of molecules must be tested in order to find those of interest. Liquid handling robotics systems are designed to handle large numbers of samples, increasing the speed with which a chemical library can be screened in addition to minimizing/standardizing error. To achieve a high-throughput forward chemical genetics screen of a library of 50,000 small molecules on Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocols using a bench-top multichannel liquid handling robot were developed that require minimal technician involvement. With these protocols, 3,271 small molecules were discovered that caused visible phenotypic alterations. 1,563 compounds induced short roots, 1,148 compounds altered coloration, 383 compounds caused root hair and other, non-categorized, alterations, and 177 compounds inhibited germination.

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

A high throughput screen of synthetic small molecules was conducted on the model plant species, Arabidopsis thaliana. This protocol, developed for a liquid handling robot, increases the speed of forward chemical genetics screens, accelerating the discovery of novel small molecules affecting plant physiology.

אופטימיזציה של השימוש של רובוט טיפול נוזלי לנהל גבוהה תפוקה קדימה כימי גנטיקה מסך של תודרנית לבנה

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

השימוש תפוקה גבוהה אוטומטית Microbioreactor מערכת לייצור של מודל IgG1 בתאים צ'ו

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain selection and by developing bioprocess parameters. Shake flasks have been used for this purpose. They, however, lack the capability to control the process parameters such as pH and dissolved oxygen (DO). This limitation can be overcome with the help of an automated micro-bioreactor. These bioreactors mimic cultivation at a larger scale. One of the major advantages of this system is the integration of the Design of Experiment (DOE) in the software. This integration enables establishing a design where multiple process parameters can be varied simultaneously. The critical process parameters and optimum bioprocess conditions can be analyzed within the software. The focus of the work presented here is to introduce the user to the steps involved in process design in the software and incorporation of the DOE within the cultivation run.

Here, we present a detailed procedure to run a Design of Experiment in an automated micro-bioreactor followed by cell harvest and protein quantification using a Protein A column.

מיטוב תהליכים באמצעות תפוקה גבוהה מיקרו-Bioreactors שחקנים בסינית טיפוח תא שחלה אוגר

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

תפוקה גבוהה שמרים להתאמץ פנוטיפים עם רצפי רנ א מבוססי Droplet

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

יצירת תנאי סביבה דינמיים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

ניתוח תגובה אופטוגנטית של שמרים באמצעות טכניקת האוטומציה של Lustro

High-Throughput Optogenetics Experiments in Yeast Using the Automated Platform Lustro

Optogenetics offers precise control over cellular behavior by utilizing genetically encoded light-sensitive proteins. However, optimizing these systems to achieve the desired functionality often requires multiple design-build-test cycles, which can be time-consuming and labor-intensive. To address this challenge, we have developed Lustro, a platform that combines light stimulation with laboratory automation, enabling efficient high-throughput screening and characterization of optogenetic systems.
Lustro utilizes an automation workstation equipped with an illumination device, a shaking device, and a plate reader. By employing a robotic arm, Lustro automates the movement of a microwell plate between these devices, allowing for the stimulation of optogenetic strains and the measurement of&#160;their response. This protocol provides a step-by-step guide on using Lustro to characterize optogenetic systems for gene expression control in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. The protocol covers the setup of Lustro&#39;s components, including the integration of the illumination device with the automation workstation. It also provides detailed instructions for programming the illumination device, plate reader, and robot, ensuring smooth operation and data acquisition throughout the experimental process.

מחבר זרקור: קידום מחקר אופטוגנטיקה באמצעות Lustro 

This protocol outlines the steps for utilizing the automated platform Lustro to perform high-throughput characterization of optogenetic systems in yeast.

ניסויים באופטוגנטיקה בתפוקה גבוהה בשמרים באמצעות הפלטפורמה האוטומטית Lustro

Optogenetics offers precise control over cellular behavior by utilizing genetically encoded light-sensitive proteins. However, optimizing these systems to ...