The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.

1. Fliegenschnur Erstellung <ol><li> Generieren Sie zwei verschiedene Konstrukte. In dem ersten Konstrukt wird RpL10A cDNA (ribosomale Protein-Untereinheit L10a) stromabwärts von GFP kloniert in pUASP-PL-GFP-Nter Plasmid (modifizierte Version von 32). Die Verwendung einer Keimbahn-Promotor erlaubt eine polyvalente Nutzung der transgenen Linie. ANMERKUNG: Beziehen Sie das zweite Konstrukt durch Klonierung des regulatorischen Sequenz Fahrgewebespezifische Expression des slouch Gen stromaufwärts von GAL4 (TF) mit pPTGAL4 Plasmid. </li><li> Injizieren Plasmide getrennt in w 1118 Fliegen und legen Konstrukte in-the-fly-Genom durch P-Element-Insertion (nach Standard-Verfahren) 33. </li><li> Wählen Sie Trans um Fliegenlinien mit Konstrukten auf zwei verschiedenen Chromosomen erholen. Die endgültige TRAP Linie wird durch die Kombination dieser beiden Linien (genetische Kreuze), um ein Doppel-transgenen stabile Linie zu bekommen erstellt. F0: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx w-; Cyo / SCU; Slouch Gal4 / TM6B. F1: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; Slouch Gal4 / TM6B. Massiv verstärken diese Linie und sammeln Sie die gewünschten inszeniert Embryonen. </li></ol> 2. Embryonen <ol><li> Bereiten Sie 8 große zylindrische Bevölkerung Käfige mit jeweils etwa 40 g junger Fliegen pro Käfig (rund 180.000 Fliegen / Käfig). </li><li> Fahren Sie mit dem so genannten Pre-Lays, die Fliegen zu entwickelnden Embryonen aus ihren Eileitern löschen lassen. Dafür lag die Fliegen für 1 Stunde auf zwei 11 cm-Durchmesser Petrischalen, die eine Mischung aus erstarrtem Agar und Traubensaft und decken ⅓ der Oberfläche mit frisch zubereiteten Hefepaste. Nach 3 Austausch von Traubensaft Platten sammeln die realen Embryos auf ähnliche frisch zubereiteten Platten. Hinweis: Die Inkubationszeit wird nach Entwicklungszeitfenster untersucht variieren. </li><li> Platten entfernen von Käfigen und lassen Sie sie bei der gleichen Temperatur für den Zeitaufwand für die richtige Entwicklungsstufe (zB 3 Stunden der Eiablage + 10 h addit erhaltenional Inkubation erhält man Embryonen aus Stadium 10 bis 13 Stunden nach der Eiablage (AEL)). Resuspendieren Platte Inhalt (Embryonen, Hefepaste, tote Fliegen) mit 50 ml Wasser mit einer Bürste. </li><li> Gehen durch eine Reihe von Sieben (700 &amp; mgr; m, 355 &amp; mgr; m, 112 &amp; mgr; m) Embryonen aus toten Fliegen und restlichen Körperteilen zu trennen und sammeln Embryonen auf dem kleinerem Durchmesser Sieb zurückgehalten, dann kurz waschen in VE-Wasser. Verwenden Sie nicht mehr als 18 Platten pro Sammlung, wie es die Siebe verstopfen. </li><li> Dechorionate Embryonen in 4,5% Bleichmittel in VE-Wasser für 2 Minuten und gründlich mit VE-Wasser für 30-60 Sekunden. Inkubieren Embryonen in PBS 0,01% Tween 20, 100 ug / ml Cycloheximid für 5-10 min bei RT unter Rühren. </li><li> Trockener Embryonen auf Celluloseabsorptionslagen und sie auf Mikrozentrifugenröhrchen. Wiegen Sie die Rohre und Flash-Einfrieren der Embryonen durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff. In diesem Stadium können die getrockneten Embryonen für mehrere Monate bei -80 ° C gelagert werden. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Vorbereitung der Magnetic Beads bis GFP Antikörper gebunden <ol><li> Gründlich resuspendieren Protein G magnetischen Kügelchen in der Originalflasche durch leichtes Schütteln. </li><li> Transfer 90 ul von Perlen auf ein RNase-freies Rohr und sammeln sie auf einem Magneten (30-60 sec). 90 ul Perlen notwendig ist, Immunpräzipitation (IP) mit 1 ml Lysat, 60-80 mg / mL Proteine ​​führen. Respektieren Verhältnisse zu Wulst Sättigung zu verhindern. Verwenden mehrere Rohre nach Proteinmenge. </li><li> Wash Perlen mit 1 x PBS 0,01% Tween 20 (500 ul) und sammeln Perlen auf dem Magneten, um Überstand verwerfen. Werden 30 ug des GFP-Antikörper in 350 ul PBS 0,01% Tween 20 auf die Kügelchen und Inkubation bei langsamen Kopfüber-Mischung für 30 min bei RT. </li><li> Sammeln Perlen auf dem Magneten (30-60 sec), Überstand verwerfen und gründlich in 500 ul Extraktionspuffer Polysomen (Hepes 10 mM, KCl 150 mM, MgCl 2 5 mM, DTT 0,5 mM Triton 1%, Cycloheximid 100 ug / ml , Protease Inhibitor 1 ×, RNase-Inhibitor 100 U). </li><li> Sammle Perlen auf dem Magneten und fügen Sie 500 ul Blockierungspuffer (BSA 0,1 ug / ul, Hefe-tRNA 0,1 ug / ul, Glykogen 0,1 ug / ul in Polysom ​​Extraktionspuffer). </li><li> Inkubation für 30 min bei RT und wiederholen Sie diesen Schritt einmal mit frischem Blockierungspuffer. </li><li> Sammle Perlen auf dem Magneten und spülen in 500 ul Polysom ​​Extraktionspuffer, dann erinnern Perlen und gehen sofort in den Immun Schritt (Abschnitt 6). </li></ol> 4. Lysatherstellung <ol><li> Bevor Sie beginnen, das Programm einzurichten auf der multidirektionale schnelle Geschwindigkeit Perlen Grinder: 2 x 10 sec bei 5000 Umdrehungen pro Minute, 15 Sekunden Pause. Transfer getrockneten Embryonen (1,5 g), um 15 ml Röhrchen auf Eis enthält Polysom ​​Extraktionspuffer vorgekühlt, und homogenisieren sofort. Homogenisieren 1,5 g Embryonen in 4 ml Extraktionspuffer Polysomen. </li><li> Spread homogenisiert Embryonen in zwei vorgekühlt 2 ml-Röhrchen und schleifen die embryos, indem Sie den Homogenisator Programm. Übertragen Sie das Lysat in frische vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis und bereiten eine postnukleäre Stand durch Zentrifugation bei 4 ° C für 10 min bei 2000 g. </li><li> Überstand in ein frisches vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis, fügen 1/100 Probenvolumen von 10% Nonidet P-40 zu dem Überstand (Endkonzentration = 0,1%), und mischen Sie sie vorsichtig durch Umdrehen des Röhrchens. </li><li> Puls Zentrifuge die Probe in einer Minifuge um die Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu sammeln, fügen 1/9 Probenvolumen von 300 mM 1,2-Diheptanoyl-sn-glycero-3-Phosphocholin (DHPC) (Endkonzentration = 30 mM ), mischen Sie es vorsichtig durch Umdrehen des Röhrchens, und Inkubation der Mischung auf Eis für 5 min (Mischung durch mehrmaliges Wenden während der Inkubation). </li><li> Vorbereitung der post-mitochondrialer Überstand durch Zentrifugation bei 4 ° C für 10 Minuten bei 20.000 g. Messung der Proteinkonzentration nach der Bradford-Methode: Konzentration im Lysat sollte zwischen 60-80 mg / ml sein. Take den Überstand in ein frisches neues vorgekühltem Mikrozentrifugenröhrchen und gehen sofort in den Pre-Absorptionsstufe (Abschnitt 5). </li></ol> 5. Pre-Absorption <ol><li> Die Magnetperlen gründlich durch vorsichtiges Schütteln resuspendieren und Transfer 30 ul Kügelchen in ein Mikrozentrifugenröhrchen bei Raumtemperatur (30 &amp; mgr; l Perlen / 1 ml embryonalen Lysat). </li><li> Sammle Perlen auf dem Magneten, einer Pipette aus dem Überstand und resuspendieren die Perlen in Polysom ​​Extraktionspuffer (500 ul). Sammle Perlen auf dem Magneten, fügen embryonalen Lysat, und Inkubation für 1 h bei 4 ° C auf einem Rotator. <ol><li> Perlen bringen und Überstand auf Eis zur Immun Schritt. Vor Immun, halten 100 ul Überstand (Eingang) zur globalen RNA-Probe mit der RNA-Probe, nachdem Immun gesammelt, durch RT-qPCR zum Beispiel zu vergleichen. </li></ol></li></ol> 6. Immunreinigung <ol><li> 1 ml (entspricht 60-80 mg / ml Protein)pre-absorbiert Lysats auf ein RNase-freies Röhrchen mit 90 ul blockierter Perlen GFP-Antikörper gekoppelt ist. Inkubieren der Proben bei 4 ° C für 2 Stunden unter leichtem end-over-end Mischen in einem Rohrdrehgelenk. Alternativ führen die Inkubation O / N bei 4 ° C. </li><li> Nach der Inkubation, sammeln Perlen auf dem Magneten. Verwenden Sie einen Minifuge sich zu drehen, die Perlen, so resuspendieren sie in 500 ul Waschpuffer (Hepes 10 mM, KCl 350mm, MgCl2 5 mM, Nonidet P-40 1% DTT 0,5 mM, Cycloheximid 100 ug / ml, RNase-Inhibitor 100 U ) und sammeln sie auf dem Magneten. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal. </li><li> Ändern Sie die Perlen auf eine neue vorgekühltem RNase-freies Rohr und zwei Mal waschen. Sammle Perlen auf einem Magneten und zur RNA-Extraktion durch Zugabe von 1 ml Trizol direkt an die Beads und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> 7. RNA Sanierung und Qualitätsbewertung <ol><li> Verwenden Sie eine RNeasy Micro Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Bei Fertigstellung Elute-RNA mit (x) &amp; mgr; l RNase-freies Wasser. Warm für 2 min bei 60 ° C, und speichern schockgefroren Proben bei -80 ° C. Überprüfen RNA-Qualität mit Bioanalyzer (folgen Sie den Anweisungen des Herstellers). </li><li> Um die Spezifität des Traped RNA zu testen, führen die reverse Transkription von 3 ng gereinigte RNA (Ein- und IP) nach den Anweisungen des Herstellers (hochgestellte III). Verwenden Sie das für die qPCR mit Gen-spezifischen Primer-Sets erhalten cDNA. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Papier beschreibt eine modifizierte Translating Ribosom Affinitätsreinigung Protokoll (genannt &quot;TRAP-rc &#39;) auf die Untersuchung von seltenen Zellpopulationen in Drosophila-Embryos gewidmet. Informationen über die wesentlichen Schritte für eine erfolgreiche Isolierung von spezifischen RNA mit einer Ausbeute geeignet für Microarray-oder RNA-seq-Analyse, dh 1) Menge an biologischem Material erforderlich ist und optimierte Verfahren für die Embryo-Lyse und Polysom ​​Extraktion bereitgestellt; 2) Perlen / Antikörper-to-Lysat Verhältnissen für eine optimale Immunfällung; 3) die Schritte ermöglicht Reduzierung der Hintergrund einschließlich Waschpuffer-Zusammensetzung, um TRAP-rc Experimente mit hoher Spezifität und Sensitivität geführt. Dieses Protokoll liefert reproduzierbare Daten macht es leicht auf andere Zelltypen verwendet. Diese Technik ermöglicht es, differentiellen Genexpression auf der Ebene der aktiv-Übersetzung von mRNA zu analysieren und damit den Weg zum Verständnis der Proteinexpression in einer spec<html> ific Zelltyp in einem bestimmten Zeitfenster. Man beachte jedoch, dass Proteinmenge wird auf die Geschwindigkeit der Übersetzung und Abbauprozesse abhängen. Eine Hauptbeschränkung der Trap-Verfahren ist die Unfähigkeit, Proteingehalt in einer genauen quantitativ zu messen oder posttranslationale Modifikation detektieren. Verbesserung der Quantifizierung durch Messung Ribosom Dichte entlang der mRNA Körper und, damit, in einem zelltypspezifische Weise können TRAP kombiniert mit Ribosomen-Footprinting ein sehr leistungsfähiges Werkzeug zu machen. In einer aktuellen Arbeit 34 wurde diese Verbindung in menschliche embryonale Nieren-293-Zellen durchgeführt. Die Autoren lief Nuklease Footprinting, gefolgt von Affinitätsreinigung eines induzierbaren biotinylierten Form RpL10A mit Streptavidin-Kügelchen. Dies ist ein Beweis für das Prinzip, daß es möglich ist, Ribosom-Footprinting in einem gesamten Organismus durchzuführen, während Targeting eines spezifischen Zelltyps, die Begrenzung wobei die Menge des biologischen Materials zum Zwecke erforderlich. &quot;&gt; Darstellende TRAP Experimenten parallel globale Transkriptom Analysen ermöglichen es, Proportionen zwischen neu transkribiert und actively- übersetzen RNA. Diese wird tief informative der potenziellen posttranskriptionale Mechanismen, die sich in spezifischen Entwicklungszusammenhängen oder spezifischer Zellpopulationen sein verfolgen -durch microRNAs zum Beispiel. Zusammenfassend ist TRAP eine hoch effiziente, spezifische und sensitive Methode zur Identifizierung RNAs aktiv umsetze Ribosomen in einer zellspezifischen Weise gebunden. Dieses Verfahren kann in einer breiten Vielfalt von Organismen und Gewebetypen verwendet werden. Das hier beschriebene neue TRAP-rc-Protokoll wurde für seltene Zellpopulationen (weniger als 1% der Gesamtzellzahl) und für eine Menge von Endmaterial ausreichend für spätere Analysen bei Gesamtgenom-Niveau optimiert. Eine mögliche Einschränkung dieses Verfahrens ist das Erfordernis einer starken Treiber, den markierten Ribosomen in ausreichender Menge zu produzieren, um compete mit endogenen untagged diejenigen in der Zielzelltyp. In einer neueren Studie 25. geschätzten Autoren zu 10-30% das Verhältnis von markierten gegen unmarkierte Ribosomen. Um dieses Problem zu steigenden UAS-RpL10A-EGFP Kopienzahl sollte dieses Gleichgewicht deutlich verbessern zu überwinden. Alternativ, zusätzlich zu den beschriebenen genetischen Hintergrund ein UAS-GAL4-Transgens wird die Produktion von GAL4-Protein zu verstärken und die Expression von RpL10A-EGFP indirekt zu erhöhen. Dies sollte eine bessere Auslastung von markierten Ribosomen auf mRNA begünstigen. Beachten Sie, dass dies bereits effizienten Ansatz kann noch leistungsfähiger durch Anpassung komplementäre Methoden, um einen quantitativen Aspekt zu bringen oder zu entdecken und zu entwirren, die molekularen Mechanismen, die für die Genexpression Kontrolle vorgenommen werden.

Zu verstehen, wie Zellen während der Entwicklung bestimmte Eigenschaften zu erwerben, ist, um die Komplexität der Organe und deren potenzielle Entwicklung hin zu pathologischen Bedingungen zu schätzen wissen von entscheidender Bedeutung. Es gibt einen großen Forschungs Push, um die Gen-regulatorischen Netzwerke, die das Zell Spezifizierung und Differenzierung zugrunde liegen durch unrevealing globalen Genexpressionsprofile zu entziffern, Pol II bindenden Status, Transkriptionsfaktor-Belegung am regulatorischen Sequenzen bzw. post-translationale Modifikationen von Histonen. Um die Genexpression auf globaler Ebene Microarrays zu bewerten und RNA-seq Ansätze verwendet. Microarrays erlauben, mRNA-Häufigkeit zu erkennen, während RNA-seq ist besser auf die Information über die verschiedenen Arten von RNAs einschließlich codierenden und nichtcodierenden RNAs wie microRNAs, lncRNAs oder snRNAs. Jedoch können diese Techniken nicht zu unterscheiden aktiv transkribierten, stationären mRNA aktiv umsetze mRNA und mRNA in die Abbauprozess. Mess stationären staß mRNA-Spiegel ist bekannt, dass eine schlechte Schätzung des Proteoms Zusammensetzung 1-3 sein. Im Gegenteil, die Identifizierung aktiv-Übersetzung von mRNA ergibt ein genaueres Bild der Proteinproduktion. Allerdings transkriptomischen Studien vor allem auf ganze Organismus Ebene durch den Vergleich Gewinn oder Verlust der Funktion eines bestimmten Faktor zu Wildtyp-Zustand 4-7 oder seziert Gewebe, so dass Genexpressionsprofile schwer zu interpretieren geführt worden. Jüngste Fortschritte in der Zell-Targeting-Tools, Affinitätsreinigung und Empfindlichkeit Verbesserungen erlauben jetzt ausführen genomweiten Analysen zu kleinen Zellpopulationen oder sogar einzelne Zellen in einem lebenden Organismus. In Drosophila, große Sammlungen von transgenen Linien ermöglichen es, bestimmte zeitliche und räumliche Ausrichtung der verschiedenen Geweben und Zellpopulationen über den GAL4 / UAS-System 8-10 wodurch genauere Quantifizierung der molekularen Mechanismen für die Zellfunktion notwendig. 11 beschrieben. Diese Methode basiert auf Sucrosegradientenzentrifugation ermöglicht die Auswahl der Polysomen-Fraktion und Bestimmung von mRNA übersetzt genomweite, wenn sie mit Microarrays oder tiefe Sequenzierung analysiert. Polysom ​​Isolation kann mit Nucleaseverdau um ribosomale Fußabdrücke entsprechenden RNA-Fragmente durch die Ribosomen während des Übersetzungsprozesses 12 geschützt identifizieren gekoppelt werden. Ribosomalen Footprinting erhöht die Genauigkeit der Quantifizierung der RNA-Translation und RNA-Sequenzlevel Auflösung und Ribosom Positionierung ermöglicht es, Translationsrate zu messen. Jedoch ist es bis heute nicht zellspezifische Isolierung translatomes aufgebracht worden ist, vor allem aufgrund der starken Abnahme der RNA-Ausbeute am Ende des Ribosoms Footprinting Verfahren erhalten. Da die Größenauswahl der RNA kann potenzielle Falsch p zu erzeugenositives aus verschiedenen RNPs, die auch sein könnte Schutz RNA auf ähnliche Weise werden weitere Entwicklungen notwendig, um ribosomale Fußabdruck zu verbessern und ihre Anpassung an zellspezifische Ansätze. Eines dieser Verfahren, die so genannte Translating Ribosom Affinitätsreinigung (TRAP) wurde im Jahr 2008 von Heiman et al. und auf die translatome aus einer Untergruppe von Neuronen bei Mäusen zu isolieren. Durch Epitop-Markierung des ribosomalen Proteins in einem zelltypspezifischen Weise kann Polysomen selektiv ohne den mühsamen Schritt der Zelldissoziation und Sortierung gereinigt werden. In diesem Fall wurde die 60S ribosomale Protein L10a an der Oberfläche des Ribosoms mit eGFP 13 markiert. Seit 2008 haben mehrere Studien diese Methode in verschiedenen Arten verwendet werden, die von Mäusen 14-19 bis X laevis 20,21, Zebrafisch 22,23 und Arabidopsis thaliana 24. Die TRAP-Methode wurde auch auf die Drosophila-Modell angepasst und verwendet nach Purify Zelltyp-spezifischen mRNAs von neuronalen Zellen 25 und 26 Astrozyten. Die vielseitige binären GAL4 / UAS-System wurde verwendet, um die GFP-markierten RpL10A in einer gewebespezifischen Weise exprimieren. Leiter der erwachsenen Fliegen wurden seziert, um Polysom ​​Auswahl aus neuronalen Zellen (von pan-neuronalen Elav-Gal4-Treiber gezielte) und isolierten RNAs durchzuführen, wurden sequenziert. Die große Zahl der hochregulierten Genen entsprachen denen bekannt ist, im Nervensystem exprimiert werden, was darauf hinweist, dass der Ansatz eine gute Spezifität und uns eingibt, um es in seltenen Zellpopulationen anzupassen (weniger als 1% der Zellen) vorhanden entwickeln Drosophila-Embryonen . Innerhalb der Drosophila-Modell ist das Embryonalstadium ein Modell der Wahl für die Untersuchung von Entwicklungsprozessen, wie die molekularen Akteure und Gestaltungsbewegungen sind evolutionär konserviert. Die einzigen Gewebe-spezifische transkriptomischen Ansätze bisher in diesem Modell durchgeführt wurden unter Verwendung von Zellen oder Kern sorting und haben nur einen stabilen Zustand für Transkriptom 27-31 Studie nachgewiesen, wodurch ein Bedarf für Verfahren, um Gewebe / Zell-spezifische translatome Profilierungsfliegenembryo gewidmet. Hier haben wir die erste TRAP-Protokoll, um Drosophila-Embryos gewidmet melden. Mit diesem Verfahren Eingriff-in-Übersetzung mRNA in einer sehr begrenzten Zellpopulation von etwa 100 Muskelzellen pro Embryo wurde erfolgreich mit hoher Qualität und Spezifität isoliert. Der binäre GAL4 / UAS-System wird verwendet, um die Expression von GFP-markierten RpL10A in Subpopulation von Muskeln ohne Toxizität zu fahren, da keine scheinbare Phänotypen oder Entwicklungsverzögerung zuvor. 25 gezeigt Drosophila-Embryos besitzen 30 Muskeln pro hemisegment, die Anlass zu der Muskulatur geben der Larve. Durch Verwendung einer regulatorischen Region in der Nähe der Niete Identität Gen entdeckt, 6 der 30 mehrkernigen Muskeln, werden angezeigt. In diesem Test werden die Ribosomen auf der mRNA unter Verwendung des immobilisierten TranslationselongationInhibitor Cycloheximid. Cytosolische Extrakte werden dann zur Affinitätsreinigung mit GFP Antikörper-beschichteten magnetischen Perlen verwendet. Qualität der gereinigten RNA wurde unter Verwendung Bioanalyzer validiert. Quantitative reverse Transkriptions-PCR (RT-qPCR) wurde verwendet, um die Spezifität und Empfindlichkeit der Isolierung der mRNA zu bestimmen, und gezeigt, dass unsere verbesserte Protokoll ist sehr effizient.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H4034-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850306P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>thermo scientific&#160;</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified BSA 100X&#160;</td>
			<td>Biolabs</td>
			<td>B9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast tRNA&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R5636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RNase In&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody GFP clone N86/38</td>
			<td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated</td>
			<td>75-132&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11754595001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 Lysis homogenisation&#160;</td>
			<td>Bertin Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water&#160;</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads ProteinG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Applied Biosystem&#160;</td>
			<td>AM96406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)&#160;</td>
			<td>Applied Biosystem&#160;</td>
			<td>AM95306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose waddin unbleached&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-2597&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieves 112, 355, 710 um&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRiZol&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagRack 6</td>
			<td>GE HealthCare&#160;</td>
			<td>28948964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding filter tips&#160;</td>
			<td>ClearLine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase free tube 1,5 mL&#160;</td>
			<td>ClearLine</td>
			<td>390689DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Fischer Bioreagent&#160;</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trap-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of drosophila embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

Die Drosophila embryonalen somatischen Muskulatur wird von 30 Muskeln pro hemisegment zusammengesetzt, und jeder Muskel hat einen bestimmten Satz von Eigenschaften: Codeidentitätsgene, Position, Anzahl der Fusionsereignisse, Befestigungsstellen und Innervation. Identifizieren übersetzt mRNA in einer bestimmten Muskeluntergruppe geben Informationen über die erforderlich ist, um diese spezifische Muskel Eigenschaften bilden Proteine. Verwenden des TRAP-basierte Verfahren, RNA aus einer Subpopulation von Muskeln, die Identität Gen slouch exprimiert, wurde gereinigt (1A-B). Ein wichtiges Anliegen für diesen Ansatz ist die Qualität und die Spezifität der isolierten RNA. Die optimierte Protokoll hier berichteten aktiviert systematische Verwertung von hochwertigen RNA mit Bioanalyzer-Analyse beurteilt. Die erhaltenen Profil zeigt keinen Abbau von RNA (Abbildung 1c). In anderen Studien in der Trap-Verfahren entwickelt wurden Fragen über die Spezifität der Daten erhöht. Here we imü ssen die Methode zum Hintergrund nicht-spezifischer Bindung der RNA an die Kügelchen oder die Rohre und durch die Optimierung des Waschpuffers verbunden drücken. Um die Hintergrundebene und Effizienz der Isolierung slouch-exprimierenden Zellen zu bewerten, führten wir RT-qPCR-Studien auf 3 Wiederholungen des gleichen embryonalen Stadium. Fold-Anreicherungen von 4 verschiedenen Genen (MEF2, slouch, Prospero, soxNeuro) wurden im Vergleich zum Ein- und normalisiert gegen die RpL32 Gen (1D) berechnet. Diese Ergebnisse zeigten, 2,3-fache Anreicherung der pan-Muskelgens MEF2 und 5,6-fache Anreicherung der slouch Gens. Dagegen sind die beiden Gene in das Nervensystem exprimiert wurden, verglichen mit abgereichertem Eingang. Sehr ähnlich fache Änderung Werte wurden auf 3 biologischen Replikaten beobachtet, was zeigt, dass das Protokoll ist robust. Mit Slouch-Gal4-Treiber und ausgehend von 1,5 g, rund 1,5x10 ^ 6 Embryonen wurden gewonnen, die 100 GFP Zellen / Embryos (insgesamt 150 x 10 ^ 6 positive enthaltenZellen). Nach dem Ausführen des TRAP Experiment ist die Ausbeute in der Umgebung von 25 bis 45 ng spezifische RNA je auf der Bühne von Interesse. Dieses Material ist genug, um Microarray-Analyse oder RNA-seq Verwendung eines Amplifikationsprotokoll um ein RNA-seq-Bibliothek zu erstellen ausführen. Effizienz wird stark von der Stärke der verwendet wird, um RpL10A-EGFP exprimieren Treiber abhängen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> Abbildung 1. Qualität und Spezifität Beurteilung der TRAP-isolierte RNA aus Slouch-GAL4&gt; UASRpL10A-EGFP Embryonen. (AB) Konfokale Bilder von einem Stadium 16-Embryo, welches RpL10A-EGFP-Expression spezifisch in den sechs Slouch Muskelzellen pro hemisegment (A). Co-Lokalisation von RpL10A-EGFP mit dem allgemeinen Muskelmarkierung Beta3tubulin auf Merge-Bild (B) beobachtet. (C) Qualitätskontrolle von RNA Traped ran auf Bioanalyzer zeigt perfekte Integrität rRNA 18S und 28S. (D) RT-qPCR-Analyse, die hohe Spezifität der TRAP-isolierte mRNA Experimente an biologischen 3 Wiederholungen der Stufe-16-Embryonen. Falten Änderung im Vergleich zum Ein- und normalisiert gegen die RpL32 Gens berechnet. In allen Muskelabstammungslinien vorhanden MEF2 Transkripte sind 2,3-fach angereicherte im Vergleich zum Eingang der Erwägung, dass mehr eingeschränkt slouch Transkripte sind 5,6-fach angereicherte. Nervenzellen prospero ausdrücken und soxN Gene sind erschöpft 2,2-fach und 5,5-fach auf. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

TRAP-rc, Translating Ribosom Affinitätsreinigung von Rare Zellpopulationen<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Research

JoVE Journal

Biology

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

17.7K Aufrufe.  University of Clermont-Ferrand. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos. 

Serie: TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Vorbereitung der neuronalen Kulturen aus Midgastrula Bühne Drosophila Embryonen

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Forschung

Biologie

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Vorbereitung der Embryonen für Elektronenmikroskopie der Drosophila Embryonale Herz Rohr

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In-vivo-Zentrifugation von Drosophila Embryonen

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

Upright Imaging von Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Primären Zellkulturen aus Drosophila Gastrula Embryonen

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imaging Zellgröße Veränderung der Lebens- Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolierung und Reinigung von Kinesin aus Drosophila Embryonen

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Reinigung von Affinity-markierter rekombinanter Proteine

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Reinigung von Transcripts und Metaboliten aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Köpfe

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...