The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.

1. Fliegenschnur Erstellung <ol><li> Generieren Sie zwei verschiedene Konstrukte. In dem ersten Konstrukt wird RpL10A cDNA (ribosomale Protein-Untereinheit L10a) stromabwärts von GFP kloniert in pUASP-PL-GFP-Nter Plasmid (modifizierte Version von 32). Die Verwendung einer Keimbahn-Promotor erlaubt eine polyvalente Nutzung der transgenen Linie. ANMERKUNG: Beziehen Sie das zweite Konstrukt durch Klonierung des regulatorischen Sequenz Fahrgewebespezifische Expression des slouch Gen stromaufwärts von GAL4 (TF) mit pPTGAL4 Plasmid. </li><li> Injizieren Plasmide getrennt in w 1118 Fliegen und legen Konstrukte in-the-fly-Genom durch P-Element-Insertion (nach Standard-Verfahren) 33. </li><li> Wählen Sie Trans um Fliegenlinien mit Konstrukten auf zwei verschiedenen Chromosomen erholen. Die endgültige TRAP Linie wird durch die Kombination dieser beiden Linien (genetische Kreuze), um ein Doppel-transgenen stabile Linie zu bekommen erstellt. F0: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx w-; Cyo / SCU; Slouch Gal4 / TM6B. F1: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; Slouch Gal4 / TM6B. Massiv verstärken diese Linie und sammeln Sie die gewünschten inszeniert Embryonen. </li></ol> 2. Embryonen <ol><li> Bereiten Sie 8 große zylindrische Bevölkerung Käfige mit jeweils etwa 40 g junger Fliegen pro Käfig (rund 180.000 Fliegen / Käfig). </li><li> Fahren Sie mit dem so genannten Pre-Lays, die Fliegen zu entwickelnden Embryonen aus ihren Eileitern löschen lassen. Dafür lag die Fliegen für 1 Stunde auf zwei 11 cm-Durchmesser Petrischalen, die eine Mischung aus erstarrtem Agar und Traubensaft und decken ⅓ der Oberfläche mit frisch zubereiteten Hefepaste. Nach 3 Austausch von Traubensaft Platten sammeln die realen Embryos auf ähnliche frisch zubereiteten Platten. Hinweis: Die Inkubationszeit wird nach Entwicklungszeitfenster untersucht variieren. </li><li> Platten entfernen von Käfigen und lassen Sie sie bei der gleichen Temperatur für den Zeitaufwand für die richtige Entwicklungsstufe (zB 3 Stunden der Eiablage + 10 h addit erhaltenional Inkubation erhält man Embryonen aus Stadium 10 bis 13 Stunden nach der Eiablage (AEL)). Resuspendieren Platte Inhalt (Embryonen, Hefepaste, tote Fliegen) mit 50 ml Wasser mit einer Bürste. </li><li> Gehen durch eine Reihe von Sieben (700 &amp; mgr; m, 355 &amp; mgr; m, 112 &amp; mgr; m) Embryonen aus toten Fliegen und restlichen Körperteilen zu trennen und sammeln Embryonen auf dem kleinerem Durchmesser Sieb zurückgehalten, dann kurz waschen in VE-Wasser. Verwenden Sie nicht mehr als 18 Platten pro Sammlung, wie es die Siebe verstopfen. </li><li> Dechorionate Embryonen in 4,5% Bleichmittel in VE-Wasser für 2 Minuten und gründlich mit VE-Wasser für 30-60 Sekunden. Inkubieren Embryonen in PBS 0,01% Tween 20, 100 ug / ml Cycloheximid für 5-10 min bei RT unter Rühren. </li><li> Trockener Embryonen auf Celluloseabsorptionslagen und sie auf Mikrozentrifugenröhrchen. Wiegen Sie die Rohre und Flash-Einfrieren der Embryonen durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff. In diesem Stadium können die getrockneten Embryonen für mehrere Monate bei -80 ° C gelagert werden. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Vorbereitung der Magnetic Beads bis GFP Antikörper gebunden <ol><li> Gründlich resuspendieren Protein G magnetischen Kügelchen in der Originalflasche durch leichtes Schütteln. </li><li> Transfer 90 ul von Perlen auf ein RNase-freies Rohr und sammeln sie auf einem Magneten (30-60 sec). 90 ul Perlen notwendig ist, Immunpräzipitation (IP) mit 1 ml Lysat, 60-80 mg / mL Proteine ​​führen. Respektieren Verhältnisse zu Wulst Sättigung zu verhindern. Verwenden mehrere Rohre nach Proteinmenge. </li><li> Wash Perlen mit 1 x PBS 0,01% Tween 20 (500 ul) und sammeln Perlen auf dem Magneten, um Überstand verwerfen. Werden 30 ug des GFP-Antikörper in 350 ul PBS 0,01% Tween 20 auf die Kügelchen und Inkubation bei langsamen Kopfüber-Mischung für 30 min bei RT. </li><li> Sammeln Perlen auf dem Magneten (30-60 sec), Überstand verwerfen und gründlich in 500 ul Extraktionspuffer Polysomen (Hepes 10 mM, KCl 150 mM, MgCl 2 5 mM, DTT 0,5 mM Triton 1%, Cycloheximid 100 ug / ml , Protease Inhibitor 1 ×, RNase-Inhibitor 100 U). </li><li> Sammle Perlen auf dem Magneten und fügen Sie 500 ul Blockierungspuffer (BSA 0,1 ug / ul, Hefe-tRNA 0,1 ug / ul, Glykogen 0,1 ug / ul in Polysom ​​Extraktionspuffer). </li><li> Inkubation für 30 min bei RT und wiederholen Sie diesen Schritt einmal mit frischem Blockierungspuffer. </li><li> Sammle Perlen auf dem Magneten und spülen in 500 ul Polysom ​​Extraktionspuffer, dann erinnern Perlen und gehen sofort in den Immun Schritt (Abschnitt 6). </li></ol> 4. Lysatherstellung <ol><li> Bevor Sie beginnen, das Programm einzurichten auf der multidirektionale schnelle Geschwindigkeit Perlen Grinder: 2 x 10 sec bei 5000 Umdrehungen pro Minute, 15 Sekunden Pause. Transfer getrockneten Embryonen (1,5 g), um 15 ml Röhrchen auf Eis enthält Polysom ​​Extraktionspuffer vorgekühlt, und homogenisieren sofort. Homogenisieren 1,5 g Embryonen in 4 ml Extraktionspuffer Polysomen. </li><li> Spread homogenisiert Embryonen in zwei vorgekühlt 2 ml-Röhrchen und schleifen die embryos, indem Sie den Homogenisator Programm. Übertragen Sie das Lysat in frische vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis und bereiten eine postnukleäre Stand durch Zentrifugation bei 4 ° C für 10 min bei 2000 g. </li><li> Überstand in ein frisches vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis, fügen 1/100 Probenvolumen von 10% Nonidet P-40 zu dem Überstand (Endkonzentration = 0,1%), und mischen Sie sie vorsichtig durch Umdrehen des Röhrchens. </li><li> Puls Zentrifuge die Probe in einer Minifuge um die Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu sammeln, fügen 1/9 Probenvolumen von 300 mM 1,2-Diheptanoyl-sn-glycero-3-Phosphocholin (DHPC) (Endkonzentration = 30 mM ), mischen Sie es vorsichtig durch Umdrehen des Röhrchens, und Inkubation der Mischung auf Eis für 5 min (Mischung durch mehrmaliges Wenden während der Inkubation). </li><li> Vorbereitung der post-mitochondrialer Überstand durch Zentrifugation bei 4 ° C für 10 Minuten bei 20.000 g. Messung der Proteinkonzentration nach der Bradford-Methode: Konzentration im Lysat sollte zwischen 60-80 mg / ml sein. Take den Überstand in ein frisches neues vorgekühltem Mikrozentrifugenröhrchen und gehen sofort in den Pre-Absorptionsstufe (Abschnitt 5). </li></ol> 5. Pre-Absorption <ol><li> Die Magnetperlen gründlich durch vorsichtiges Schütteln resuspendieren und Transfer 30 ul Kügelchen in ein Mikrozentrifugenröhrchen bei Raumtemperatur (30 &amp; mgr; l Perlen / 1 ml embryonalen Lysat). </li><li> Sammle Perlen auf dem Magneten, einer Pipette aus dem Überstand und resuspendieren die Perlen in Polysom ​​Extraktionspuffer (500 ul). Sammle Perlen auf dem Magneten, fügen embryonalen Lysat, und Inkubation für 1 h bei 4 ° C auf einem Rotator. <ol><li> Perlen bringen und Überstand auf Eis zur Immun Schritt. Vor Immun, halten 100 ul Überstand (Eingang) zur globalen RNA-Probe mit der RNA-Probe, nachdem Immun gesammelt, durch RT-qPCR zum Beispiel zu vergleichen. </li></ol></li></ol> 6. Immunreinigung <ol><li> 1 ml (entspricht 60-80 mg / ml Protein)pre-absorbiert Lysats auf ein RNase-freies Röhrchen mit 90 ul blockierter Perlen GFP-Antikörper gekoppelt ist. Inkubieren der Proben bei 4 ° C für 2 Stunden unter leichtem end-over-end Mischen in einem Rohrdrehgelenk. Alternativ führen die Inkubation O / N bei 4 ° C. </li><li> Nach der Inkubation, sammeln Perlen auf dem Magneten. Verwenden Sie einen Minifuge sich zu drehen, die Perlen, so resuspendieren sie in 500 ul Waschpuffer (Hepes 10 mM, KCl 350mm, MgCl2 5 mM, Nonidet P-40 1% DTT 0,5 mM, Cycloheximid 100 ug / ml, RNase-Inhibitor 100 U ) und sammeln sie auf dem Magneten. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal. </li><li> Ändern Sie die Perlen auf eine neue vorgekühltem RNase-freies Rohr und zwei Mal waschen. Sammle Perlen auf einem Magneten und zur RNA-Extraktion durch Zugabe von 1 ml Trizol direkt an die Beads und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> 7. RNA Sanierung und Qualitätsbewertung <ol><li> Verwenden Sie eine RNeasy Micro Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Bei Fertigstellung Elute-RNA mit (x) &amp; mgr; l RNase-freies Wasser. Warm für 2 min bei 60 ° C, und speichern schockgefroren Proben bei -80 ° C. Überprüfen RNA-Qualität mit Bioanalyzer (folgen Sie den Anweisungen des Herstellers). </li><li> Um die Spezifität des Traped RNA zu testen, führen die reverse Transkription von 3 ng gereinigte RNA (Ein- und IP) nach den Anweisungen des Herstellers (hochgestellte III). Verwenden Sie das für die qPCR mit Gen-spezifischen Primer-Sets erhalten cDNA. </li></ol>

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	<li>Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels.">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Molecular bioSystems. 5, 1512-1526 (2009).</li><li>Maier, T., Guell, M., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+mRNA+and+protein+in+complex+biological+samples.">Correlation of mRNA and protein in complex biological samples.</a> FEBS letters. 583, 3966-3973 (2009).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (1038).</li><li>Junion, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+view+of+cell+fate+specification:+ladybird+acts+at+multiple+levels+during+diversification+of+muscle+and+heart+precursors.">Genome-wide view of cell fate specification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors.</a> Genes. 21, 3163-3180 (2007).</li><li>Jakobsen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+ChIP-on-chip+reveals+Biniou+as+a+universal+regulator+of+the+visceral+muscle+transcriptional+network.">Temporal ChIP-on-chip reveals Biniou as a universal regulator of the visceral muscle transcriptional network.</a> Genes. 21, 2448-2460 (2007).</li><li>Cunha, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+binding+leads+to+diverse+regulatory+responses:+Lmd+is+a+tissue-specific+modulator+of+Mef2+activity.">Combinatorial binding leads to diverse regulatory responses: Lmd is a tissue-specific modulator of Mef2 activity.</a> PLoS genetics. 6, e1001014 (2010).</li><li>Sandmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+transcriptional+network+for+early+mesoderm+development+in+Drosophila+melanogaster.">A core transcriptional network for early mesoderm development in Drosophila melanogaster.</a> Genes, &amp; development. 21, 436-449 (2007).</li><li>Kvon, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+functional+characterization+of+Drosophila+developmental+enhancers+in+vivo.">Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo.</a> Nature. 512, 91-95 (2014).</li><li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 9715-9720 (2008).</li><li>Gallo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REDfly+v3.0:+toward+a+comprehensive+database+of+transcriptional+regulatory+elements+in+Drosophila.">REDfly v3.0: toward a comprehensive database of transcriptional regulatory elements in Drosophila.</a> Nucleic acids research. 39, D118-D123 (2011).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature protocols. 7, 1534-1550 (2012).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li><li>Doyle, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+translational+profiling+approach+for+the+comparative+analysis+of+CNS+cell+types.">Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types.</a> Cell. 135, 749-762 (2008).</li><li>Dougherty, J. D., Schmidt, E. F., Nakajima, M., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+approaches+to+RNA+profiling+data+for+the+identification+of+genes+enriched+in+specific+cells.">Analytical approaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched in specific cells.</a> Nucleic acids research. 38, 4218-4230 (1093).</li><li>Fomchenko, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruited+cells+can+become+transformed+and+overtake+PDGF-induced+murine+gliomas+in+vivo+during+tumor+progression.">Recruited cells can become transformed and overtake PDGF-induced murine gliomas in vivo during tumor progression.</a> PloS one. 6, e20605 (2011).</li><li>Helmy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+global+alteration+of+translational+regulation+glioma+in+vivo.">Identification of global alteration of translational regulation glioma in vivo.</a> PloS one. 7, e46965 (2012).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification.">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li><li>Drane, L., Ainsley, J. A., Mayford, M. R., Reijmers, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+mouse+line+for+collecting+ribosome-bound+mRNA+using+the+tetracycline+transactivator+system.">A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system.</a> Frontiers in molecular neuroscience. 7, 82 (2014).</li><li>Yoon, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance.">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li><li>Watson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+translational+profiling+in+the+Xenopus+laevis+retina.">Cell type-specific translational profiling in the Xenopus laevis retina.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 241, 1960-1972 (2012).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1/Stat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration.">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13416-13421 (2013).</li><li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish.">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li><li>Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+analysis+of+translating+RNAs+in+developing+flowers+reveals+new+levels+of+control.">Cell-type specific analysis of translating RNAs in developing flowers reveals new levels of control.</a> Molecular systems biology. 6, 419 (2010).</li><li>Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+method+for+cell-specific+profiling+of+translated+mRNAs+in+Drosophila.">A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila.</a> PloS one. 7, e40276 (2012).</li><li>Huang, Y., Ng, F. S., Jackson, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Larval+and+Adult+Drosophila+Astrocytes+Reveals+Stage-Specific+Gene+Expression+Profiles.">Comparison of Larval and Adult Drosophila Astrocytes Reveals Stage-Specific Gene Expression Profiles.</a> G3. , (2015).</li><li>Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+nuclei+purification+from+whole+animals+for+genome-wide+expression+and+chromatin+profiling.">Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling.</a> Genome Res. 22, 766-777 (2012).</li><li>Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+genomics+of+Drosophila+neurons.">Cell type-specific genomics of Drosophila neurons.</a> Nucleic acids research. 40, 9691-9704 (2012).</li><li>Dobi, K. C., Halfon, M. S., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+analysis+of+muscle+founder+cells+implicates+the+chromatin+regulator+Sin3A+in+muscle+identity.">Whole-genome analysis of muscle founder cells implicates the chromatin regulator Sin3A in muscle identity.</a> Cell reports. 8, 858-870 (2014).</li><li>Salmand, P. A., Iche-Torres, M., Perrin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+cell+sorting+from+Drosophila+embryos:+application+to+gene+expression+analysis.">Tissue-specific cell sorting from Drosophila embryos: application to gene expression analysis.</a> Fly. 5, 261-265 (2011).</li><li>Busser, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+underlying+the+regulatory+specificity+of+a+Drosophila+homeodomain+protein+that+specifies+myoblast+identity.">Molecular mechanism underlying the regulatory specificity of a Drosophila homeodomain protein that specifies myoblast identity.</a> Development. 139, 1164-1174 (2012).</li><li>Rorth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gal4+in+the+Drosophila+female+germline.">Gal4 in the Drosophila female germline.</a> Mechanisms of development. 78, 113-118 (1998).</li><li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+element+vectors.">Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.</a> Science. 218, 348-353 (1982).</li><li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes.">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Papier beschreibt eine modifizierte Translating Ribosom Affinitätsreinigung Protokoll (genannt &quot;TRAP-rc &#39;) auf die Untersuchung von seltenen Zellpopulationen in Drosophila-Embryos gewidmet. Informationen über die wesentlichen Schritte für eine erfolgreiche Isolierung von spezifischen RNA mit einer Ausbeute geeignet für Microarray-oder RNA-seq-Analyse, dh 1) Menge an biologischem Material erforderlich ist und optimierte Verfahren für die Embryo-Lyse und Polysom ​​Extraktion bereitgestellt; 2) Perlen / Antikörper-to-Lysat Verhältnissen für eine optimale Immunfällung; 3) die Schritte ermöglicht Reduzierung der Hintergrund einschließlich Waschpuffer-Zusammensetzung, um TRAP-rc Experimente mit hoher Spezifität und Sensitivität geführt. Dieses Protokoll liefert reproduzierbare Daten macht es leicht auf andere Zelltypen verwendet. Diese Technik ermöglicht es, differentiellen Genexpression auf der Ebene der aktiv-Übersetzung von mRNA zu analysieren und damit den Weg zum Verständnis der Proteinexpression in einer spec<html> ific Zelltyp in einem bestimmten Zeitfenster. Man beachte jedoch, dass Proteinmenge wird auf die Geschwindigkeit der Übersetzung und Abbauprozesse abhängen. Eine Hauptbeschränkung der Trap-Verfahren ist die Unfähigkeit, Proteingehalt in einer genauen quantitativ zu messen oder posttranslationale Modifikation detektieren. Verbesserung der Quantifizierung durch Messung Ribosom Dichte entlang der mRNA Körper und, damit, in einem zelltypspezifische Weise können TRAP kombiniert mit Ribosomen-Footprinting ein sehr leistungsfähiges Werkzeug zu machen. In einer aktuellen Arbeit 34 wurde diese Verbindung in menschliche embryonale Nieren-293-Zellen durchgeführt. Die Autoren lief Nuklease Footprinting, gefolgt von Affinitätsreinigung eines induzierbaren biotinylierten Form RpL10A mit Streptavidin-Kügelchen. Dies ist ein Beweis für das Prinzip, daß es möglich ist, Ribosom-Footprinting in einem gesamten Organismus durchzuführen, während Targeting eines spezifischen Zelltyps, die Begrenzung wobei die Menge des biologischen Materials zum Zwecke erforderlich. &quot;&gt; Darstellende TRAP Experimenten parallel globale Transkriptom Analysen ermöglichen es, Proportionen zwischen neu transkribiert und actively- übersetzen RNA. Diese wird tief informative der potenziellen posttranskriptionale Mechanismen, die sich in spezifischen Entwicklungszusammenhängen oder spezifischer Zellpopulationen sein verfolgen -durch microRNAs zum Beispiel. Zusammenfassend ist TRAP eine hoch effiziente, spezifische und sensitive Methode zur Identifizierung RNAs aktiv umsetze Ribosomen in einer zellspezifischen Weise gebunden. Dieses Verfahren kann in einer breiten Vielfalt von Organismen und Gewebetypen verwendet werden. Das hier beschriebene neue TRAP-rc-Protokoll wurde für seltene Zellpopulationen (weniger als 1% der Gesamtzellzahl) und für eine Menge von Endmaterial ausreichend für spätere Analysen bei Gesamtgenom-Niveau optimiert. Eine mögliche Einschränkung dieses Verfahrens ist das Erfordernis einer starken Treiber, den markierten Ribosomen in ausreichender Menge zu produzieren, um compete mit endogenen untagged diejenigen in der Zielzelltyp. In einer neueren Studie 25. geschätzten Autoren zu 10-30% das Verhältnis von markierten gegen unmarkierte Ribosomen. Um dieses Problem zu steigenden UAS-RpL10A-EGFP Kopienzahl sollte dieses Gleichgewicht deutlich verbessern zu überwinden. Alternativ, zusätzlich zu den beschriebenen genetischen Hintergrund ein UAS-GAL4-Transgens wird die Produktion von GAL4-Protein zu verstärken und die Expression von RpL10A-EGFP indirekt zu erhöhen. Dies sollte eine bessere Auslastung von markierten Ribosomen auf mRNA begünstigen. Beachten Sie, dass dies bereits effizienten Ansatz kann noch leistungsfähiger durch Anpassung komplementäre Methoden, um einen quantitativen Aspekt zu bringen oder zu entdecken und zu entwirren, die molekularen Mechanismen, die für die Genexpression Kontrolle vorgenommen werden.

Zu verstehen, wie Zellen während der Entwicklung bestimmte Eigenschaften zu erwerben, ist, um die Komplexität der Organe und deren potenzielle Entwicklung hin zu pathologischen Bedingungen zu schätzen wissen von entscheidender Bedeutung. Es gibt einen großen Forschungs Push, um die Gen-regulatorischen Netzwerke, die das Zell Spezifizierung und Differenzierung zugrunde liegen durch unrevealing globalen Genexpressionsprofile zu entziffern, Pol II bindenden Status, Transkriptionsfaktor-Belegung am regulatorischen Sequenzen bzw. post-translationale Modifikationen von Histonen. Um die Genexpression auf globaler Ebene Microarrays zu bewerten und RNA-seq Ansätze verwendet. Microarrays erlauben, mRNA-Häufigkeit zu erkennen, während RNA-seq ist besser auf die Information über die verschiedenen Arten von RNAs einschließlich codierenden und nichtcodierenden RNAs wie microRNAs, lncRNAs oder snRNAs. Jedoch können diese Techniken nicht zu unterscheiden aktiv transkribierten, stationären mRNA aktiv umsetze mRNA und mRNA in die Abbauprozess. Mess stationären staß mRNA-Spiegel ist bekannt, dass eine schlechte Schätzung des Proteoms Zusammensetzung 1-3 sein. Im Gegenteil, die Identifizierung aktiv-Übersetzung von mRNA ergibt ein genaueres Bild der Proteinproduktion. Allerdings transkriptomischen Studien vor allem auf ganze Organismus Ebene durch den Vergleich Gewinn oder Verlust der Funktion eines bestimmten Faktor zu Wildtyp-Zustand 4-7 oder seziert Gewebe, so dass Genexpressionsprofile schwer zu interpretieren geführt worden. Jüngste Fortschritte in der Zell-Targeting-Tools, Affinitätsreinigung und Empfindlichkeit Verbesserungen erlauben jetzt ausführen genomweiten Analysen zu kleinen Zellpopulationen oder sogar einzelne Zellen in einem lebenden Organismus. In Drosophila, große Sammlungen von transgenen Linien ermöglichen es, bestimmte zeitliche und räumliche Ausrichtung der verschiedenen Geweben und Zellpopulationen über den GAL4 / UAS-System 8-10 wodurch genauere Quantifizierung der molekularen Mechanismen für die Zellfunktion notwendig. 11 beschrieben. Diese Methode basiert auf Sucrosegradientenzentrifugation ermöglicht die Auswahl der Polysomen-Fraktion und Bestimmung von mRNA übersetzt genomweite, wenn sie mit Microarrays oder tiefe Sequenzierung analysiert. Polysom ​​Isolation kann mit Nucleaseverdau um ribosomale Fußabdrücke entsprechenden RNA-Fragmente durch die Ribosomen während des Übersetzungsprozesses 12 geschützt identifizieren gekoppelt werden. Ribosomalen Footprinting erhöht die Genauigkeit der Quantifizierung der RNA-Translation und RNA-Sequenzlevel Auflösung und Ribosom Positionierung ermöglicht es, Translationsrate zu messen. Jedoch ist es bis heute nicht zellspezifische Isolierung translatomes aufgebracht worden ist, vor allem aufgrund der starken Abnahme der RNA-Ausbeute am Ende des Ribosoms Footprinting Verfahren erhalten. Da die Größenauswahl der RNA kann potenzielle Falsch p zu erzeugenositives aus verschiedenen RNPs, die auch sein könnte Schutz RNA auf ähnliche Weise werden weitere Entwicklungen notwendig, um ribosomale Fußabdruck zu verbessern und ihre Anpassung an zellspezifische Ansätze. Eines dieser Verfahren, die so genannte Translating Ribosom Affinitätsreinigung (TRAP) wurde im Jahr 2008 von Heiman et al. und auf die translatome aus einer Untergruppe von Neuronen bei Mäusen zu isolieren. Durch Epitop-Markierung des ribosomalen Proteins in einem zelltypspezifischen Weise kann Polysomen selektiv ohne den mühsamen Schritt der Zelldissoziation und Sortierung gereinigt werden. In diesem Fall wurde die 60S ribosomale Protein L10a an der Oberfläche des Ribosoms mit eGFP 13 markiert. Seit 2008 haben mehrere Studien diese Methode in verschiedenen Arten verwendet werden, die von Mäusen 14-19 bis X laevis 20,21, Zebrafisch 22,23 und Arabidopsis thaliana 24. Die TRAP-Methode wurde auch auf die Drosophila-Modell angepasst und verwendet nach Purify Zelltyp-spezifischen mRNAs von neuronalen Zellen 25 und 26 Astrozyten. Die vielseitige binären GAL4 / UAS-System wurde verwendet, um die GFP-markierten RpL10A in einer gewebespezifischen Weise exprimieren. Leiter der erwachsenen Fliegen wurden seziert, um Polysom ​​Auswahl aus neuronalen Zellen (von pan-neuronalen Elav-Gal4-Treiber gezielte) und isolierten RNAs durchzuführen, wurden sequenziert. Die große Zahl der hochregulierten Genen entsprachen denen bekannt ist, im Nervensystem exprimiert werden, was darauf hinweist, dass der Ansatz eine gute Spezifität und uns eingibt, um es in seltenen Zellpopulationen anzupassen (weniger als 1% der Zellen) vorhanden entwickeln Drosophila-Embryonen . Innerhalb der Drosophila-Modell ist das Embryonalstadium ein Modell der Wahl für die Untersuchung von Entwicklungsprozessen, wie die molekularen Akteure und Gestaltungsbewegungen sind evolutionär konserviert. Die einzigen Gewebe-spezifische transkriptomischen Ansätze bisher in diesem Modell durchgeführt wurden unter Verwendung von Zellen oder Kern sorting und haben nur einen stabilen Zustand für Transkriptom 27-31 Studie nachgewiesen, wodurch ein Bedarf für Verfahren, um Gewebe / Zell-spezifische translatome Profilierungsfliegenembryo gewidmet. Hier haben wir die erste TRAP-Protokoll, um Drosophila-Embryos gewidmet melden. Mit diesem Verfahren Eingriff-in-Übersetzung mRNA in einer sehr begrenzten Zellpopulation von etwa 100 Muskelzellen pro Embryo wurde erfolgreich mit hoher Qualität und Spezifität isoliert. Der binäre GAL4 / UAS-System wird verwendet, um die Expression von GFP-markierten RpL10A in Subpopulation von Muskeln ohne Toxizität zu fahren, da keine scheinbare Phänotypen oder Entwicklungsverzögerung zuvor. 25 gezeigt Drosophila-Embryos besitzen 30 Muskeln pro hemisegment, die Anlass zu der Muskulatur geben der Larve. Durch Verwendung einer regulatorischen Region in der Nähe der Niete Identität Gen entdeckt, 6 der 30 mehrkernigen Muskeln, werden angezeigt. In diesem Test werden die Ribosomen auf der mRNA unter Verwendung des immobilisierten TranslationselongationInhibitor Cycloheximid. Cytosolische Extrakte werden dann zur Affinitätsreinigung mit GFP Antikörper-beschichteten magnetischen Perlen verwendet. Qualität der gereinigten RNA wurde unter Verwendung Bioanalyzer validiert. Quantitative reverse Transkriptions-PCR (RT-qPCR) wurde verwendet, um die Spezifität und Empfindlichkeit der Isolierung der mRNA zu bestimmen, und gezeigt, dass unsere verbesserte Protokoll ist sehr effizient.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>H4034-1006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&amp;nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850306P</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>thermo scientific&amp;nbsp;</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Purified BSA 100X&amp;nbsp;</td><td>Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Super RNase In&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Antibody GFP clone N86/38</td><td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated</td><td>75-132&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11754595001</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 Lysis homogenisation&amp;nbsp;</td><td>Bertin Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water&amp;nbsp;</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads ProteinG</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Applied Biosystem&amp;nbsp;</td><td>AM96406</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl2)&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystem&amp;nbsp;</td><td>AM95306</td><td></td></tr><tr><td>Cellulose waddin unbleached&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>115-2597&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sieves 112, 355, 710 um&amp;nbsp;</td><td>Retsch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRiZol&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>MagRack 6</td><td>GE HealthCare&amp;nbsp;</td><td>28948964</td><td></td></tr><tr><td>Low binding filter tips&amp;nbsp;</td><td>ClearLine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rnase free tube 1.5 ml&amp;nbsp;</td><td>ClearLine</td><td>390689DD</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&amp;nbsp;</td><td>Fischer Bioreagent&amp;nbsp;</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C1985</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr></tbody></table>

trap-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of drosophila embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

Die Drosophila embryonalen somatischen Muskulatur wird von 30 Muskeln pro hemisegment zusammengesetzt, und jeder Muskel hat einen bestimmten Satz von Eigenschaften: Codeidentitätsgene, Position, Anzahl der Fusionsereignisse, Befestigungsstellen und Innervation. Identifizieren übersetzt mRNA in einer bestimmten Muskeluntergruppe geben Informationen über die erforderlich ist, um diese spezifische Muskel Eigenschaften bilden Proteine. Verwenden des TRAP-basierte Verfahren, RNA aus einer Subpopulation von Muskeln, die Identität Gen slouch exprimiert, wurde gereinigt (1A-B). Ein wichtiges Anliegen für diesen Ansatz ist die Qualität und die Spezifität der isolierten RNA. Die optimierte Protokoll hier berichteten aktiviert systematische Verwertung von hochwertigen RNA mit Bioanalyzer-Analyse beurteilt. Die erhaltenen Profil zeigt keinen Abbau von RNA (Abbildung 1c). In anderen Studien in der Trap-Verfahren entwickelt wurden Fragen über die Spezifität der Daten erhöht. Here we imü ssen die Methode zum Hintergrund nicht-spezifischer Bindung der RNA an die Kügelchen oder die Rohre und durch die Optimierung des Waschpuffers verbunden drücken. Um die Hintergrundebene und Effizienz der Isolierung slouch-exprimierenden Zellen zu bewerten, führten wir RT-qPCR-Studien auf 3 Wiederholungen des gleichen embryonalen Stadium. Fold-Anreicherungen von 4 verschiedenen Genen (MEF2, slouch, Prospero, soxNeuro) wurden im Vergleich zum Ein- und normalisiert gegen die RpL32 Gen (1D) berechnet. Diese Ergebnisse zeigten, 2,3-fache Anreicherung der pan-Muskelgens MEF2 und 5,6-fache Anreicherung der slouch Gens. Dagegen sind die beiden Gene in das Nervensystem exprimiert wurden, verglichen mit abgereichertem Eingang. Sehr ähnlich fache Änderung Werte wurden auf 3 biologischen Replikaten beobachtet, was zeigt, dass das Protokoll ist robust. Mit Slouch-Gal4-Treiber und ausgehend von 1,5 g, rund 1,5x10 ^ 6 Embryonen wurden gewonnen, die 100 GFP Zellen / Embryos (insgesamt 150 x 10 ^ 6 positive enthaltenZellen). Nach dem Ausführen des TRAP Experiment ist die Ausbeute in der Umgebung von 25 bis 45 ng spezifische RNA je auf der Bühne von Interesse. Dieses Material ist genug, um Microarray-Analyse oder RNA-seq Verwendung eines Amplifikationsprotokoll um ein RNA-seq-Bibliothek zu erstellen ausführen. Effizienz wird stark von der Stärke der verwendet wird, um RpL10A-EGFP exprimieren Treiber abhängen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> Abbildung 1. Qualität und Spezifität Beurteilung der TRAP-isolierte RNA aus Slouch-GAL4&gt; UASRpL10A-EGFP Embryonen. (AB) Konfokale Bilder von einem Stadium 16-Embryo, welches RpL10A-EGFP-Expression spezifisch in den sechs Slouch Muskelzellen pro hemisegment (A). Co-Lokalisation von RpL10A-EGFP mit dem allgemeinen Muskelmarkierung Beta3tubulin auf Merge-Bild (B) beobachtet. (C) Qualitätskontrolle von RNA Traped ran auf Bioanalyzer zeigt perfekte Integrität rRNA 18S und 28S. (D) RT-qPCR-Analyse, die hohe Spezifität der TRAP-isolierte mRNA Experimente an biologischen 3 Wiederholungen der Stufe-16-Embryonen. Falten Änderung im Vergleich zum Ein- und normalisiert gegen die RpL32 Gens berechnet. In allen Muskelabstammungslinien vorhanden MEF2 Transkripte sind 2,3-fach angereicherte im Vergleich zum Eingang der Erwägung, dass mehr eingeschränkt slouch Transkripte sind 5,6-fach angereicherte. Nervenzellen prospero ausdrücken und soxN Gene sind erschöpft 2,2-fach und 5,5-fach auf. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

TRAP-rc, Translating Ribosom Affinitätsreinigung von Rare Zellpopulationen<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Research

JoVE Journal

Biology

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

17.8K Aufrufe.  University of Clermont-Ferrand. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos. 

Serie: TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small numbers of cells. Utilizing this technology to study development in the Drosophila visual system, which boasts a wealth of cell type-specific genetic tools, provides a powerful approach for addressing the molecular basis of development with precise cellular resolution. For such an approach to be feasible, it is crucial to have the capacity to reliably and efficiently purify cells present at low abundance within the brain. Here, we present a method that allows efficient purification of single cell clones in genetic mosaic experiments. With this protocol, we consistently achieve a high cellular yield after purification using fluorescence activated cell sorting (FACS) (~25% of all labeled cells), and successfully performed transcriptomics analyses on single cell clones generated through mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM). This protocol is ideal for applying transcriptomic and genomic analyses to specific cell types in the visual system, across different stages of development and in the context of different genetic manipulations.

Here, we present a cell dissociation protocol for efficiently isolating cells present at low abundance within the Drosophila visual system through fluorescence activated cell sorting (FACS).

Reinigung des Low-reichlich Zellen im visuellen System von Drosophila

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

Forschung

Genetik

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Biochemie

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, organism development, and disease. It is often desirable to obtain PPI information using in vivo material, to gain the most natural and unbiased view of the interaction networks. The fruit fly Drosophila melanogaster is an excellent platform to study PPIs in vivo, and lends itself to straightforward approaches to isolating material for biochemical experiments. In particular, fruit fly embryos represent a convenient type of tissue to study PPIs, due to the ease of collecting animals at this developmental stage and the fact that the majority of proteins are expressed in embryogenesis, thus providing a relevant environment to reveal most PPIs. Here we present a protocol for collection of Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g), which is an ideal amount for a wide range of proteomic applications, including analysis of PPIs by affinity purification-mass spectrometry (AP-MS). We describe our designs for 1 L and 5 L cages for embryo collections that can be easily and inexpensively set up in any laboratory. We also provide a general protocol for embryo collection and protein extraction to generate lysates that can be directly used in downstream applications such as AP-MS. Our goal is to provide an accessible means for all researchers to carry out the analyses of PPIs in vivo.

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

The goal of this protocol is to provide a straightforward and inexpensive approach to collecting Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g) and preparing protein extracts that can be used in downstream proteomic applications, such as affinity purification-mass spectrometry (AP-MS).

Mittelmaßnahme Vorbereitung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoextrakte für Proteomversuche

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Entwicklungsbiologie

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis of transcriptome and gene expression by qPCR and RNA sequencing. Comprehensive transcriptome and gene expression analysis of specific cell types in complex tissues and organs will be critical to understand cellular and molecular mechanisms by which genes are regulated and their association with tissue homeostasis and organ functions. In this article, we demonstrate the methodology for isolation of ribosome-bound RNA directly in vivo in the vascular endothelia of animal lungs as an example. The specific materials and procedures for tissue processing and RNA purification will be described, including the assessment of RNA quality and yield as well as real time qPCR for arteriogenic gene assays. This approach, known as translating ribosome affinity purification (TRAP) technique, can be utilized for characterization of gene expression and transcriptome analysis of certain cell types directly in vivo in any specific type in complex tissues.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We present an approach to purify ribosome-bound mRNA from vascular endothelial cells (ECs) directly in mouse brain, lung and heart tissues via EC-specific genetic tag of enhanced green fluorescence protein (EGFP)in ribosomes in combination with RNA purification.

Übersetzen von Ribososomen-Affinitätsreinigung (TRAP) zur RNA-Isolierung von Endothelzellen In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

Übersetzen von Ribosome Affinity Purification (TRAP) zur Untersuchung der Arabidopsis thaliana Wurzelentwicklung in einer zelltypspezifischen Skala

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

RiboTag Immunpräzipitation in den Keimzellen der männlichen Maus

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Biologie

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads von Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

Ein In vivo Vernetzung Ansatz zur Proteinkomplexe Von Isolieren Drosophila Embryonen

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Affinity-basierte Isolierung von Tagged Kerne aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Tücher für Genexpressionsanalyse

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

TRAP-rc, Translating Ribosom Affinitätsreinigung von Rare Zellpopulationen

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Übersetzen von Ribosome Affinity Purification (TRAP) zur Untersuchung der Arabidopsis thaliana Wurzelentwicklung in einer zelltypspezifischen Skala

RiboTag Immunpräzipitation in den Keimzellen der männlichen Maus

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Ein In vivo Vernetzung Ansatz zur Proteinkomplexe Von Isolieren Drosophila Embryonen

Affinity-basierte Isolierung von Tagged Kerne aus