Diese Arbeit wurde durch eine Wellcome Trust Senior Fellowship verliehen an Dr. Ian Goodfellow finanziert.

1. Generierung von Zelllinien: pMEP4 Transfektion / expression <ol><li> Transfektion von Zellen mit dem Expressionsvektor pMEP4 und wählen Sie mit 100 ug Hygromycin B / ml (Roche), bis alle mock-transfizierten Zellen getötet wurden ausgeschaltet. Die pMEP4 Plasmid episomal so gibt es keine Notwendigkeit, spezifische Klone zu isolieren gehalten. </li><li> Zellen, welche die pMEP4 Vektor kann durch Behandlung mit 10 uM CdCl 2 für 16 Stunden induziert werden. Expression und Induzierbarkeit sollte im kleinen Maßstab vor der Verstärkung der Zelllinien bestätigt werden. Der TAP-markierte Protein kann leicht nachgewiesen werden, da die Protein-G-Domänen an Antikörper aus fast allen Arten. Für großflächige Reinigungen in der Regel 10 konfluente 175 cm 2-Kolben von Zellen erforderlich sind. Dies entspricht etwa 2 X10 8 exprimierenden Zellen. </li></ol> 2. Zelllysate Herstellung <ol><li> Kratzen Sie Zellen in PBS und kombinieren in einem einzigen 50 ml Tube. Spin 1200X gfoder 5 Minuten (dies sollte in 2-3 ml gepackten Zellen zur Folge haben, mit zu beginnen, das reduziert sich auf etwa 1,5 ml nach dem Waschen). </li><li> Waschen Sie die Zellen dreimal in eiskaltem PBS (50 ml jedes Mal). </li><li> Lyse Zellen in 5 ml Lysepuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 125 mM NaCl, 5% Glycerin, 0,2% NP-40, 1,5 mM MgCl 2, 25 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4 und Protease-Inhibitor ). Hinweis: NaF, Na 3 VO 4 und Protease-Inhibitoren sollte hinzugefügt werden frisch. Und Abpipettieren 10-mal, bevor er nach 5 Minuten auf Eis. Spritze auf und ab 5-10 mal mit einer stumpfen Nadel, bevor er wieder auf Eis für 5 Minuten auf Eis. Wiederholen Sie Ausspritzen und lassen für weitere 5 Minuten auf Eis. </li><li> Frost-Tau-Lysat zweimal (flüssigem N 2 / oder Trockeneis und Ethanol). Nicht Probe mehr als 4 ° C zu erreichen Hinweis: Sie können dieses Beispiel bei -80 ° C lagern, bis Sie Zeit zu verarbeiten haben. </li><li> Aliquoten in 1,5 ml Röhrchen und entfernen lysierten Zellen und debris durch Zentrifugation (10 Minuten bei 4 ° C, 16.000 × g). </li><li> Recover Überstand, in einem 15 ml Falcon Röhrchen verbinden und (optional) durch einen 0,45 um Filter zu passieren, bevor sie eine 20 ul Probe für die Ausbeute an Protein Quantifizierung. Entfernen Sie weitere 50 ul-Aliquot für die anschließende Analyse (Probe 1). </li></ol> 3. Die Bindung an Kaninchen-IgG-Agarose (Hinweis: Alle Spins sollte bei 1200X g durchgeführt werden in einer gekühlten Zentrifuge bei 4 ° C für 1 Minute, wenn nicht anders angegeben) <ol><li> Vorsichtig resuspendieren Kaninchen-IgG-Agarose-Lösung (Sigma-Aldrich) durch Verwirbelung Flasche. Nehmen Sie 380 ul IgG Agarose (bei einem Cutoff 1ml Pipettenspitze) lösen und Versand / Konservierungsmittel Lösung durch Zentrifugation für 1 Minute. Waschen der Agarose dreimal in gekühltem Lysepuffer (4 ° C) durch Zentrifugation geklärt. Die endgültige Ausbeute von Agarose sollte etwa 250 ul verpackt Perlen sein. </li><li> Fügen Sie die gelöscht Zelllysat von 2,6 (in einem 15 ml-Falcon-Wannee) zur gewaschenen Kaninchen-IgG Agarose und Inkubieren für 3 Stunden (oder über Nacht) bei 4 ° C unter Verwendung eines rotierenden Mischers. </li><li> Spin-Down der Agaroseperlen für 5 Minuten bei 4 ° C und entfernen Sie den Überstand für die anschließende Analyse (Probe 2). Hinweis: Die TAP-markierte Protein sollte nun mit den Perlen in Verbindung gebracht werden. </li></ol> 4. TEV-Protease-Spaltung (Hinweis: Alle Spins sollte bei 1200X g durchgeführt werden in einer gekühlten Zentrifuge bei 4 ° C für 1 Minute, wenn nicht anders angegeben) <ol><li> Waschen Sie die Kaninchen-IgG-Agarose-Beads dreimal in gekühltem Lysepuffer (4 ° C) durch Zentrifugation geklärt (Hinweis: Die Lyse-Puffer sollten keine Protease-Inhibitoren). Es sollte darauf geachtet nicht zu entfernen oder verlieren alle Perlen während der Waschschritte werden. </li><li> Waschen der Kügelchen noch zweimal mit TEV-Protease Spaltpuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl und 0,2% NP-40) durch Zentrifugation geklärt. Nach dem letzten Waschen sorgfältig entfernen liquid von den Kügelchen. </li><li> Bereiten Sie eine TEV-Protease-Spaltung Mix; für jede Probe enthalten 467,5 ul H 2 O, 25 ul 20x TEV Buffer (Invitrogen), 5 ul 0,1 M DTT und 2,5 ul (25 U) TEV-Protease (Invitrogen). Fügen Sie 500 ul dieser TEV-Spaltung Mix zu jeder Probe von Kügelchen verpackt und überweisen Sie den gesamten Mix zu einer 1,7-ml-Tube geschmiert (Costar). Vor der Inkubation Entfernen eines 30 ul Aliquot für die anschließende Analyse (Probe 3). </li><li> Inkubieren Sie die TEV-Protease-Reaktion über Nacht bei 4 ° C unter Verwendung eines rotierenden Mischers. Beachten Sie, dass kürzere Zeiten verwendet Inkubationen können je nach Art des Bait-Protein und die Zugänglichkeit der TEV-Protease-Spaltstelle, aber der minimale Inkubationszeit werden sollte empirisch bestimmt werden. </li></ol> 5. Bindung an immobilisiertes Streptavidin Plus-Perlen Ultralink (Hinweis: Alle Spins sollte bei 1200X g durchgeführt werden in einer gekühlten Zentrifuge bei 4 ° C für 1 Minute, wenn nicht anders angegeben) </p&gt; <ol><li> Zentrifugieren der TEV-Spaltung, die die Kaninchen-IgG Agarosekügelchen für 5 Minuten bei 1200X g (4 ° C). Nehmen Sie einen 20 ul Aliquot der geklärte Überstand zur Analyse (Probe 4) </li><li> Übertragen Sie die verbleibende Überstand (etwa 480 ul) in ein frisches 1,5-ml-Tube geschmiert (Costar) und lassen Sie diese auf Eis. Werfen Sie diesen Überstand - das enthält Ihre TEV gespalten Köderprotein und alle zugehörigen bindenden Proteinen. </li><li> Fügen Sie 500 ul gekühlt Lysepuffer (Abschnitt 2.3) zu den übrigen Kaninchen-IgG-Agarose-Beads und resuspendieren. Zentrifuge dieser Mischung, um die Kügelchen vor dem Entfernen des Überstandes und die Kombination mit dem aus Schritt 5.2 klären. Lassen Sie dieses Röhrchen auf Eis (es sollte nun ~ 980 ul Probe). </li><li> Behalten Sie die Kaninchen-IgG-Agarose-Beads für die anschließende Analyse (Probe 5). Hinweis: Wenn Sie dieses Beispiel auf einem SDS-PAGE-Gel (oder Western-Blot) startet, benötigt es eine Menge Hintergrund aufgrund der Anwesenheit der schweren und leichten IgG gebenKetten. </li><li> Inzwischen vorsichtig resuspendieren Ultralink immobilisiertes Streptavidin Plus-Agarose-Beads (Pierce) durch Schwenken der Flasche. Mit Hilfe eines 200 pl Pipettenspitze mit dem Ende geschnitten, 70 ul Aliquot Streptavidinbeads pro Probe in die Vor-geschmiert 1,5 ml Röhrchen und entfernen Versand / Konservierungsmittel Lösung durch Zentrifugieren. Hinweis: diese Perlen sind sehr klein und so &quot;Duck-billed&quot; oder flach / spitz zulaufenden Spitzen können verwendet werden, um Beadverlust beim Waschen zu minimieren. </li><li> Waschen der Streptavidin-Kügelchen dreimal in Lysepuffer gekühlt (4 ° C) durch Zentrifugation geklärt. Dies sollte zu verlassen ca. 45-50 ul verpackt Perlen pro Röhre. </li><li> Übertragen der TEV-Protease-Schnittstelle Überstand (dh der 980 ul Probe aus Schritt 5.3) auf das Rohr mit der gewaschenen Streptavidin-Kügelchen und Inkubation für 3 Stunden (oder über Nacht) bei 4 ° C unter Verwendung eines rotierenden Mischers. </li><li> Spin-Down der Streptavidinbeads für 5 Minuten bei 4 ° C und entfernen Sie den Überstand für die anschließende Analyse (SamPLE 6). Waschen der Streptavidin-Kügelchen dreimal in Lysepuffer gekühlt (4 ° C) durch Zentrifugation geklärt. Nach dem letzten Waschen, sorgfältig entfernen Sie alle verbleibenden Waschpuffer. </li></ol> 6. Biotin Elution der Streptavidin bindende Peptid-und Protein-Köder (Hinweis: Alle Spins sollte bei 1200X g durchgeführt werden in einer gekühlten Zentrifuge bei 4 ° C für 1 Minute, wenn nicht anders angegeben) <ol><li> Eluiert markierte Proteine ​​aus den Streptavidin-Kügelchen durch Zugabe von 500 ul PBS: Biotin (1 mM D-Biotin) und Inkubieren bei 4 ° C für 3 Stunden (oder über Nacht) unter Verwendung eines rotierenden Mischers. </li><li> Spin-Down der Streptavidinbeads für 5 Minuten bei 4 ° C und entfernen Sie den Überstand in ein 1,5-ml-Tube geschmiert (Hinweis: Dies ist Ihre letzte Probe / Elution (Probe 7). </li><li> Fügen Sie eine weitere 500 ul Biotin: PBS zu den übrigen Streptavidinbeads und inkubieren Sie bei 4 ° C für 2-3 Stunden (oder über Nacht) mit Hilfe eines rotierenden Mischers. </li><li> ReTorf Schritt 6,2 und verbindet die beiden Elutionen (Probe 7). Dieser abschließende Elution kann bei -80 ° C gelagert werden </li><li> Um die Effizienz der Biotin Elution beurteilen, frieren die restlichen Streptavidinbeads und später in SDS-Probenpuffer (Sample 8) (Empfehlungen: LaneMarker 5x reduzierendem Probenpuffer von Fisher) kochen. </li></ol> 7. Proteinkonzentration <ol><li> Die letzten Eluats (Beispiel 7) muss vor der Analyse wegen der geringen Proteinkonzentration und relativ hohen Volumen konzentriert werden. Dies kann mit niedrigem Molekulargewicht (&lt;5 kDa) Vivaspin Spin Columns (Vivascience). Ziel, um das Volumen zu konzentrieren auf weniger als 100 ul. Diese letzte Probe gekocht und gelagert werden Protein-Probenpuffer (Empfehlungen: LaneMarker 5x reduzierendem Probenpuffer von Fisher). </li></ol> 8. Analyse <ol><li> Beispiele 1-8 können durch Western-Blot analysiert werden, um die Effizienz der Pull-Down-zu bestimmen. Hinweis: Die meisten sekundären AntikörperProtein mit den G-Domänen des Fusionsproteins kreuzreagieren aber nach TEV-Protease-Spaltung entfernt. </li><li> Probe 7 kann durch 1D oder 2D-SDS-PAGE analysiert werden. Die Färbung kann mit Silber oder Coomassie (Empfehlungen: SilverQuest Silberfärbung und Kolloidale Coomassie-Färbung blau-Kits von Invitrogen) werden. Proteinidentifizierung kann mit Hilfe der Massenspektrometrie werden. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel 1D SDS-PAGE-Analyse der endgültigen Elution (Beispiel 7) von diesem Protokoll, um Bindungspartner der TAP markiert eIF4E zu identifizieren, ist in 2 vorgesehen. Dieser Vertreter Gel spiegelt das komplexe und reiche Natur des eIF4E Interaktionen mit anderen Proteinen in der Zelle. Vergleich mit der Negativkontrolle auch in 2 gezeigt, aus einer Zelllinie, die nur die TAP-Tag generiert, zeigt die Spezifität dieses eIF4E Pull-Down-Köder. In diesem Fall 15% der konzentrierten endgültige Elution (Probe7) wurde durch 1D SDS-PAGE unter Verwendung von kommerziell erhältlichen vorgefertigten Gradientengelen, bevor sie gefärbt mit dem Silverquest Silberfärbung Kit von Invitrogen analysiert. Typischerweise 50-85% des verbleibenden konzentrierten endgültige Elution (Beispiel 7) mit kolloidalem Coomassie-Färbung (Invitrogen) analysiert. Die Proben (Gelscheiben / Bänder) aus dem gesamten Bahn wurden dann extrahiert und mittels Massenspektrometrie analysiert. Proteine ​​in dem Pull-Down-eIF4E identifiziert wurden gegen die Bindungspartner aus der negativen Kontrolle auf nicht-spezifische Bindungspartner zu identifizieren filtriert. Die endgültigen Proteine ​​identifiziert mit diesen Verfahren TAP Tagging eIF4E kann in 2, die repräsentativ für die normale Proteine ​​identifiziert unter Verwendung dieser Technik ist, aufgefasst werden. Darüber hinaus wurden eine Reihe von eIF3 Untereinheiten ebenfalls identifiziert (Daten nicht gezeigt). <img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig1.jpg" alt="1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung derTandem-Affinitätsreinigung Verfahren. Die sechs Schritt Tandem-Affinitätsreinigung (TAP)-Protokoll beinhaltet Zelllinie Generation, Zelllyse, Kaninchen IgG Agarose Immunpräzipitation, TEV-Protease-Spaltung, Streptavidin Wulst Affinitätsreinigung und schließlich Biotin Elution. <img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig2.jpg" alt="2" /> Abbildung 2. Tandem Affinitätsreinigung des murinen Proteins eIF4E. Interagierenden Partner des N terminal markierte TAP eIF4E wurden aus eukaryontischen HEK293-Zellen mit dem beigefügten Protokoll gereinigt. Ein 20% Anteil der endgültigen Elution (Beispiel 7) wurde durch SDS-PAGE auf einem vorgefertigten 4-12% Gradientengel (TAP-eIF4E Spur) analysiert. Eine entsprechende Analyse wurde für das Tag allein (TAP Spur) durchgeführt. Die Proteine ​​wurden identifiziert mittels Silberfärbung. Proteine ​​im Massenspektrometer der gleichen Probe identifiziert werden auf diesem Gel hervorgehoben. Abkürzungen: eIF4G; eukaryotischen Translations-Initiations-fSchauspieler Gamma 4, PABP; polyA-bindendes Protein, eIF4A: eukaryotischen Translations-Initiations-Faktor 4 alpha, SBP-eIF4E, die restlichen TAP Köderprotein mit dem Streptavidin-bindende Peptid fusioniert mit dem eukaryotischen Translations-Initiations-Faktor 4E, 4EBPs; eukaryotischen Translations-Initiations-Faktor 4E verbindlich Proteine, eIF4eNiF1l Eukaryoteninitia-4E Kernimport Faktor 1, SBP, die restlichen Streptavidin-Bindungspeptid aus der TEV-fusionierten TAP-Peptid.

<ol>
	<li>Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions.">Protein-protein interactions.</a> Biochem. Soc. Trans. 38 (4), 875-878 (2010).</li><li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Blackwell, C., Brown, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+tandem-affinity+purification+to+Candida+albicans.">The application of tandem-affinity purification to Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 499, 133-148 (2009).</li><li>Cochrane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+complex+formation+between+HIV+Rev+and+the+nucleosome+assembly+protein,+NAP1,+affects+Rev+function.">Stable complex formation between HIV Rev and the nucleosome assembly protein, NAP1, affects Rev function.</a> Virology. 388 (1), 103-111 (2009).</li><li>Fernandez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+tandem+affinity+purification+of+PSD-95+recovers+core+postsynaptic+complexes+and+schizophrenia+susceptibility+proteins.">Targeted tandem affinity purification of PSD-95 recovers core postsynaptic complexes and schizophrenia susceptibility proteins.</a> Mol. Syst. Biol. 5, 269-269 (2009).</li><li>Gloeckner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+affinity+purification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells+by+the+Strep&#47;FLAG+(SF)-TAP+tag.">Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells by the Strep&#47;FLAG (SF)-TAP tag.</a> Methods Mol. Biol. 564, 359-372 (2009).</li><li>Holowaty, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+with+Epstein-Barr+nuclear+antigen-1+reveals+an+interaction+with+the+herpesvirus-associated+ubiquitin-specific+protease+HAUSP/USP7.">Protein profiling with Epstein-Barr nuclear antigen-1 reveals an interaction with the herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease HAUSP/USP7.</a> J. Biol. Chem. 278 (32), 29987-29994 (2003).</li><li>Burckstummer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+tandem+affinity+purification+procedure+for+interaction+proteomics+in+mammalian+cells.">An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 3 (12), 1013-1019 (2006).</li><li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4+E.">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4 E.</a> EMBO Rep. 6 (10), 968-972 (2005).</li><li>Goodfellow, I. G., Roberts, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+initiation+factor+4E.">Eukaryotic initiation factor 4E.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 40 (12), 2675-2680 (2008).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die TAP-Tagging-Technik hier dargestellten demonstriert eine hochspezifische und strengen Verfahren zur Isolierung die Bindungspartner der Köder Proteine ​​in eukaryotischen Zellen. Dieser Ansatz kann sowohl zelluläre und virale Proteine ​​angewandt werden. Nach unserem Wissen ist dies das erste Mal eine solche Technik zum Translationsinitiationsfaktors eIF4E aufgebracht worden ist. Bezeichnung des bekannten eIF4E bindende Proteine ​​eIF4G und den 4EBPs mit dieser Technik bestätigt die Gültigkeit eines solchen Ansatzes. Darüber hinaus ist die Identifizierung der verbleibende Anteil des komplexen eIF4F bestätigt nämlich eIF4A und PABP, dass indirekte Wechselwirkung und tertiären Komplexe intakt während des Reinigungsprozesses bleiben. Die Identifizierung von mehreren Isoformen der kanonischen eIF4E bindenden Proteinen zeigte sich auch. Diese werden im Detail in 2 beschrieben. Im Hinblick auf die Grenzen des Ansatzes, sollte gewisse Sorgfalt im Hinblick auf die Wahl genommen werdender Bait-Protein und ob die TAG-Tag am N-Terminus oder C-zu platzieren. Es könnte sinnvoll sein, um einen funktionellen Test durchführen oder untersuchen die Lokalisation des Fusionsproteins mittels Mikroskopie vor dem Endwert Reinigung, um sicherzustellen, das markierte Derivat ist funktional. Integrale Membranproteine ​​oder nukleare Proteine ​​können nicht unbedingt von den relativ milden Bedingungen in der Lyse-Schritt beschrieben freigegeben werden. Wie bei allen Immunpräzipitationen und ähnliche Pulldown-Assays, unbefugte Änderungen der Art und Konzentration des Waschmittels in dem Lyse-Puffer, um die Effizienz der Lyse zu erhöhen werden. Die Ionenkonzentration der Lyse und Waschpuffer kann auch modifiziert werden, um zu erhöhen oder zu verringern, die Stringenz der Reinigung werden. Es ist auch möglich, die anfängliche Reinigung unter Standardbedingungen milden Bedingungen (oben beschrieben) durchzuführen, aber dann teilt die Streptavidin-Kügelchen (Abschnitt 5.8) in 4-5 Aliquots, die anschließend unter zunehmender Ionenstärke con gewaschen werden könnenbedingungen. Dies kann dem Benutzer ermöglichen, die optimalen Bedingungen, welche die nicht-spezifische interagierende Proteine ​​zu entfernen, zu identifizieren. Der gesamte Prozess kann auch unter Verwendung transienter Transfektion, wenn die interagierenden Partner sind bekannt und ihre Anwesenheit oder Abwesenheit von nachfolgenden Western-Blot nur bestimmt werden. In diesem Fall würden wir vorschlagen, zwei 100cm 2 Gerichte von Zellen mit je 8 pg Expressionsplasmid transfiziert. Dieses modifizierte Verfahren ist von besonderem Nutzen bei der Prüfung der Fähigkeit der mutierten Derivate des TAP-Fusionsprotein mit den bekannten Bindungspartner wechselwirken. Analyse von Proben 1 bis 8 auf Silber gefärbten SDS-PAGE-Gelen (oder durch Western-Blot, wenn ein Antikörper zur Verfügung steht) ist eine hervorragende Möglichkeit der Fehlerbehebung, sollte die Technik versagen, um akzeptable Ergebnisse zu generieren. Die Effizienz der einzelnen Affinität basierte Niederschlag und spezifische Elution kann unter Verwendung dieses systematischen Stichprobenverfahren werden. Die Proben 1-8 sollte während der Optim genommen werdensierung des Protokolls für jede neue Köder. Die TAP-Tagging-Technik bietet eine leistungsstarke und robuste Alternative zu anderen Ansätzen wie GST-Pull-downs, Hefe-Zwei-Hybrid-Assays usw. Die doppelte Affinitätsreinigung und spezifische Elutionsschritte (TEV-Spaltung und Biotin Elution) Spezifität und Stringenz sorgen bei einer aufrecht erhalten werden hohem Niveau über die Reinigungsprozedur. Kritisch kann diese Technik auf jedes Protein angewendet werden und stellt somit eine ausgezeichnete Methode zur Identifizierung von Bindungspartnern für ein Zielprotein von Interesse.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Roche </td><td> 10843555001 </td></tr><tr><td> Rabbit IgG Agarose </td><td> Sigma </td><td> A2909 </td></tr><tr><td> AC-TEV-Protease </td><td> Invitrogen </td><td> 12575-015 </td></tr><tr><td> Protease-Inhibitor-Cocktail </td><td> Calbiochem </td><td> 539134 </td></tr><tr><td> Ultralink immobilisiertes Streptavidin Plus-Perlen </td><td> Durchstechen </td><td> 53116 </td></tr><tr><td> Vivaspin 500 Zentrifugenkonzentrator (5 kDa) </td><td> Vivaspin </td><td> V50112 </td></tr><tr><td> SilverQuest Silberfärbungskit </td><td> Invitrogen </td><td> LC6070 </td></tr><tr><td> Novex Kolloidale Coomassie Blau Färbekit </td><td> Invitrogen </td><td> LC6025 </td></tr><tr><td> 1,7 ml Röhrchen vorgeschmiert</td><td> Costar </td><td> 3207 </td></tr><tr><td> Mikrokapillare Pipettenspitzen </td><td> VWR </td><td> 37001-150 </td></tr><tr><td> NuPage 4-12% Bis-Tris-Gradientengelen </td><td> Invitrogen </td><td> NP0322BOX </td></tr><tr><td> CdCl 2 </td><td> Sigma </td><td> 202908 </td></tr><tr><td> 5x SDS-Probenpuffer </td><td> Fischer </td><td> PN39000 </td></tr></tbody></table>

identification of protein interacting partners using tandem affinity purification

Eine kritische und oft limitierende Schritt zum Verständnis der Funktion des Host und viralen Proteinen ist die Identifizierung von interagierenden zellulären oder viralen Proteins Partner. Es gibt viele Ansätze, die die Identifizierung von interagierenden Partner, einschließlich der Hefe-Zwei-Hybrid-System, sowie Pulldown-Assays unter Verwendung von rekombinanten Proteinen und Immunpräzipitation von endogenen Proteinen durch Massenspektrometrie Kennzeichnung 1 gefolgt ermöglichen. Neuere Studien haben die Nützlichkeit von Doppel-Affinitäts-Tag vermittelten Reinigung mit zwei spezifischen Elutionsschritte bei der Identifizierung von wechselwirkenden Proteinen gekoppelt ist hervorgehoben. Dieser Ansatz, genannt Tandem Affinity Purification (TAP), wurde ursprünglich in der Hefe 2,3 verwendet, aber in jüngerer Zeit wurde angepasst, um in Säugetierzellen verwenden 8.4. Als Proof-of-Konzept haben wir eine Tandem-Affinitätsreinigung (TAP)-Methode etabliert mit dem gut charakterisierten eukaryotischen Translations-Initiations-factor eIF4E 9,10. Die zelluläre Übersetzung Faktor eIF4E ist eine kritische Komponente der zellulären eIF4F Komplex in Cap-abhängige Translation Initiation 10 beteiligt. Der TAP-Tag in der vorliegenden Studie verwendet wird, von zwei Protein G-Bausteinen bestehen und ein Streptavidin-Bindungspeptid von einem Tabak Etch Virus (TEV) Protease-Schnittstelle Sequenz getrennt ist. Der TAP-Tag in der vorliegenden Studie verwendet wird, von zwei Protein G-Bausteinen bestehen und ein Streptavidin-Bindungspeptid durch eine Tabakätzvirus getrennt (TEV) Protease-Schnittstelle Sequenz 8. Um die Notwendigkeit der Erzeugung von klonalen Zelllinien zu verzichten, entwickelten wir ein schnelles System, die auf der Expression des TAP-markierten Proteins aus einem Köder episomal aufrechterhalten Plasmid auf pMEP4 (Invitrogen) auf der Grundlage beruht. Die Expression von Maus-tagged eIF4E aus diesem Plasmid wurde unter Verwendung der Cadmiumchlorid induzierbaren Metallothionein-Promotor. Lysis der exprimierenden Zellen und die nachfolgende Affinitätsreinigung durch die Bindung an rabbit IgG Agarose, TEV-Protease-Spaltung, die Bindung an Streptavidin gebunden Agarose und anschließende Elution Biotin wurden zahlreiche Proteine ​​scheint spezifisch für die eIF4E Pull-down (im Vergleich zu Zelllinien, die das TAP-Tag alleine zu steuern). Die Identität der Proteine ​​wurden durch Ausschneiden der Bänder aus 1D SDS-PAGE und anschließende Tandem-Massenspektrometrie. Die identifizierten Komponenten enthalten die bekannten eIF4E bindende Proteine ​​eIF4G und 4EBP-1. Zusätzlich können andere Komponenten des eIF4F Komplex, bestehend aus dem eIF4E ist eine Komponente identifiziert wurden, nämlich eIF4A und Poly-A-bindendes Protein. Die Fähigkeit, nicht nur bekannt direkten Bindungspartnern sowie sekundäre interagierende Proteine ​​identifizieren weiterer Beleg für die Nützlichkeit dieses Ansatzes in der Charakterisierung von Proteinen mit unbekannter Funktion.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification at JoVE.com

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Tandem Affinitätsreinigung ist ein robustes Verfahren zur Identifizierung von Protein Bindungspartner. Als Proof of Concept wurde die Methode auch auf die gut charakterisierte Translationsinitiationsfaktors eIF4E zu Copräzipitat der Wirtszelle Faktoren in Initiation der Translation beteiligt angewendet. Dieses Verfahren ist einfach einem der zellulären oder viralen Proteins.

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

identification-protein-interacting-partners-using-tandem-affinity

Research

JoVE Journal

Biology

37.3K Aufrufe.  Imperial College London. Tandem Affinitätsreinigung ist ein robustes Verfahren zur Identifizierung von Protein Bindungspartner. Als Proof of Concept wurde die Methode auch auf die gut charakterisierte Translationsinitiationsfaktors eIF4E zu Copräzipitat der Wirtszelle Faktoren in Initiation der Translation beteiligt angewendet. Dieses Verfahren ist einfach einem der zellulären oder viralen Proteins.

Serie: Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Forschung

Biologie

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Reinigung von Hsp104, ein Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Orthogonal Protein Purification von einer kleinen Bispezifische Affinity Tag Facilitated

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Glykosylierung mit speziellen Endo-und Exoglycosidasen

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Ein Protokoll für die Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung, Immunpräzipitation, Quantitative Massenspektrometrie und Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Reinigung von Affinity-markierter rekombinanter Proteine

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. Protein purification protocols should combine efficiency, simplicity and cost effectiveness1. Here, we describe the GST-His method as a new small-scale affinity purification system for recombinant proteins, based on a N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST)2,3 and a C-terminal 10xHis tag4, which are both fused to the protein of interest. The latter construct is used to generate baculoviruses, for infection of Sf9 infected cells for protein expression5. GST is a rather long tag (29 kDa) which serves to ensure purification efficiency. However, it might influence physiological properties of the protein. Hence, it is subsequently cleaved off the protein using the PreScission enzyme6. In order to ensure maximum purity and to remove the cleaved GST, we added a second affinity purification step based on the comparatively small His-Tag. Importantly, our technique is based on two different tags flanking the two ends of the protein, which is an efficient tool to remove degraded proteins and, therefore, enriches full-length proteins. The method presented here does not require an expensive instrumental setup, such as FPLC. Additionally, we incorporated MgCl2 and ATP washes to remove heat shock protein impurities and nuclease treatment to abolish contaminating nucleic acids. In summary, the combination of two different tags flanking the N- and the C-terminal and the capability to cleave off one of the tags, guaranties the recovery of a highly purified and full-length protein of interest.

In the present protocol, we demonstrate a highly efficient and cost-effective small-scale protein purification method, which allows purification of recombinant proteins by uniquely combining a cleavable GST-tag and a small His-tag.

GST-His-Reinigung: Ein Zwei-Schritt-Affinitätsreinigung Protokoll Nachgeben in voller Länge Gereinigte Proteine

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification-freie Methode der Bindungsaffinität Bestimmung durch Microscale Thermophorese

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Ein Protokoll für die Phagen-Display-und Affinity Auswahl mit rekombinantem Protein-Köder

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...