Wir möchten Tal Nawy und Martin Bayer für ihre Beratung auf den Embryo Isolierung danken. MTR, VG, UG und CB entwickelt der Embryo Isolierung Ausrüstung. MTR, VG und CB entwickelt der Embryo Isolation Protokoll. MTR, VG und CB etablierte das Protokoll, die Embryonen isoliert und erzeugten Embryo-cDNA durchgeführt VG die PCR, MTR die GUS-Färbung, JJ die FISH Experimente. MTR, VG, CG und UG schrieb das Manuskript. Diese Arbeit wurde von der Universität Zürich, ein Stipendium der Roche Research Foundation (MTR) und Zuschüsse aus dem Schweizerischen Nationalfonds (UG und CB) finanziert.

Das Verfahren ist in dem Flussdiagramm in 1 gezeigt zusammengefasst. Die Mikrokapillaren und die instrumentale Setup sind in Abbildung 2 und Abbildung 3 dargestellt und typische Schritte Embryo Isolierung sind in Abbildung 4 dargestellt. 1. Material-und Buffer Vorbereitung 1.1 Silicon Beschichtung von Glas Mikrokapillaren <ol><li> Legen Sie die Mikrokapillaren in einem 15 ml Falcon-Röhrchen mit ~ 5 ml Sigmacote (Sigma) und invertieren mehrmals. </li><li> Entfernen Sie die Lösung, platzieren Sie den Falcon Röhrchen mit der Kapillaren in einer Aluminiumfolie und backen Sie sie für 3 Stunden bei 60 ° C Lagerung bei Raumtemperatur. </li></ol> 1.2 Erhalten ~ 50-100 um Durchmesser mikrokapillaren Tipps <ol><li> Ziehen 1 mm Durchmesser Glaskapillaren entweder manuell über einen Bunsenbrenner oder durch Verwendung eines handelsüblichen Abzieher (vertikale Faden Abzieher oder Feinpipettenziehvorrichtung). </li><li> Verwenden Sie eine Diamant-Filzstift oder Klinge, um die Spitze der Kapillare gezogen geschnitten, um die gewünschte Öffnung zu schaffen. Wählen Sie die beste-förmigen Kapillaren unter einem Stereomikroskop. Die Öffnung sollte 50-100 um (Abbildung 2). </li></ol> 1.3 Slide Vorbereitung <ol><li> Siliconize sauber Schlitten durch die alle Vertiefungen mit Sigmacote (~ 1 ml / Folie) für 5 min, zu entfernen. Bake 3 Stunden in Alufolie. Lagerung bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Multi-Well-Glas Objektträger für 10 min in 10% SDS, 2 x 2 min in Nuklease-freiem Wasser (DEPC autoklaviert-ddH 2 O), 2 min in 70% Ethanol, 2 min in 100% Ethanol, Luft- trocknen. Alle Schritte werden in autoklavierte Coplin Gläser getan. Folien können mehrmals verwendet werden, sofern eine gründliche Reinigung zwischen jedem Gebrauch. </li><li> Unmittelbar vor dem Embryo isoliert Ausbreitung ~ 0,5 ul 10 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA) mit einer Pipette über die gesamte Oberfläche jeder Vertiefung und an der Luft trocknen. </li></ol> 1.4 Mikroskop und Kapillar-Setup &lt;ol&gt; <li> Mit einem inversen Mikroskop mit 10x und 20x Vergrößerung Ziel. Optimieren Sie das Licht Kontrast (Embryonen sind sehr transparent). </li><li> Legen Sie eine Mikromanipulators die Glaskapillare neben dem Mikroskop zu halten. Die Glaskapillare mit einem Mikroinjektor (3A) oder einem regelmäßigen P-200 Pipette über einen Gummischlauch verbunden (Fig. 3B, siehe die Diskussion für eine ausführliche Beschreibung des Setup). </li><li> Legen Sie die Kapillare über dem Objektträger bei einer ~ 70 ° Winkel (Abbildung 3) und passen Sie die Position, um die Öffnung in das Blickfeld zu haben. </li><li> Kurz vor dem Embryo Isolation aufnehmen und abgeben ~ 5-10 ul BSA (1 mg / ml) zur Beschichtung der Kapillare. </li></ol> 1.5 Puffer Tabelle 1 listet die Isolierung und Zielpuffer Abhängigkeit von den Downstream-Anwendungen. <ol><li> Bereiten ~ 1 ml Isolation Puffer pro Probe vor Gebrauch frisch und bewahren Sie es auf Eis. </li><li> Bereiten Sie die Ziel-Puffer in einem 0,5 ml Eppendorf schwach bindende Röhrchen auf Eis (molekulare Anwendungen) oder auf einem Objektträger (zytologische Anwendungen) in einer feuchten Kammer. </li></ol> 2. Seed Dissection und Embryo Extraction 2.1 Synchronisation von Seed Entwicklung <ol><li class="jove_content"> Emasculate Blumen und halten sie 2 Tage im Wachstum der Kammer, während die Vermeidung von Kontakt der exponierten pistils mit anderen Blumen, dann bestäuben sie (z. B. 11). </li><li class="jove_content"> Testen Sie die Stufe der Entwicklung unter den Wachstumsbedingungen durch mikroskopische Untersuchung von Saatgut gelöscht. Mit unserem Wachstumsbedingungen (16 Stunden Licht bei 21 ° C, 8 Stunden Dunkelheit bei 18 ° C und 70% Luftfeuchtigkeit) Samen gesammelt 2,5 Tage nach der Bestäubung (DAP) lieferte hauptsächlich 2-4 Embryonen und Samen gesammelt 3,5-4 DAP ergab Kugelsternhaufen Embryonen. </li></ol> 2.2 Seed Dissection und Rupture <ol><li> Entfernen Sie die seeds 10-15 Schoten (~ 2,5 DAP) unter einem Stereomikroskop mit einer Pinzette und Insulin Nadeln. </li><li> Tauchen Sie die Samen in 20 ul Isolation Puffer in einem 2-ml-Eppendorf-Röhrchen auf Eis gelegt. </li><li> Vorsichtig zerdrücken Sie die Samen mit einer Kunststoff-Stößel (mit 10% SDS Pre-gereinigt, gespült mit DEPC-ddH2O gewaschen und mit 70% Ethanol), um die Embryonen freizugeben, bis die Samen-Extrakt ist bewölkt. Die Kraft anzuwenden ist, die von jedem Benutzer bei Versuch bestimmt werden. </li><li> Spülen Sie den Stößel mit 300 ul Puffer, um die Isolation Stößel waschen und Verdünnen Sie die Probe. </li><li> Spin-down der Extrakt bei 5.000 xg für 5 Sekunden. Vorsichtig resuspendieren pelletiert Extrakt durch Pipettieren up-and-down 2-3 mal. </li><li> Der Extrakt wird mit einer 30 um Nylon-Mesh (montiert auf Rohr-Adapter, zB von PartecCelltricks). Spülen Sie die Masche mit einer zusätzlichen Isolierung 200 ul Puffer. </li></ol> 3. Embryo Isolation 3.1 Slide Vorbereitung <ol> &lt;li&gt; Ein sauberes, BSA-beschichteten und silikonisierten Multi-Well-Schieber auf der Bühne des inversen Mikroskop, suspendieren die gefilterte Extrakt durch Pipettieren vorsichtig nach oben und unten und Pipette 2 Tropfen von 40-50 ul-Extrakt in 1 oder 2 Brunnen . Screening nur 1 bis 2 Tropfen auf einmal verhindert die Verdunstung der Probe. </li><li> Platz 50 ml frisches Isolation Puffer (1. wash &amp; Drop) in eine Vertiefung einer anderen Folie wie zuvor vorbereitet. Bewahren Sie diese Folie in einem überdachten, feuchten Kammer, um Verdunstung zu verhindern. </li></ol> 3.2 Bildschirm, reinigen, sammeln <ol><li> Bildschirm Der Tropfen Extrakt für Embryonen in der gewünschten Stufe mit dem 10-facher Vergrößerung Ziel. Bestätigen Sie ggf. die Bühne mit dem 20-facher Vergrößerung. Die Embryonen in der Regel an der Unterseite des Schlittens sinken. </li><li> Manuell entfernen Sie Schmutz rund um den Embryo mit einer Wolfram-Nadel, einer Insulin-Nadel oder ähnlichen Geräten. </li><li> Bewegen Sie die Glaskapillare in der Nähe der Embryo mit dem Mikromanipulators take up des Embryos mit so wenig wie möglich Lösung. </li><li> Sammle mehrere Embryonen (z. B. alle ein Tröpfchen) und lassen sie in der 1. Wäsche Tropfen (molekulare Anwendung) oder in Ziel-Puffer (zytologische Anwendungen). Jede Runde sammeln sollte innerhalb von 5-10 min und Embryonen aufbewahrt werden sollten in einem minimalen Volumen (das Gesamtvolumen aller Sammeln Runden sollte &lt;5 ul sein) gesammelt werden. </li><li> Wiederholen Sie das Screening und Sammlung, bis die gewünschte Menge an Embryonen in der 1. Wäsche Tropfen gesammelt (zentral, wenn möglich, um Erinnerung zu erleichtern). </li><li> Erinnern Sie alle Embryonen auf einmal aus der Wäsche Tropfen (wenn Schutt durchgeführt werden über, entfernen Sie sie mit einer Nadel vor Erinnerung). </li><li> Lassen Sie die Embryonen in einem 2. waschen Tropfen von 50 pl. Wiederholen 3.2.6. </li><li> Lassen Sie die Embryonen in der Ziel-Puffer. Die Übertragung sollte beinhalten nur einen Kontakt, und nicht Eintauchen der Kapillare Spitze. </li><li> Ersetzen Sie die microcapillARY für die nächste Probe. </li></ol>

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L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+demethylation+of+repetitive+elements+during+seed+development+underlies+gene+imprinting.">Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting.</a> Science. 324, 1447-1451 (2009).</li><li>Muller, B., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinin+and+auxin+interaction+in+root+stem-cell+specification+during+early+embryogenesis.">Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis.</a> Nature. 453, 1094-1097 (2008).</li><li>Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+parent-of-origin+allelic+expression+in+Arabidopsis+thaliana+seeds.">Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds.</a> PLoS One. 6, 23687-23 (2011).</li><li>Xiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+gene+expression+and+metabolic+network+dynamics+during+embryo+development+in+Arabidopsis.">Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).</li><li>Nawy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GATA+factor+HANABA+TARANU+is+required+to+position+the+proembryo+boundary+in+the+early+Arabidopsis+embryo.">The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo.</a> Dev Cell. 19, 103-113 (2010).</li><li>Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+triploid+endosperm+genome+of+Arabidopsis+adopts+a+peculiar,+parental-dosage-dependent+chromatin+organization.">The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization.</a> Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).</li><li>Autran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+epigenetic+pathways+control+parental+contributions+to+Arabidopsis+early+embryogenesis.">Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis.</a> Cell. 145, 707-719 (2011).</li><li>Wohrmann, H. 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Vis Exp. 47 (47), e2327 (2011).</li><li>Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+WOX+genes+mediates+apical-basal+axis+formation+in+the+Arabidopsis+embryo.">Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo.</a> Dev Cell. 14, 867-876 (2008).</li><li>Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+thaliana+MEDEA+Polycomb+group+protein+controls+expression+of+PHERES1+by+parental+imprinting.">The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting.</a> Nature. 37, 28-30 (2005).</li><li>Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphase+chromosomes+in+Arabidopsis+are+organized+as+well+defined+chromocenters+from+which+euchromatin+loops+emanate.">Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).</li><li>Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+single+cells.">Transcriptome analysis of single cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2634 (2011).</li><li>Nodine, M. D., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+and+paternal+genomes+contribute+equally+to+the+transcriptome+of+early+plant+embryos.">Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos.</a> Nature. 482 (7383), (2012).</li><li>Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fusions:+beta-glucuronidase+as+a+sensitive+and+versatile+gene+fusion+marker+in+higher+plants.">fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.</a> EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).</li><li>Schmidt, A., W&#246;hrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polycomb+group+protein+MEDEA+and+the+DNA+methyltransferase+MET1+interact+in+Arabidopsis+to+repress+autonomous+endosperm+development.">The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development.</a> Plant J. 73 (5), (1111).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Wir entwickelten einen Embryo Isolation Protokoll, das eine schnelle, effektive ist, und kann leicht an andere Labors übertragen werden. Die beschriebenen Geräte besteht hier aus einem inversen Mikroskop, einem Mikromanipulator, Glas-Mikrokapillaren ein vertikaler Faden Abzieher und Mikroinjektor (Abbildung 3A). Das Setup ist ähnlich dem für Einzeltier Zellisolation für Transkriptom-Analysen 17 beschrieben. Wir haben auch erfolgreich mit einem Basis-Setup, wo...

Der Embryo von Blütenpflanzen wird durch das Endosperm, ein Nährgewebe von einer zweiten Düngung Veranstaltung abgeleitet umgeben. Sowohl Embryo und Endosperm durch mehrere Zellschichten der Samenschale umgeben. Gemeinsam bilden diese Gewebe einen Samen, der in der Frucht zu entwickeln. So werden Gewebe-und Zell-spezifische Analysen von Arabidopsis Embryonen stark beeinträchtigt durch ihre Unzugänglichkeit. Dennoch sind Embryonen bei den späten Kugelsternhaufen oder späteren Phasen relativ gut zugänglich manuelle Dissektion mit feinen Wolfram Nadeln unter dem Stereomikroskop, oder durch leichten Druck auf das Saatgut mit einer Pinzette, um sie zu extrahieren. Solche Techniken wurden erfolgreich für Transkriptom oder epigenome Profiling Analysen wie Microarray-Hybridisierung, Bisulfit-Sequenzierung oder RNA-Sequenzierung (zB 1-3) verwendet. Im Gegensatz dazu bleiben Studien von Embryonen bei der Zygote bis Anfang globulären Stadium technisch anspruchsvoll. Bisher haben nur wenige Studien reported Transkriptomanalysen auf junge Embryonen entweder mit Laser-Mikrodissektion (LCM) von embryonalen Geweben von festen Samen Abschnitten 4 oder manuelle Extraktion einzelner Embryonen aus Samen mit feinen Werkzeugen 5. Allerdings ist LCM Ausrüstung nicht allgemein verfügbar und manuelle Extraktion Embryos in frühen Stadien ist zeitaufwendig und erfordern hervorragende Präparation Fähigkeiten, die nicht leicht übertragbar. Neben genomweite Analysen, in situ Genexpressionsanalysen sind auch schwierig, auf junge, whole-mount Embryonen von Arabidopsis durchzuführen. In gewissem Umfang können junge Embryonen auf Objektträgern durch sanften Druck auf die Samen freigesetzt werden und für Reportergen-Assays oder Protein Erkennung durch Immunfärbung (siehe zum Beispiel 6,7). Diese Technik ist jedoch nicht erlaubt High-Throughput-Embryo Isolierung und behindern so quantitative Analysen. Deshalb entwickelten wir eine effiziente und schnelle Protokollfür frühe Embryo isoliert von Arabidopsis Samen, die einfach zu installieren, leicht übertragbar und eignet sich für eine Vielzahl von nachgelagerten Anwendungen. Das Grundprinzip besteht darin, vorsichtig zerdrücken Samen - seziert von jungen Schoten in ein Eppendorf-Röhrchen mit einem Kunststoff-Stößel in einer geeigneten Isolierung Puffer. Der Extrakt wird in Tröpfchen auf einer Multi-Well-Objektträger aufgebracht und auf das Vorhandensein des freigesetzten Embryonen bei der gewünschten Stufe gescreent unter Verwendung eines invertierten Mikroskops. Die Embryonen werden gesammelt mit einem Glas zu einem Mikroinjektor oder einem Standard-Labor-Pipette angebracht mikrokapillaren. Für molekulare Anwendungen werden Embryonen zweimal durch wiederholte Freisetzung in Tropfen neue Isolierung Puffer vor der Übertragung auf den Zielpuffer in einem minimalen Volumen gewaschen. Für zytologische Anwendungen (Reporter-Assays, Immunfärbung FISH), können Waschschritte verzichtet werden. Das Verfahren bietet mehrere Vorteile: (i) es ergibt 25-40 Embryonen in ~ 45 min für die zytologische Appfentlichungen oder in 3-4 Stunden für die molekulare Anwendungen (einschließlich der Waschschritte), (ii) es ermöglicht Isolierung spezifischer embryonalen Stadien, (iii) es ist leicht auf andere Personen übertragbar und Labors aufgrund seiner einfachen Setup, (iv) es erfordert erschwinglichen Geräten für die Grundeinstellungen, die zugänglich für Upgrades ist, und (v) wurde erfolgreich für verschiedene nachgelagerte Anwendungen wie RNA-Sequenzierung 8, Gen-spezifischen DNA-Methylierung Analyse 9, Reporter-Assays (10 und Raissig et al. verwendet, in prep.) und FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux unveröffentlicht, siehe Abbildung 5).

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>SIGMA</td><td>SL2-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>RNAse OUT</td><td>Invitrogen (life technologies)</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>First- strand buffer</td><td>Invitrogen (life technologies)</td><td>18064-022</td><td>contained in Superscript II package</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen (life technologies)</td><td>18064-022</td><td>contained in Superscript II package</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml </td><td>New England Biolabs Inc.</td><td></td><td>Different suppliers will also work </td></tr><tr><td>Thin wall Capillaries 1.0 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind tube 0.5 ml</td><td>Vaudaux-Eppendorf</td><td>0030108.035</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics&amp;#916; 30 &amp;#956;m</td><td>PARTEC</td><td>04-0042-2316</td><td></td></tr><tr><td>5wells 10 mm diameter slides</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63421-10</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus slide</td><td>Thermo Fisher</td><td>J1800AMNZ</td><td>Menzel-Gl&amp;#228;ser</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amaresco</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Fluka</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>SDS pellets</td><td>Roth</td><td>CN30.3</td><td></td></tr><tr><td>Micro Pestle</td><td>VWR</td><td>431-0094</td><td></td></tr><tr><td>Microfine insulin syringes</td><td>BD</td><td>U-100</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Schaurlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>Forceps N5</td><td>Dumont</td><td>0108-5</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer Pico Chip</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon TMS (Japan),</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Leitz</td><td></td><td>Leica</td></tr><tr><td>Micomanipulator Post mount LH1 probe</td><td>Leica microsystems</td><td>39430101</td><td>Different brand will also do the work</td></tr><tr><td>Vertical filament puller</td><td>Sutter instrument</td><td>P-20 model</td><td>Other model are also suitable </td></tr><tr><td>Cell Tram vario</td><td>Vaudaux-Eppendorf</td><td>5176.000.033</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Invitrogen (life technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

efficient and rapid isolation of early-stage embryos from arabidopsis thaliana seeds

In Blütenpflanzen, entwickelt der Embryo innerhalb einer nährenden Gewebe - das Endosperm - von den mütterlichen Saatgut Integumente (oder Samenschale) umgeben ist. Als Folge wird die Isolierung von pflanzlichen Embryonen in frühen Stadien (1 Zelle Kugelsternhaufen Stufe) technisch anspruchsvolle aufgrund ihrer relativen Unzugänglichkeit. Effiziente manuelle Zerlegung in frühen Stadien ist stark durch die geringe Größe der jungen Arabidopsis Samen und die Haftfähigkeit des Embryos in die umliegenden Gewebe beeinträchtigt. Hier beschreiben wir eine Methode, die die effiziente Isolierung von jungen Arabidopsis Embryonen ermöglicht, wodurch bis zu 40 Embryonen in 1 Stunde bis 4 Stunden, abhängig von der nachgeschalteten Anwendung. Die Embryonen werden in die Isolation Puffer durch leichtes Quetschen 250-750 Samen mit einer Kunststoff-Stößel in ein Eppendorf-Röhrchen veröffentlicht. Ein Glas entweder mit einem Standard-Labor-Pipette angebracht mikrokapillaren (über einen Gummischlauch) oder eine hydraulisch gesteuerte Mikroinjektor wird verwendet, um Embryonen aus Tröpfchen Ort zu sammelnd auf einer Multi-Well-Folie auf einem invertierten Lichtmikroskops. Die technischen Fähigkeiten erforderlich sind einfach und leicht übertragbar, und die grundlegende Einrichtung erfordert keine teure Ausrüstung. Erhaltene Embryonen sind geeignet für eine Vielzahl von Downstream-Anwendungen wie RT-PCR, RNA-Sequenzierung, DNA-Methylierungsanalyse, Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH), Immunfärbung und Reportergen-Assays.

Unsere Embryo Isolation Verfahren (Abbildung 1) ermöglicht die Isolierung von bis zu 40 Embryonen in 4 Stunden, wenn Waschungen durchgeführt werden, z. B. für die molekulare Anwendungen oder in weniger als einer Stunde, wenn Wäschen weggelassen werden, zB für die zytologische Anwendungen. Abbildung 2 zeigt hohe und niedrige Qualität mikrokapillaren Tipps und Abbildung 3 zeigt den Aufbau des Embryos Isolierung Maschine. Abbildung 4</strong...

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Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Wir berichten über eine effiziente und einfache Methode, um Embryonen in frühen Stadien der Entwicklung Isolat aus<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Samen. Bis zu 40 Embryonen in 1 Stunde bis 4 Stunden isoliert werden, abhängig von der Downstream-Anwendungen. Das Verfahren eignet sich für die Transkriptom-, DNA-Methylierung, die Expression des Reportergens, Immunfärbung und Fluoreszenz<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung analysiert.

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

efficient-rapid-isolation-early-stage-embryos-from-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

17.7K Aufrufe.  University of Zürich. Wir berichten über eine effiziente und einfache Methode, um Embryonen in frühen Stadien der Entwicklung Isolat aus Arabidopsis thaliana Samen. Bis zu 40 Embryonen in 1 Stunde bis 4 Stunden isoliert werden, abhängig von der Downstream-Anwendungen. Das Verfahren eignet sich für die Transkriptom-, DNA-Methylierung, die Expression des Reportergens, Immunfärbung und Fluoreszenz In situ Hybridisierung analysiert.

Serie: Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.

We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.

Eine effiziente Methode zur Isolierung von Highly Purified RNA aus Samen für die Verwendung in Quantitative Transkriptomanalyse

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Forschung

Biochemie

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by pre-globular, globular, heart, torpedo and cotyledon stages. This progressive development is under the tight regulation of a complex molecular network. Harvesting sufficient early embryos at a similar stage of development is essential for investigating the cellular and molecular regulation of early embryogenesis. This is not straightforward since early embryogenesis undergoes rapid morphogenesis in a short while e.g. 8 days for Medicago truncatula to reach the early cotyledon stage. Here, we address the issue by two approaches. The first one establishes a linkage between embryo development and pod morphology in helping indicate the stage of the zygotic embryo. This is particularly based on the number of pod spirals and development of the spines. An alternative way to complement the in vivo studies is via culturing leaf explants to produce somatic embryos. The medium includes an unusual hormone combination - an auxin (1-naphthaleneacetic acid), a cytokinin (6-benzylaminopurine), abscisic acid and gibberellic acid. The different stages can be discerned growing out of the callus without dissection.

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

Protokolle für die Beschaffung Zygotic und somatischen Embryonen zur Untersuchung der Regulation der frühen Embryo-Entwicklung in der Modell-Hülsenfrucht<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

Entwicklungsbiologie

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

Eine Methode zur Charakterisierung der Embryogenese in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts from different plant tissues was first reported more than 40 years ago 1 and has since been adapted to study a variety of cellular processes, such as subcellular localization of proteins, isolation of intact organelles and targeted gene-inactivation by double stranded RNA interference (RNAi) 2-5. Most of the protoplast isolation protocols use leaf tissues of mature Arabidopsis (e.g. 35-day-old plants) 2-4. We modified existing protocols by employing 14-day-old Arabidopsis seedlings. In this procedure, one gram of 14-day-old seedlings yielded 5 106-107 protoplasts that remain intact at least 96 hours. The yield of protoplasts from seedlings is comparable with preparations from leaves of mature Arabidopsis, but instead of 35-36 days, isolation of protoplasts is completed in 15 days. This allows decreasing the time and growth chamber space that are required for isolating protoplasts when mature plants are used, and expedites the downstream studies that require intact protoplasts.

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

This video shows a procedure for isolating intact protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis. Given that the isolated protoplasts remain intact for at least 96h and are isolated from seedlings instead of one-month-old mature plants, this procedure expedites assays requiring intact protoplasts.

Isolation von Protoplasten aus Geweben von 14-Tage alte Keimlinge von Arabidopsis thaliana</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Biologie

Isolation of High Purity Tissues from Developing Barley Seeds

Understanding the mechanisms regulating the development of cereal seeds is essential for plant breeding and increasing yield. However, the analysis of cereal seeds is challenging owing to the minute size, the liquid character of some tissues, and the tight inter-tissue connections. Here, we demonstrate a detailed protocol for dissection of the embryo, endosperm, and seed maternal tissues at early, middle, and late stages of barley seed development. The protocol is based on a manual tissue dissection using fine-pointed tools and a binocular microscope, followed by ploidy analysis-based purity control. Seed maternal tissues and embryos are diploid, while the endosperm is triploid tissue. This allows the monitoring of sample purity using flow cytometry. Additional measurements revealed the high quality of RNA isolated from such samples and their usability for high-sensitivity analysis. In conclusion, this protocol describes how to practically dissect pure tissues from developing grains of cultivated barley and potentially also other cereals.

Here we present a protocol for high purity manual isolation and quality control of embryo, endosperm and seed maternal tissues during entire barley seed development.

Understanding the mechanisms regulating the development of cereal seeds is essential for plant breeding and increasing yield. However, the analysis of ...

Genetik

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

Übersetzen von Ribosome Affinity Purification (TRAP) zur Untersuchung der Arabidopsis thaliana Wurzelentwicklung in einer zelltypspezifischen Skala

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of dormant seeds or that of nondormant seeds irradiated by a far red (FR) light pulse. In order to further gain insight into the molecular genetic mechanisms underlying the germination repressive activity exerted by the endosperm, a &#34;seed coat bedding&#34; assay (SCBA) was devised. The SCBA is a dissection procedure physically separating seed coats and embryos from seeds, which allows monitoring the growth of embryos on an underlying layer of seed coats. Remarkably, the SCBA reconstitutes the germination repressive activities of the seed coat in the context of seed dormancy and FR-dependent control of seed germination. Since the SCBA allows the combinatorial use of dormant, nondormant and genetically modified seed coat and embryonic materials, the genetic pathways controlling germination and specifically operating in the endosperm and embryo can be dissected. Here we detail the procedure to assemble a SCBA.

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

We present the procedure to assemble a seed coat bedding assay (SCBA) from Arabidopsis thaliana seeds. The SCBA was shown to be a powerful tool to explore genetically and in vitro how the endosperm controls seed germination in dormant seeds and in response to light cues. The SCBA is in principle applicable under any situation where the endosperm is suspected to influence embryonic growth.

Ein Mantel Bettwäsche Seed-Test zur Genetisch erkunden<em&gt; In-vitro-</em&gt; Wie das Endosperm Kontrollen Keimung der Samen in<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

Standardisierte Methode für Hochdurchsatz-Sterilisation von Arabidopsis Samen

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental step required towards this end. Thus, it is paramount to establish high-throughput Arabidopsis seed surface sterilization methods to handle tens to hundreds of samples (e.g., transgenic lines, ecotypes, or mutants) at once. A seed surface sterilization method based on the efficient elimination of liquid in tubes with a homemade suction device constructed from a common vacuum pump is presented in this study. By dramatically reducing labor-intensive hands-on time with this method handling several hundreds of samples in one day is possible with little effort. Series time-course analyses further indicated a highly flexible time range of surface sterilization by maintaining high germination rates. This method could be easily adapted for surface sterilization of other kinds of small seeds with simple customization of the suction device according to the seed size, and the speed desired to eliminate the liquid.

A high-throughput protocol for the surface sterilization of Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) seeds is provided, optimizing the liquid handling steps with a simple suction device constructed with a vacuum pump. Hundreds of seed samples can be surface-sterilized in one day.

Hochdurchsatz-, robuste und hochzeitflexible Methode zur Oberflächensterilisation von Arabidopsis-Samen

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental ...

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Eine effiziente Methode zur Isolierung von Highly Purified RNA aus Samen für die Verwendung in Quantitative Transkriptomanalyse

Protokolle für die Beschaffung Zygotic und somatischen Embryonen zur Untersuchung der Regulation der frühen Embryo-Entwicklung in der Modell-Hülsenfrucht

Eine Methode zur Charakterisierung der Embryogenese in Arabidopsis

Isolation von Protoplasten aus Geweben von 14-Tage alte Keimlinge von Arabidopsis thaliana

Isolation of High Purity Tissues from Developing Barley Seeds

Übersetzen von Ribosome Affinity Purification (TRAP) zur Untersuchung der Arabidopsis thaliana Wurzelentwicklung in einer zelltypspezifischen Skala

Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Ein Mantel Bettwäsche Seed-Test zur Genetisch erkunden

Standardisierte Methode für Hochdurchsatz-Sterilisation von Arabidopsis Samen

Hochdurchsatz-, robuste und hochzeitflexible Methode zur Oberflächensterilisation von Arabidopsis-Samen