Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Schweizerischen Nationalfonds und vom Kanton Genf unterstützt.

Sobald das SCBA zusammengebaut ist, wird das Wachstum der Embryonen über mehrere Tage überwacht. Deshalb wird vor der Saat Dissektion Verfahren und die Montage des Atemschutzgerätes muss man Samen zu sterilisieren, um zukünftige Verunreinigungen, die angemessene Bewertung der Wirkung der Samenschale Material auf embryonale Wachstum verhindern könnten, zu vermeiden. 1. Seed Sterilisation <ol><li> Gießen 50-60 ul reife und trockene Arabidopsis-Samen in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und bereiten eine 70% ige Ethanollösung. </li><li> 1 ml 70% Ethanol-Lösung zu der Mikrozentrifugenröhrchen mit den Samen und Schütteln bei Raumtemperatur für 10 min bei 1200 rpm in einem Vortexer. </li><li> Zentrifugenmikrozentrifugenröhrchen für 3 Sekunden bei 4000 × g, um Samen am Boden des Röhrchens zu konzentrieren. </li><li> Saugt den 70% igen Ethanollösung unter Verwendung einer Vakuum Absaugspitze vorsichtig Verlassen der Samen in den Boden des Mikrozentrifugenröhrchens. </li><li> 1 ml sterilem destilliertem Wasser zu t<html> Mikrozentrifugenröhrchen er immer noch mit den Samen. </li><li> Schütteln bei Raumtemperatur für 10 min bei 1.200 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Zentrifugenmikrozentrifugenröhrchen für 3 Sekunden bei 4000 × g, um Samen am Boden des Röhrchens zu konzentrieren. Saugen Wasserstandes mit einer Vakuum-Saug-Spitze vorsichtig so dass die Samen an der Unterseite des Rohres. </li><li> 1 ml sterilem Wasser destilliertes Wasser zum Mikrozentrifugenröhrchen noch mit den Samen. Sicherzustellen, dass die Strömung von Wasser homogen suspendiert die Samen im Inneren der Röhre. Das Ziel ist hier, um zu vermeiden weiterem Schütteln, um die Integrität der Samen zu bewahren. </li><li> Lassen Sie die Samen sesshaft durch die Schwerkraft am Boden der Röhre, indem man das Rohr noch für 30 Sekunden. Saugen Wasserstandes mit einer Vakuum-Saug-Spitze vorsichtig so dass die Samen an der Unterseite des Rohres. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte vier mal 1,8 bis 1,9. Insgesamt ist das Sterilisationsverfahren dauert etwa 30 min. </li></ol> 2. Seed-Überzug NHALT &quot;&gt; Alle weiteren Schritte werden in einer Sterilbank durchgeführt, um sterile Bedingungen zu wahren. <ol><li> Vorbereitung einer Petrischale Platte (100 mm Durchmesser, 20 mm Höhe), die 30 ml Keimmedium durch Autoklavieren einer Lösung, die 4,3 g / l Murashige-Skoog-Medium mit 2,5 mM 2 - (N-Morpholino) ethansulfonsäure (MES-KOH , pH 5,7) und 0,8 g / L Agar. Lassen Sie die Lösung abkühlen, in einem 50 ° C Wasserbad vor dem Gießen auf der Petrischale Platte. </li><li> Geben Sie 200 ul sterilem destilliertem Wasser auf das Rohr mit den Samen. Resuspendieren der Samen und übertragen Sie sie auf der Oberfläche der Keimmedium mit einem Standard-Pipette mit einer 1 ml-Spitze. </li><li> Entfernen Sie das umgebende Wasser die Samen auf der Oberfläche der Keimmedium mit Hilfe eines Vakuum-Saug-Spitze. </li><li> Verlassen Sie die Petrischale, die die Samen ohne Deckel in der Sterilbank für 2 Stunden zur weiteren Trocknung. Schließen Sie die Petrischale mit dem Deckel und lassen Sie es unter der Laminar-Standfließen Schrank für etwa 90 min, so daß etwa 4 Stunden seit der Initiierung der Samensterilisationsverfahren (Schritt 1.2) geleitet. </li></ol> 3. Seed Dissection Die folgenden Schritte erfordern die Zusammenarbeit mit einem Stereomikroskop in der Sterilschrank gestellt. Eine Pinzette Dumont Nr. 5 mit abgeschnittenen (dh stumpf) Tipps erleichtert die Handhabung der Samen (Abbildung 1A). <ol><li> Bereiten Sie eine neue Petrischale Platte mit 30 ml Keimmedium. Platz auf der Oberfläche des Mediums zwei nebeneinander liegende rechteckige sterile Whatman 3MM Papiere (1,5 cm x 1,0 cm; 1B, Schritt 1). Whatman 3MM-Papier wird in einem Autoklaven sterilisiert. </li><li> Übertragen Samen auf den Whatman 3MM Papier mit einer sterilen Pinzette (1B, Schritt 2). </li><li> Halten Sie eine individuelle Saatgut vor der Whatman 3MM Papier vorsichtig Drücken der Samen mit den nebeneinander liegenden stumpfen Spitzen der Zange abgeschnitten ( <stRong&gt; 1B, Schritt 3). </li><li> Schneiden der Samenschale (Testa und Endosperm) der Samen unter Verwendung einer Spritzennadel (z. B. U100 Insulinspritze + 1 ml Spritze, 0,33 mm (29 G) x 12,7 mm) (Fig. 1B, Schritt 4). Die Form der Arabidopsis-Samen ist ellipsenförmigen und es wird empfohlen, um die Samenschale entlang der längsten Halbhauptachse so nah wie möglich an den Ort, an dem die Keimblätter sind an der Keimwurzel (dh weg von der radikalen Spitze) beigetreten geschnitten. Dies hilft, die sichere Freilassung des Embryos in den nächsten Schritt der Prozedur der Präparation. </li><li> Drücken Sie die Samen vor dem Whatman 3MM-Papier mit den nebeneinander liegenden stumpfen Spitzen der Zange abgeschnitten (Abbildung 1B, Schritt 5). Dieser Schritt löst den Embryo aus der Samenschale durch die Öffnung im Schritt 3.4 (1B, Schritt 6) erstellt. Es wird empfohlen, den Druck auf das Saatgut, wobei die Spitze der Keimblätter sind in der Nähe der Spitze der Keimwurzel (dh weg fr geltenom die Öffnung). </li></ol> 4. Versammlung der Samenschale Bettwäsche Assay (Pressluftatmer) Siehe Diskussion für die richtige Wahl der Anzahl von Samenschalen und Embryonen. <ol><li> Bereiten Sie eine neue Petrischale Platte mit 30 ml Keimmedium. An der Oberfläche des Mediums eine sterile rechteckiges Stück (3,5 cm x 5,0 cm) von Nylon-Mesh (Abbildung 2, Schritt 1). </li><li> Um Beschädigungen zu vermeiden, kann Embryos und Samenschalen auf die Oberfläche der Metallkanten der Zange durch sanftes Drücken Sie sie mit dem Spritzennadel (Abbildung 2, Schritt 2) bewegt werden. Über Embryonen und Samenschalen auf der Nylon-Mesh (Abb. 2, Schritt 3). </li><li> Bauen Sie ein Kreis-und Einzelschicht der Samenschalen mit den abgestumpft Pinzette und Nadel, sicherzustellen, dass Samen Mäntel sind so viel näher wie möglich (Abb. 2, Schritt 4). Versuchen, so viel wie möglich ausgesetzt werden die Samenschale durch die erzeugte ÖffnungNadel nach oben. Dieser Schritt wurde nicht systematisch untersucht. Es könnte jedoch der Wirkungsgrad des Atemschutzgerätes zu erhöhen, da diffundierbare Substanzen Hemmung des Wachstums des Embryos wird erwartet, direkt diffundieren in Richtung der Embryo statt von diesem weg. </li><li> Zeigen die Embryonen als Kreis einzigen Schicht auf der Mitte der Samenschale Bett im Schritt 4.3 zusammengebaut (Fig. 2, Schritt 5). Sicherzustellen, dass die Embryonen in so viel wie möglich näher. </li><li> Die Pressluftatmer unter Dauerlicht (40 mmol / m 2 s ec) Inkubation bei 20-21 ° C In dem Fall, wo ein FR-Impuls wird verwendet, um die Keimung zu verhaften, montieren die Pressluftatmer unter normalem Licht, gelten die FR-Impuls, wie beschrieben, 9 und verlassen Petrischale in der Dunkelheit. </li></ol>

<ol>
	<li>Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+testa+on+seed+dormancy,+germination,+and+longevity+in+Arabidopsis.">Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).</li><li>Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+the+endosperm+in+flowering+plants.">Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants.</a> Genome Biol. 3, reviews1026 (2002).</li><li>Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -. M., Bradford, K., Nonogaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Seed development, dormancy and germination. , 25-43 (2007).</li><li>Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed+dormancy+and+the+control+of+germination.">Seed dormancy and the control of germination.</a> New Phytol. 171, 501-523 (2006).</li><li>Bethke, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+aleurone+layer+responds+to+nitric+oxide,+gibberellin,+and+abscisic+acid+and+is+sufficient+and+necessary+for+seed+dormancy.">The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy.</a> Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).</li><li>Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+seed+coat+bedding+assay+shows+that+RGL2-dependent+release+of+abscisic+acid+by+the+endosperm+controls+embryo+growth+in+Arabidopsis+dormant+seeds.">A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).</li><li>Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochrome+A+and+Phytochrome+B+Have+Overlapping+but+Distinct+Functions+in+Arabidopsis+Development.">Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development.</a> Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).</li><li>Shinomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+spectra+for+phytochrome+A-+and+B-specific+photoinduction+of+seed+germination+in+Arabidopsis+thaliana.">Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).</li><li>Lee, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+genetically+distinct+control+of+seed+germination+by+phytochromes+A+and+B.">Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B.</a> Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).</li><li>Lee, K. P., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+seed+germination+in+the+shade.">Control of seed germination in the shade.</a> Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).</li><li>Piskurewicz, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gibberellic+acid+signaling+repressor+RGL2+inhibits+Arabidopsis+seed+germination+by+stimulating+abscisic+acid+synthesis+and+ABI5+activity.">The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity.</a> Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).</li><li>Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+light+inhibits+germination+through+DELLA-dependent+stimulation+of+ABA+synthesis+and+ABI3+activity.">Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity.</a> EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).</li><li>Debeaujon, I., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gibberellin+requirement+for+Arabidopsis+seed+germination+is+determined+both+by+testa+characteristics+and+embryonic+abscisic+acid.">Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid.</a> Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).</li><li>Sun, T. P., Kamiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+GA1+locus+encodes+the+cyclase+ent-kaurene+synthetase+A+of+gibberellin+biosynthesis.">The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis.</a> Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).</li><li>Alonso, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+insertional+mutagenesis+of+Arabidopsis+thaliana.">Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana.</a> Science. 301, 653-657 (2003).</li><li>Rook, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+sucrose-induction+mutants+reveal+the+modulation+of+sugar-induced+starch+biosynthetic+gene+expression+by+abscisic+acid+signalling.">Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling.</a> Plant J. 26, 421-433 (2001).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die Samenschale Bettwäsche-Assay (Pressluftatmer) hier beschriebene Vorgehensweise ist im Prinzip auf jeder Umstand, bei dem die Keimung der Samen von Arabidopsis ist gesperrt (oder verzögert) und wo der Mehlkörper wird vermutet, diese Verhaftung zu implementieren. Letzteres kann durch Entfernen der Samenschale (Testa und Endosperm) und unter Berücksichtigung, dass embryonale Wachstum schneller verläuft relativ zu beobachten, wenn Embryonen werden von der Samenschale umgeben nachgewiesen werden. Die Keimun...

In Arabidopsis reifen Samen wird der Samenmantel der Samenschale, einer äußeren Schicht von abgestorbenem Gewebe mütterlichen Ursprungs, und der Mehlkörper, einer einzigen Zellschicht der lebenden Gewebe des Embryos ein unmittelbar umgebenden zusammen. Das Endosperm und der Embryo aus getrennten Befruchtung Ereignisse abgeleitet: das Endosperm ist ein triploid Gewebe mit zwei Müttern und einem väterlichen Genoms während das Embryo ein diploiden Gewebes mit einer Mutter und einem väterlichen Genoms 2. Die Hauptfunktion traditionell dem Endosperm zugeordnet ist, dass ein Nährgewebe. Jedoch ist es immer deutlicher, dass das Endosperm spielt auch eine zentrale Rolle bei der Samenkeimung steuern. Dieser Begriff wurde zunächst offensichtlich im Fall der Ruhe, ein Merkmal von neu produzierten Samen ausgestellt. Ruhenden Samen nicht, trotz der Anwesenheit von günstigen Keimbedingungen keimen. Samen verlieren ihre Keimruhe nach einer Reifezeit und werden nondormant, dh sie keimen, wenn günstige Keimbedingungen ausgesetzt. In vielen Pflanzenarten, darunter der Modellpflanze Arabidopsis wird die Samenschale zwingend erforderlich, um die Keimung von ruhenden Samen zu verhindern, da die Entfernung der Samenschale löst embryonale Wachstum und Begrünung 3,4. In Arabidopsis Bethke et al. Beobachtet, dass die Keimung blieb nach dem Entfernen der Samenschale, während der Mehlkörper rund um den Mehlkörper 5 verdrängte. Diese Beobachtungen stark an, dass die Mehlkörper wird das Gewebe innerhalb der Samenschale Ausüben einer repressiven Aktivitäten auf den Embryo. Allerdings glaube Samenschale Entfernung Experimente nicht unbedingt zur Klärung der Art der Keimung repressive Aktivität durch die Samenschale vorgesehen noch die Identifizierung der Gene, die es zu implementieren. Wir vor kurzem eine Samenschale Bettwäsche-Assay (Pressluftatmer), wo Samenschalen und Embryonen sind physisch getrennt, aber in enger Nähe gehaltenerklärung, so dass die Keimung repressive Aktivität durch den Mehlkörper vorgesehen ist, gehalten 6. Das Atemschutzgerät ermöglicht die Verwendung von kombinatorischen ruhend, nondormant, und genetisch veränderte Samenschale und embryonalen Materialien. Als Ergebnis können die genetischen Bahnen Steuern Keimung und spezifisch im Endosperm und Embryo-Betriebs seziert werden. Das Atemschutzgerät wurde im Rahmen der Vegetationsruhe verwendet, um zu zeigen, dass der Mehlkörper gibt das Phytohormon Abscisinsäure (ABA) in Richtung der Embryo seine Wachstums 6 verdrängen. Darüber hinaus wir die Pressluftatmer nutzen könnten, um die Signalwege, die in Mehlkörpers und embryonalen Geweben zu identifizieren, um Ruhe zu fördern. Die Rolle des Endosperms, um Keimung Kontrolle wurde weiter verstärkt, indem man den Fall der nondormant Samen auf einen Impuls des fernen Rot (FR) belichtet. Frühe auf Samenquellung ein Lichtimpuls FR ist bekannt, dass die Keimung hemmen 7,8. Wenn Samenschalen wurden aus Samen entfernt einen Impuls von Licht FRwar nicht in der Lage, um die Keimung hemmen, was stark darauf hindeutet, dass der Mehlkörper können auch die Keimung von Samen nondormant 9 verdrängen. Bemerkenswerterweise kann das Atemschutzgerät auch zur FR-abhängige Hemmung der Keimung zu rekapitulieren. Dies erlaubt zu zeigen, dass die FR-abhängige Hemmung der Keimung der Samen ist auch ein Prozess, der ABA-Freisetzung aus dem Mehlkörper 9. Darüber hinaus erlaubt die Identifizierung der verschiedenen Atemschutzlichtsignalwege, die in der Mehlkörpers und der Embryo nondormant die Keimung der Samen in Reaktion auf Licht Cues 9,10 steuern. Das Atemschutzgerät scheint daher eine zuverlässige Technik, um die Funktion des Endosperms im Rahmen der Steuerung der Samenkeimung erkunden. Es ist auch ein leistungsfähiges Werkzeug, um in vitro beurteilen, ob Gene im Verdacht, die Keimung Kontrolle arbeiten im Endosperm, Embryo oder beiden Geweben. Hier werden wir ausführlich die verschiedenen Schritte erforderlich, um eine Atemschutz montieren.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>To refer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacusafe Comfort</td>
			<td>INTEGRA Biosciences AG</td>
			<td>158 310</td>
			<td>Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish plate (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH</td>
			<td>664 102</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5524</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (plant agar)</td>
			<td>Duchefa Biochemie B.V.</td>
			<td>P1001</td>
			<td>Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>BD Micro-Fine</td>
			<td>324827</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh (SEFAR NYTEX)</td>
			<td>SEFAR AG</td>
			<td>03-50/31</td>
			<td>Sefar AG, Heiden, Switzerland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>CLF Plant Climatics</td>
			<td>Percival I-30BLLX</td>
			<td>CLF plant Climatics, Wertingen, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclobutrazol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46046</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a seed coat bedding assay to genetically explore in vitro how the endosperm controls seed germination in arabidopsis thaliana

Die Arabidopsis Endosperm besteht aus einer einzigen Zellschicht um den reifen Embryo und spielt eine wesentliche Rolle, um die Keimung von ruhenden Samen oder die der nondormant Samen von einem fernen Rot (FR) Lichtpuls bestrahlt verhindern. Um weitere Einblicke in die molekularen genetischen Mechanismen, die Keimung repressive Tätigkeit des Mehlkörpers ausgeübt zugrunde liegt, wurde ein &quot;Samenschale Bettwäsche&quot;-Test (Pressluftatmer) entwickelt. Das Atemschutzgerät ist ein Dissektion Verfahren physische Trennung Samenschalen und Embryonen aus Samen, die es ermöglicht die Überwachung des Wachstums von Embryonen auf einer darunter liegenden Schicht der Samenschalen. Bemerkenswert ist, rekonstruiert das Atemschutzgerät die Keim repressiven Aktivitäten der Samenschale im Rahmen der Samenruhe und FR-abhängige Steuerung der Keimung der Samen. Da das Atemschutzgerät ermöglicht die Verwendung von kombinatorischen ruhend, nondormant und genetisch veränderte Samenschale und embryonalen Materialien, die genetischen Signalwege steuern Keimung und speziell optriebs im Endosperm und Embryo kann zerlegt werden. Hier werden wir ausführlich die Prozedur, um einen Pressluftatmer montieren.

Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass mutierte Samen nicht GA synthetisieren konnten als Ergebnis der hohen ABA-Akkumulation in Samen keimen 11,12. Allerdings, die Unfähigkeit, keimen erfordert die Samenschale, da seine Entfernung löst embryonale Wachstum 13. Diese stark an, dass das Endosperm der Samen nicht GA synthetisieren ist die Freigabe ABA embryonale Wachstum zu blockieren. Wir erwarten daher Samen Mäntel nicht GA zu synthetisieren, um das Wachstum der Embryonen in einem Pressluftatmer i...

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A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

Wir präsentieren die Prozedur, um eine Samenschale Bettwäsche-Assay (Pressluftatmer) aus Arabidopsis thaliana Samen zusammenzubauen. Der Pressluftatmer wurde gezeigt, dass ein leistungsfähiges Werkzeug, um genetisch und in vitro zu erforschen, wie die Kontrollen Endosperm die Keimung der Samen in ruhenden Samen und in Reaktion auf Licht Cues. Das Atemschutzgerät ist prinzipiell anwendbar unter jeder Situation, in der Mehlkörper wird vermutet, um embryonale Wachstum beeinflussen.

Ein Mantel Bettwäsche Seed-Test zur Genetisch erkunden<em&gt; In-vitro-</em&gt; Wie das Endosperm Kontrollen Keimung der Samen in<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

a-seed-coat-bedding-assay-to-genetically-explore-vitro-how-endosperm

Research

JoVE Journal

Biology

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

13.4K Aufrufe.  Université de Genève.  Wir präsentieren die Prozedur, um eine Samenschale Bettwäsche-Assay (Pressluftatmer) aus Arabidopsis thaliana Samen zusammenzubauen. Der Pressluftatmer wurde gezeigt, dass ein leistungsfähiges Werkzeug, um genetisch und in vitro zu erforschen, wie die Kontrollen Endosperm die Keimung der Samen in ruhenden Samen und in Reaktion auf Licht Cues. Das Atemschutzgerät ist prinzipiell anwendbar unter jeder Situation, in der Mehlkörper wird vermutet, um em...

Serie: A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms.  The cuticle is made up of a tough crosslinked polymer called "cutin" and a protective wax layer that seals the plant surface.  The waxy layer of the cuticle is obvious on many plants, appearing as a shiny film on the ivy leaf or as a dusty outer covering on the surface of a grape or a cabbage leaf thanks to light scattering crystals present in the wax.  Because the cuticle is an essential adaptation of plants to a terrestrial environment, understanding the genes involved in plant cuticle formation has applications in both agriculture and forestry. Today, we'll show the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.


The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms. In this video, we demonstrate the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.

Verwendung von Arabidopsis-Mutanten zu eceriferum Kutikula Biosynthese entdecken

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of ...

Forschung

Biologie

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

Bestimmung der DNA-Methylierung von geprägten Genen in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em&gt; In-vitro-</em&gt; Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

Ein High-Content-Imaging Workflow Grb2 Signaling-Komplexe durch Expression Cloning Studie

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Histochemische Färbung von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sekundärzellwand-Elemente

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In-vitro-Test zur Methylierung Protein-Arginin-Methylierung Studieren

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Chromatinimmunpräzipitation Assay zur Identifizierung von Arabidopsis-Protein-DNA-Wechselwirkungen<em&gt; In-vivo-</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

Analyse von Arabidopsis Thaliana Wuchsverhalten in verschiedenen Licht-Qualitäten

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called thigmomorphogenesis. In past decades, several signaling components have been identified and reported for being involved in the mechanotransduction (e.g., calcium ion binding proteins and jasmonic acid biosynthesis enzymes). However, the relatively slow pace of research in the study of force signaling or thigmomorphogenesis is largely attributed to two reasons: the requirement for laborious human hand-manipulated touch induction of thigmomorphogenesis and the force strength errors associated with people&#8217;s hand-touch. To enhance the efficiency of external force loading on a plant organism, an automatic touch-force loading machine was built. This robotic arm-driven hair brush touches provide a labor-saving and easily repeatable touch-force simulation, unlimited rounds of touch repetition and adjustable touch strength. This hair touch-force loading machine can be used for both large scale screening of touch-force signaling mutants and the phenomics study of plant thigmomorphogenesis. In addition, touch materials such as human hair, can be replaced with other natural materials like animal hair, silk threads and cotton fibers. The automated moving arms on the machine may be equipped with water sprinkling nozzles and air blowers to mimic the natural forces of rain drops and wind, respectively. By using this automatic hair touch-force loading machine in combination with the hand-performed cotton swab touching, we have investigated the touch response of two force signaling mutants, MAP KINASE KINASE 1 (MKK1) and MKK2 plants. The phenomes of the touch-force loaded wild type plants and two mutants were evaluated statistically. They have exhibited significant differences in touch response.

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

A gentle touch-force loading machine is built from human hair brushes, robotic arms and a controller. The hair brushes are driven by robotic arms installed on the machine and move periodically to apply touch-force on plants. The strength of machine-driven hair touches is comparable to that of manually applied touches.

Ein arbeitssparendes und wiederholbares Touch-Force Signaling Mutant Screen Protocol zur Untersuchung der Thigmomorphogenese einer Modellpflanze Arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...

A Simple Dry Sectioning Method for Obtaining Whole-Seed-Sized Resin Section and Its Applications

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are significantly different among different regions of seed. In order to view the morphologies of cells, starch granules and protein bodies clearly, and quantitatively analyze their morphology parameters accurately, the whole-seed-sized section is needed. Though the whole-seed-sized paraffin section can investigate the accumulation of storage materials in seeds, it is very difficult to quantitatively analyze the morphology parameters of cells and storage materials due to the low resolution of the thick section. The thin resin section has high resolution, but the routine resin sectioning method is not suitable to prepare the whole-seed-sized section of mature seeds with a large volume and high starch content. In this study, we present a simple dry sectioning method for preparing the whole-seed-sized resin section. The technique can prepare the cross and longitudinal whole-seed-sized sections of developing, mature, germinated, and cooked seeds embedded in LR White resin, even for large seeds with high starch content. The whole-seed-sized section can be stained with fluorescent brightener 28, iodine, and Coomassie brilliant blue R250 to specifically exhibit the morphology of cells, starch granules, and protein bodies clearly, respectively. The image obtained can also be analyzed quantitatively to show the morphology parameters of cells, starch granules, and protein bodies in different regions of seed.

This technique allows for the fast and simple preparation of whole-seed-sized resin section for the observation and analysis of cells, starch granules, and protein bodies in different regions of the seed.

Ein Mantel Bettwäsche Seed-Test zur Genetisch erkunden

Zusammenfassung

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Verwendung von Arabidopsis-Mutanten zu eceriferum Kutikula Biosynthese entdecken

Bestimmung der DNA-Methylierung von geprägten Genen in Arabidopsis Endosperm

Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide

Ein High-Content-Imaging Workflow Grb2 Signaling-Komplexe durch Expression Cloning Studie

Histochemische Färbung von

In-vitro-Test zur Methylierung Protein-Arginin-Methylierung Studieren

Chromatinimmunpräzipitation Assay zur Identifizierung von Arabidopsis-Protein-DNA-Wechselwirkungen

Analyse von Arabidopsis Thaliana Wuchsverhalten in verschiedenen Licht-Qualitäten

Ein arbeitssparendes und wiederholbares Touch-Force Signaling Mutant Screen Protocol zur Untersuchung der Thigmomorphogenese einer Modellpflanze Arabidopsis thaliana

Eine einfache Trockenschnittmethode zum Erhalt von Vollkornharzund und ihren Anwendungen