This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.

1. Zygotic Embryo-Entwicklung <ol><li> Pflanzenmaterial <ol><li> Wachsen die Medicago truncatula Wildtyp Jemalong oder dessen in der Nähe von isogenen, hoch wieder erzeugbaren Genotyp Jemalong 2HA 13 (als 2HA bekannt) in einem Gewächshaus mit einer 14 h Fotoperiode und 23 ° C / 19 ° C Tag / Nacht-Temperatur. <ol><li> Pierce die Oberfläche der Samenschale (mit einer 23 G-Nadel) vor der Aussaat der Samen, so dass Wasser ist erlaubt, um den Samen geben und genießen in Wasser über Nacht. Fügen Sie genug Wasser, um den Samen vollständig abdecken. </li><li> Sow 3 Samen in jeder 15 cm Durchmesser Topf (insgesamt 10 Töpfe) in Blumenmischung (Grobsand, Perlit, Kokosfaser-Torf (1: 1: 1) plus 5 g Osmocote Exact Standard: Langzeitdünger) und Transfer zum Gewächshaus. Bewahren Sie die gesündeste Sämling nach der Keimung, so gibt es 1 Pflanze pro Topf und umgeben von einem Gitter für die Pflanzenstengel zu klettern. </li></ol></li></ol></li><li> Harvesting Pods <ol><li> Sammeln Sie Früchte aus der wild Typ Jemalong oder 2HA, um die entsprechenden frühen Embryo Stufen zu erhalten, wie zuerst beschrieben 9. HINWEIS: Die verschiedenen pod Stufen sind in Figur 1 gezeigt, und die entsprechenden Embryo Stufen sind in Abbildung 2 dargestellt. </li><li> Überprüfen Sie die verschiedenen pod Stufen bei der Ernte mit Hilfe von Kriterien gemäß Tabelle 1. Messen Sie die Zeit von Stufe 6 vergangen zu getrennten Stufen 6 und 7 (Tabelle 2) zu helfen. </li></ol></li><li> Sezieren Samenanlagen von Hülsen und die Überprüfung der Embryonalstadium <ol><li> Isolieren Samenanlagen von Hülsen mit feinen Pinzette allein oder einem Stereo Binokular und Pinzette wie nötig. Bei Bedarf kann der Embryo Phase kann mit einem Standard-gesetzten Mikroskop (3B) schnell überprüft werden. </li><li> Bereiten geändert Hoyers Lösung, die 7,5 g Gummi arabicum, 100 g Chloralhydrat, 5 ml Glycerin, 60 ml entionisiertem, destilliertem Wasser. Lösen sich durch Rühren für 3-5 Stunden oder über Nacht. </li><li> Weitere verfeinernd Mikroskopie deaktivieren Sie die seziert Samenanlagen in modifizierten Hoyer-Lösung 15,16. Vorsichtig holen die intakten Eizellen und in einem kleinen Volumen von Hoyer-Lösung (genug, um die Samenanlage abdecken) bei Raumtemperatur, bis klar. </li><li> Sehen Sie sich die Proben mit Differentialinterferenzkontrast (DIC) Optik. Erfassen Sie die Bilder iwth einer Digitalkamera 9 (Abbildung 2). </li><li> Besorgen Sie sich die gleichmäßige Samenanlagen aus dem Mittelbereich der pod und sammeln die erforderliche Anzahl. Ein Beispiel ist in 3A gezeigt. Sammeln Sie die Samenanlagen auf Eis und an einem gewünschten Temperatur (-80 ° C für Nukleinsäuren) zur weiteren Analyse. HINWEIS: Einzelheiten zur Analyse der histologischen Schnitten, Transmissionselektronenmikroskopie, und in-situ-Hybridisierung finden Sie Papiere 8,9. </li></ol></li></ol> 2. Entwicklung somatischer Embryonen in vitro- <ol><li> Verwenden Sie ein M. truncatula Sorte tHut ist in der Lage, leicht zu bilden Embryonen in Kultur. Aus diesem Protokoll für Blattexplantate verwenden 2HA Pflanzen 13,17, die 2-4 Monate alt sind. </li><li> Nehmen Sie aus dem aktuellen Flugblätter fast vollständig erweitert dreiblättrigen Blatt einer Verlängerungsschaft. </li><li> Halten Sie die dreiblättrigen Blätter auf feuchten Papiertüchern in einem Kulturtopf um Austrocknung zu vermeiden. Hinweis: Wenn der dreiblättrigen Blätter geerntet werden sie brauchen, um mit minimaler Verzögerung genutzt werden. </li><li> Herstellung des Kulturmediums <ol><li> Verwenden Sie den P4 10: 4: 1: 5 Medium in Agar (0,8% w: v) in 9 cm Petrischalen. HINWEIS: Der P4 10: 4: 1: 5-Medium besteht aus dem P4-Basalmedium 18 plus 10 &amp; mgr; M 1-Naphthalinessigsäure (NAA), 4 &amp; mgr; M 6-Benzylaminopurin (BAP), 1 &amp; mgr; M Abscisinsäure (ABA) und 5 uM gibberellic Säure (GA). Die Verwendung von GA + ABA beschleunigt Embryobildung und verursacht materiellen Steigerungen Embryo Nummer 14. </li><li> Bilden die die P4 Grundmedium in 1 L; bestehend aus Hauptsalze (machen Calcium separat), kleinere Salze und Vitamine (Tabelle 3), Chelat-Eisen (bilden separat), Casaminosäuren (Caseinhydrolysat), 30 g Saccharose, 8 g Agar. </li><li> Shop Stammlösungen der wichtigsten Salze, Calcium, Casaminosäuren, kleinere Salze und Vitamine bei -20 ° C in geeigneten Teilmengen. Speichern Chelateisen bei 4 ° C. </li><li> Bilden den chelatisierten Eisen (200x) durch Auflösen 7,44 g Na 2 EDTA • 2H 2 O in etwa 900 ml entionisiertem destilliertem Wasser unter Rühren, dann wird die Lösung auf 98-99 ° C unter Zugabe von 1,853 g FeSO 4 • 7 H 2 O. Schließlich auf 1 L, wenn die Inhaltsstoffe gelöst sind. Shop in bernsteinfarbenen Flaschen bei 4 ° C. </li><li> Machen den P4 Grundmedium mit den Stammlösungen, wie in Tabelle 4. Die Hormone im Medium sind 10 uM NAA, 4 uM BAP, 1 uM ABA, 5 uM GA (siehe Tabelle 4 und spezifische Materialien Tabelle). Fügen Sie die NAAund BAP vor dem Autoklavieren und fügen ABA und GA nach dem Autoklavieren und Abkühlen auf etwa 55 ° C unter Verwendung von Filtersterilisation mit einem 0,22 um-Filter in eine Spritze befestigt. Und Mischen leicht schwenken. </li><li> Stellen Sie die Medien auf pH 5,8 mit 1 M KOH vor dem Autoklavieren. Autoklaven bei 121 ° C für 20 min. </li><li> Nach dem Autoklavieren fügen Sie den Filter sterilisiert ABA und GA, und gießen Sie etwa 25 ml Medium in sterile 9 cm Petrischalen in einer Steril oder Biohazard Schrank. Kühl und lassen Sie die Agar mit dem Deckel off gesetzt. Dann legen Sie den Deckel und stellen Sie sicher, es gibt keine Kondensat auf dem Deckel. Label nach Bedarf und bei 4 ° C (in einem Karton auf Deckel Kondensat vermeiden). </li></ol></li><li> Sterilisation von Blattgewebe <ol><li> Arbeiten Sie in einem UV-sterilisiert Sterilbank oder Biohazard Schrank. </li><li> Platz verlässt Ball in die Maschen eines zuvor autoklaviert Frühjahr Tee-Ei. </li><li> Tauchen Tee-Ei, das die Blätter in 70% (v: v) Ethanol in einer Stichture Topf für 30 Sekunden. Hinweis: Für alle Schritte in diesem Verfahren verwenden 250 ml Schraubverschluss Polycarbonat Kulturgefäßen, die autoklaviert werden. </li><li> Ablassen und dann übertragen und tauchen in das Blattgewebe in 1: 8 (v: v) verdünnt Bleiche (0,5% Chlor) für 10 min. Vorsichtig schwenken von Zeit zu Zeit. </li><li> Lassen Sie das Bleichmittel und überweisen Sie den Tee-Ei in einer Kultur Topf mit sterilem entionisiertem destilliertem Wasser. Vorsichtig schwenken und überschüssiges Wasser abtropfen lassen. Wiederholen Sie noch einmal mit frischem Kulturtopf sterilem entionisiertem destilliertem Wasser. </li><li> Blätter aus dem Tee-Ei mit einer sterilen Pinzette entfernen, um ein frisches Kulturtopf sterilem entionisiertem destilliertem Wasser. Schrauben Sie die sterile Schutzkappe und spülen Sie durch Umdrehen und wirbeln. Lassen Blätter schwimmen auf dem sterilem Wasser bis zu seiner Explantate vorzubereiten. </li></ol></li><li> Vorbereitung und Beschichtung Explantate <ol><li> Mit sterilen Techniken, Trimm einzelnen sterilisiert Flugblätter von der Kante mit einem Skalpell, und schneiden Sie die verbleibenden Rechtecks ​​in zwei oder three rechteckigen Explantate (8-10 x 3-5 mm) mit der Mitte der Vene in der Mitte jedes Explantat (5A). HINWEIS: Die Größe des Explantats ist ziemlich wichtig im Hinblick auf die ersten Verhornung. Führen Sie den Schneid auf sterilen Deckeln aus Take-away-Essen-Container. </li><li> Platte 6 Explantate auf Agar verfestigten Nährboden in 9 cm Petrischalen (5B). Platte der Explantate abaxial Seite nach unten zu den üblichen Blatt Ausrichtung zu halten. </li><li> Verschließen Sie die Petrischalen mit Parafilm (5C) gestreckt um die Schale. Das Gewebe ist nun bereit für die Inkubation. </li></ol></li><li> Tissue Incubation <ol><li> Die Platten im Dunkeln inkubieren bei 28 ° C in einem Raum mit kontrollierter Temperatur oder Wachstumskammer in der gesamten Kulturperiode. HINWEIS: Die Explantate werden Entdifferenzierung initiieren, Zellteilung, Zellproliferation (Kallusbildung) und Embryogenese (Differenzierung) zu unterziehen. </li><li> Subkultur die Differenzierung Sälen mit Kaminnts nach 3 Wochen auf frisches Medium. An dieser Subkultur überweisen Sie den gesamten Explantat mit einem sterilen Spatel und Pinzette aus rostfreiem Stahl, in einer Steril oder ein Biohazard Schrank. Wie Verhornung auftritt und der Kallus die Größe der größte in 5C überschreitet, übertragen 50% der einzelnen Kallus bei Subkultivierung auf frischem Medium. </li><li> Beachten Sie die ersten Embryonen in ca. 4 Wochen. Zwar gibt es ein gewisses Maß an Synchronität, sammeln verschiedene Embryo Stufen über einem 4-8 Woche Inkubationszeit (6A, B). Sammeln unter einem Binokular und Verfahren nach Versuchsziele. </li><li> Subkultur alle 3 Wochen und Embryonen periodisch zu entfernen, so dass die Explantate werden weiterhin Embryonen für 3 Monate zu produzieren. </li></ol></li></ol>

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	<li>Gepts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legumes+as+a+model+plant+family.+Genomics+for+food+and+feed+report+of+the+cross-legume+advances+through+genomics+conference.">Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference.</a> Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).</li><li>Graham, P. H., Vance, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legumes:+importance+and+constraints+to+greater+use.">Legumes: importance and constraints to greater use.</a> Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).</li><li>Young, N. 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Biol. 67 (6), 567-580 (2008).</li><li>Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-genomic+studies+of+developmental+processes+in+legume+seeds.">Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).</li><li>Wang, X. -. D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+embryo+sac+to+oil+and+protein+bodies:+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula.">From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).</li><li>Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+ABA+and+GA+synergism+increases+somatic+embryogenesis,+facilitates+its+genetic+analysis+and+improves+transformation+in+Medicago+truncatula.">An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula.</a> PloS ONE. 9 (6), e99908 (2014).</li><li>Liu, C. M., Meinke, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+titan+mutants+of+Arabidopsis+are+disrupted+in+mitosis+and+cell+cycle+control+during+seed+development.">The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development.</a> Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).</li><li>Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+SOMATIC+EMBRYOGENESIS+RECEPTOR-LIKE+KINASE+1+(SERK1)+gene+is+associated+with+developmental+change+in+the+life+cycle+of+the+model+legume+Medicago+truncatula.">Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).</li><li>Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., Mathesius, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+embryogenesis+from+leaf+explants.">Somatic embryogenesis from leaf explants.</a> The Medicago truncatula handbook. , (2006).</li><li>Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+MtSERF1+of+the+ERF+subfamily+identified+by+transcriptional+profiling+is+required+for+somatic+embryogenesis+induced+by+auxin+plus+cytokinin+in+Medicago+truncatula.">The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing interests.

Die beschriebenen Protokolle sind relativ einfach und ermöglicht Untersuchung der Leguminosen Embryogenese mit allen modernen Zell- und molekulare Techniken. Wir erkennen, dass es Vorteile und Nachteile sowohl in vivo und in vitro-Ansätze. Beide erlauben mehr Fokus auf der frühen Embryogenese im Vergleich zu Kultur der unreifen Samen 19. Im Fall von in vivo-Studien, was beschrieben wird vorwiegend die Isolierung der Samenanlage von dem POD passend fü...

Hülsenfrüchte sind die drittgrößte Gruppe von höheren Pflanzen mit ca. 20.000 Arten und der (oder Fabaceae) Familie Leguminosae sind einmalig Getreide in Gebiet geerntet und Gesamtproduktion 1. Sojabohne ist die drittgrößte Kulturpflanzen. Hülsenfrüchte liefern etwa ein Drittel des Nahrungsprotein und ein Drittel von Pflanzenöl für den menschlichen Verzehr 2. Hülsenfrüchte mit Fixierfähigkeit N 2 auch dazu beitragen, eine nachhaltige landwirtschaftliche Systeme. Medicago truncatula, wie Sojabohne, speichert Protein und Öl in den Kotyledonen der Samen und ist eine genetische und genomische Leguminosen Modell mit erheblichen genetischen und genomischen Ressourcen 3,4. Während M. truncatula hat Fortschritte im Verständnis der Leguminosen-Rhizobien Symbiose 4 hat es zunehmend eingesetzt, um Hülsenfruchtsamen Biologie 5-7 und Embryogenese 8,9 studieren aktiviert. Arabidopsis Embryogenese wurde intensiv untersucht, aber es 10,11 isa Nichthülsenfrucht und die Details der Embryogenese sind nicht identisch mit Medicago 8,10. Zygotischen Embryogenese in M. truncatula hat interessante Features, mit einem unverwechselbaren vielzelligen Hypophyse, einer endoployploid suspensor und basalen Übertragungszelle 8. Somatische Embryogenese (SE) wird üblicherweise zur Regeneration von Pflanzen 12 eingesetzt. In der Hülsenfrüchte Modell M. truncatula das Saatgut Linie Jemalong 2HA (2HA) wurde aus der Mutter Jemalong entwickelt worden, um hohe somatische Embryo 13 haben. Die Zahl der Embryonen hergestellt wurde kürzlich inhaltlich, indem sowohl die Gibberellinsäure (GA) und Abscisinsäure (ABA) in die seit langem etablierte Medium 14 erhöht. In diesem Fall GA und ABA wirken synergistisch, was ungewöhnlich ist da GA und ABA in der Regel 14 antagonistisch wirken. Die aus Kallus produziert Embryonen entwickeln sich auf der Oberfläche, die das Stadium der Embryogenese, leicht bestimmt werden können Visually und leicht geerntet. Mit in der Nähe von isogenen Linien, die embryo (2HA) und nicht-embryo (Jemalong) sind erleichtert die Untersuchung der somatischen Embryogenese und sowohl in vivo und in vitro-Systemen bietet verschiedene Experimentiermöglichkeiten. Das Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen der Embryoentwicklung ist wesentlich für das Verständnis Saatgut und Pflanzenentwicklung. In Hülsenfrüchten, wie in anderen Dikotyle ist es die Cotyledonen des Embryos, die die Produkte, die für die menschliche Ernährung verwendet werden, zu speichern. Der frühen Embryogenese beinhaltet schnelle Zellteilung und korrekte Embryo Musterung. In ca. 8 Tage nach der Befruchtung, der M. truncatula Embryo erreicht frühen Keimblattstufen. Die morphologischen Charakterisierung ist nicht genau durch Tage nach der Befruchtung in Gewächshausbedingungen angedeutet. Somit ist eine effiziente Standardansatz, um die Phase der sich entwickelnden Embryonen zeigen wertvoll bei der Untersuchung der genetischen regulation der frühen Embryogenese zygotische. In diesem Beitrag stellen wir zwei standardisierte Protokolle, um sich entwickelnden Embryonen für biologische Untersuchungen der Embryogenese in der Hülsenfrüchte Modell M. sammeln truncatula. Die erste ist zu zygotischen Embryos durch Zuordnung der Embryogenese und pod Morphologie während der zweite ist die somatische Embryogenese via Kultivierung Blattexplantate zu leicht zugänglich großen Embryo Zahlen liefern zu sammeln.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >P4 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Major salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Minor salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vitamins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agar</td>
			<td>Bacto Laboratories</td>
			<td>214010</td>
			<td>Bacto agar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plant hormones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1-Naphthaleneacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0640</td>
			<td>Dissolve in small amount of 1 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Abscisic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1049</td>
			<td>Dissolve in small amount of 1 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-Benzylaminopurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3274</td>
			<td>Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gibberellic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7645</td>
			<td>Dissolve in small amount of ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereo dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZFLIII</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiophot</td>
			<td>Or similar, with suitable optics</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Digital camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCam HRc</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilising leaves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>75.9922.519</td>
			<td>Autoclavable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocols for obtaining zygotic and somatic embryos for studying the regulation of early embryo development in the model legume medicago truncatula

Der frühen Embryogenese ausgehend von einer einzigen Zelle Zygote geht durch schnelle Zellteilung und Morphogenese und ist morphologisch durch pre-kugelförmig, kugelförmig, Herz, Torpedo und Keimblattstufen gekennzeichnet. Diese fortschreitende Entwicklung ist unter der strengen Regelung einer komplexen molekularen Netzwerk. Ernte ausreichend frühen Embryonen in einem ähnlichen Entwicklungsstufe ist für die Untersuchung der zellulären und molekularen Regulation der frühen Embryogenese. Das ist nicht einfach, da der frühen Embryogenese erfährt rasche Morphogenese in kurzer Zeit zB 8 Tage Medicago truncatula die frühen Keimblattstadium zu erreichen. Hier wenden wir uns das Problem durch zwei Ansätze. Die erste stellt eine Verbindung zwischen der Embryonalentwicklung und pod Morphologie helfen zeigen die Stufe des zygotischen Embryos. Dies ist insbesondere auf die Anzahl der Spiralen und pod Entwicklung der Stacheln beruht. Ein alternativer Weg zur Ergänzung des in vivo sTUDIEN ist über Kultivierung Blattexplantate zu somatischen Embryonen zu produzieren. Das Medium enthält eine ungewöhnliche Hormonkombination - ein Auxin (1-Naphthalinessigsäure), ein Cytokinin (6-Benzylaminopurin), Abscisinsäure und Gibberellinsäure. Die verschiedenen Phasen erkennbar wachsen aus dem Kallus ohne Dissektion werden.

Für zygotischen Embryogenese Kultivare Strukturen entsprechend den verschiedenen Embryo Stufen in 1A gezeigt - F - F während die verschiedenen Embryo Stufen in 2A gezeigt. Durch die Auswahl Schoten auf der gleichen Stufe, Proben von Samenanlagen, die sehr gleichmäßige erhalten werden (3A) sind. Durch die Verwendung von RT-qPCR Embryo bestimmte Gene können leicht erkannt und Zeitverlauf Studien evaluiert 9. Einige zusätz...

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Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

Protokolle für die Beschaffung Zygotic und somatischen Embryonen zur Untersuchung der Regulation der frühen Embryo-Entwicklung in der Modell-Hülsenfrucht<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

protocols-for-obtaining-zygotic-somatic-embryos-for-studying

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

13.8K Aufrufe.  University of Newcastle, Callaghan, New South Wales, Australia. The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided. 

Serie: Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transkriptom Profilieren<em&gt; In-Vivo</em&gt; Produziert Bovine Präimplantationsembryonen Mit Zwei-Farben-Microarray-Plattform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Visualisierung von zellulären elektrische Aktivität im frühen Zebrafish Embryos und Tumoren

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

Minimal invasiven Embryotransfer und Embryo-Vitrifizierung auf der Optimal-Botn-Bühne im Kaninchenmodell

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

Vorbereitung kleiner RNA-Bibliotheken für die Sequenzierung von frühen Mausembryonen

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and apoptosis, development and ageing, to neuronal synaptic plasticity and regeneration have been associated with Ryanodine receptors (RyRs). Despite the importance of calcium signaling, the exact mechanism of its function in early development is unclear. As an organism with a short gestational period, the embryos of Drosophila melanogaster are prime study subjects for investigating the distribution and localization of CICR associated proteins and their regulators during development. However, because of their lipid-rich embryos and chitin-rich chorion, their utility is limited by the difficulty of mounting embryos on glass surfaces. In this work, we introduce a practical protocol that significantly enhances the attachment of Drosophila embryo onto slides and detail methods for successful histochemistry, immunohistochemistry, and in-situ hybridization. The chrome alum gelatin slide-coating method and embryo pre-embedding method dramatically increases the yield in studying Drosophila embryo protein and RNA expression. To demonstrate this approach, we studied DmFKBP12/Calstabin, a well-known regulator of RyR during early embryonic development of Drosophila melanogaster. We identified DmFKBP12 in as early as the syncytial blastoderm stage and report the dynamic expression pattern of DmFKBP12 during development: initially as an evenly distributed protein in the syncytial blastoderm, then preliminarily localizing to the basement layer of the cortex during cellular blastoderm, before distributing in the primitive neuronal and digestion architecture during the three-gem layer phase in early gastrulation. This distribution may explain the critical role RyR plays in the vital organ systems that originate in from these layers: the suboesophageal and supraesophageal ganglion, ventral nervous system, and musculoskeletal system.

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Here, we describe a protocol for detection and localization of Drosophila embryo protein and RNA from collection to pre-embedding and embedding, immunostaining, and mRNA in situ hybridization.

Ein Protokoll für Immunhistochemie und RNA-in-situ-Verteilung im frühen Drosophila-Embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

Ein einfaches und effektives Transplantationsgerät für Zebrafischembryonen

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of stem cells that does not pose any ethical concerns. However, current methods to isolate Ad-MSCs are not standardized and employ complicated protocols that require special equipment. We isolated Ad-MSCs from the epididymal fat of Sprague-Dawley rats using a simple, reproducible method. The isolated Ad-MSCs usually appear within 3 days post isolation, as adherent cells display fibroblastic morphology. Those cells reach 80% confluency within 1 week of isolation. Afterward, at passage 3-5 (P3-5), a full characterization was carried out for the isolated Ad-MSCs by immunophenotyping for characteristic MSC cluster of differentiation (CD) surface markers such as CD90, CD73, and CD105, as well as inducing differentiation of these cells down the osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. This, in turn, implies the multipotency of the isolated cells. Furthermore, we induced the differentiation of the isolated Ad-MSCs toward the insulin-producing cells (IPCs) lineage via a simple, relatively short protocol by incorporating high glucose Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (HG-DMEM), &#946;-mercaptoethanol, nicotinamide, and exendin-4. IPCs differentiation was genetically assessed, firstly, via measuring the expression levels of specific &#946;-cell markers such as MafA, NKX6.1, Pdx-1, and Ins1, as well as dithizone staining for the generated IPCs. Secondly, the assessment was also carried out functionally by a glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assay. In conclusion, Ad-MSCs can be easily isolated, exhibiting all MSC characterization criteria, and they can indeed provide an abundant, renewable source of IPCs in the lab for diabetes research.

Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (Ad-MSCs) can be a potential source of MSCs that differentiate into insulin-producing cells (IPCs). In this protocol, we provide detailed steps for the isolation and characterization of rat epididymal Ad-MSCs, followed by a simple, short protocol for the generation of IPCs from the same rat Ad-MSCs.

Isolierung von mesenchymalen Stammzellen des Fettgewebes von Ratten zur Differenzierung in insulinproduzierende Zellen

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart disease. The development of the primitive cardiac valves involves the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of endocardial cells from the atrioventricular canal (AVC) and outflow tract (OFT) regions of the heart in response to local inductive myocardial and endocardial signals. Once the cells delaminate and invade the extracellular matrix (cardiac jelly) located between the endocardium and the myocardium, the primitive endocardial cushions (EC) are formed. This process implies that the endocardium has to fill the gaps left by the delaminated cells and has to reorganize itself to converge (narrow) or extend (lengthen) along an axis. Current research has implicated the planar cell polarity (PCP) pathway in regulating the subcellular localization of the factors involved in this process. Classically, the initial phases of cardiac valve development have been studied in cross-sections of embryonic hearts or in ex vivo AVC or OFT explants cultured on collagen gels. These approaches allow the analysis of apico-basal polarity but do not allow the analysis of cell behavior within the plane of the epithelium or of the morphological changes of migrating cells. Here, we show an experimental approach that allows the visualization of the endocardium at valvulogenic regions as a planar field of cells. This experimental approach provides the opportunity to study PCP, planar topology, and intercellular communication within the endocardium of the OFT and AVC during valve development. Deciphering new cellular mechanisms involved in cardiac valve morphogenesis may contribute to understanding congenital heart disease associated with endocardial cushion defects.

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Classically, the endocardium of the mouse embryonic valve primordium has been analyzed using transversal, coronal, or sagittal sections. Our novel approach for en face, two-dimensional imaging of the endocardium at valvulogenic regions allows planar polarity and cell rearrangement analysis of the endocardium during valve development.

En Gesicht Endokardkissenpräparation für die planare Morphogeneseanalyse in Mausembryonen

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...