Wir danken Drs.. Robert Bonneau und Neil Christensen für hilfreiche Kommentare. Diese Arbeit wurde von der Pennsylvania State University College of Medicine Fonds unterstützt.

1. Isolierung von T-Zellen aus Milz und Lymphknoten von Mäusen BDC2.5 <ol><li> Verwenden Sie 6 Wochen alten Pre-diabetischen weiblichen Mäuse BDC2.5 als Spender von diabetogene CD4 + T-Zellen. Mäuse sollten Diabetes-frei durch Uringlucose Messung (siehe unten) bestimmt. </li><li> Euthanize jede Maus mit CO 2-Erstickung und entfernen Sie die Milz, Achsel-und brachial Lymphknoten unter sterilen Bedingungen. Um die Milz zu entfernen, tränken Sie das Fell mit 70% Ethanol, dann geschnitten und einfahren Haut. Die Milz wird sichtbar als dunkelrotes Organ auf der linken Seite der Maus. Machen Sie eine 1-Zoll-Schnitt im Bauchfell mit den kleinen Schere und sanft greifen die Milz in der Mitte mit einem Paar kleine Pinzette. Sorgfältig schneiden das Bindegewebe und die angeschlossenen Fett so weit wie möglich zu entfernen und die Milz. </li><li> Sammeln Sie die Milz und die Lymphknoten in 10 ml Dulbecco&#39;s-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) in einem 15 ml konischen Röhrchen auf Eis. </li><li> Bereiten Sie eine einzelne Zelle Suspension mit the Ende einer sterilen 10 ml Spritze Kolben vorsichtig auf die lymphatischen Organen durch 70 um Zelle Siebe (eine pro Milz Sieb und 4-6 Lymphknoten pro Sieb) in den gleichen 50 ml konischen Röhrchen. </li></ol> Während des Prozesses, spülen jedes Sieb mit 1 ml DMEM mehrmals, um die Gewinnung von Zellen aus dem Sieb zu maximieren. <ol start="5"><li> Übertragen der gesammelten Zellen von dem 50 ml konischen Röhrchen in ein 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren bei 300-400 xg für 7 min bei RT. </li><li> Um rote Blutzellen lysieren, den Überstand verwerfen, wieder die Zellen in 5 ml Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK)-Puffer (pH 7,2) und inkubieren Sie die ACK-Zell-Suspension bei RT für 5 min. </li><li> 10 ml DMEM dem ACK-Zell-Suspension und zentrifugieren wie oben. Waschen Sie das Zellpellet einmal in 10 ml DMEM. </li></ol> 2. Fluorescence-Activated Cell Sorting von diabetogene CD4 + T-Zellen von Mäusen BDC2.5 <ol><li> Re-suspend Zellen in 5 ml FACS sTaining Puffer und zählen die Anzahl der lebensfähigen Zellen (mit einem Phasenkontrast-Mikroskop und einer Zählkammer) durch Trypanblau Ausgrenzung. </li><li> Mit FACS-Puffer, passen die Zellsuspension Volumen bis 5 x 10 7 Zellen / ml. Entfernen ~ 1 x 10 6 Zellen pro Färbung Kontrolle (1 keine Flecken, 3 Einzelzimmer Flecken). Färben der Probe auf nicht-aktivierten transgenen CD4 + T-Zellen mit anti-CD4 (APC), anti-TCR Vβ4 (FITC) und Anti-CD62L (PE) monoklonaler Antikörper (mAb) in einem 15 ml-Röhrchen. Führen Zellfärbung mit den mAb Konzentrationen vom Hersteller für 20-30 min schlug bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Waschen Sie die Probe und einzigen Fleck Kontrollen mit FACS-Puffer bei&gt; 3X der Färbereaktion Volumen. Zentrifugieren bei 300-400 xg, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen in FACS-Puffer (1-2 x 10 7 Zellen / ml für die Sortierung von Probe und 300 ul für einzelne Fleck Kontrollen) und auf Eis lagern bis zum nächsten Schritt. </li><li> Übergeben Sie die Zelle Probe durch eine 35 um ZelleSieb Haubenrohr zu entfernen Zellklumpen. Ordnen Sie die Proben für CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + Zellen auf einem Cell Sorter mit einem geschulten Bediener. Sammeln Sie die sortierten Zellen in 3 ml DMEM in einer 15 ml Tube. Erlauben 2,5-3 Std., einschließlich Setup, bis 1,5 x 10 8 Zellen (die ungefähre Anzahl von Zellen aus 3 Donormäusen erhalten) an einer Art von 2 x 10 4 insgesamt events / sec sortieren. Erwarten ~ 2,5 x 10 6 nicht aktivierten transgenen CD4 + T-Zellen pro Maus nach cell sorting. </li><li> Notieren Sie sich die absolute Zahl der sortierten Zellen am Ende der Sortierung und zentrifugieren für 7 min bei 300-400 g x. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen (2 x 10 6 Zellen / ml) in steriler Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Mg 2 + / Ca 2 +-frei) für die T-Zell-Transfer Adoptiveltern. </li></ol> 3. Adoptiven Transfer von CD4 + T diabetogene Zellen aus BDC2.5 Mäuse <ol><li> Mit einer 1-ml-Spritze und ein 18-1 ½-Gauge-Nadel, sanft resuspendieren die FACS-gereinigten CD4 +T-Zellen und laden Sie die 1 ml Spritze. In Vorbereitung zur Injektion, ersetzen Sie den 18-1 ½-Gauge-Nadel mit einer 27-Gauge-Nadel ½. </li><li> Expose 6-8 Wochen alte weibliche NOD.SCID Empfängermäuse einer Wärmelampe, bis sie Pflege Verhalten zeigen. </li><li> Zurückhalten Empfängermäuse in einem Verzögerer und wischen dem Schwanz mit 70% (v / v) Ethanol, um die Injektionsstelle zu desinfizieren. </li><li> Spritzen 1-2 x 10 6 FACS sortierten Zellen / Maus (in bis zu 500 ul PBS) entweder in der seitlichen Schwanzvenen. </li></ol> Nicht mit Gewalt den Kolben. Wenn die Nadel richtig in der Vene liegt, wird die Einspritzung fast ohne Widerstand zu nehmen. 4. Überwachung Empfänger Mäuse für Hyperglykämie und T1D <ol><li> Beginnend fünf Tage nach der T-Zell-Übertragung werden NOD.SCID Empfängermäuse täglich erhöhten Urin Glucose unter Verwendung von Teststreifen (Bayer Diastix) gemäß den Anweisungen des Herstellers überwacht. Mäuse, die mit zwei aufeinanderfolgenden urine Blutzuckerwerte&gt; 250 mg / dl gelten als Diabetiker. </li></ol>

<ol>
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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autoimmune+diabetes+locus+Idd9+regulates+development+of+type+1+diabetes+by+affecting+the+homing+of+islet-specific+T+cells.">The autoimmune diabetes locus Idd9 regulates development of type 1 diabetes by affecting the homing of islet-specific T cells.</a> J. Immunol. 176, 5455-5462 (2006).</li><li>Verdaguer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+autoimmune+diabetes+in+monoclonal+T+cell+nonobese+diabetic+mice.">Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice.</a> J. Exp. Med. 186, 1663-1676 (1997).</li><li>Thomas, D. C., Mellanby, R. J., Phillips, J. M., Cooke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+early+age-related+increase+in+the+frequency+of+CD4++Foxp3++cells+in+BDC2.5NOD+mice.">An early age-related increase in the frequency of CD4+ Foxp3+ cells in BDC2.5NOD mice.</a> Immunology. 121, 565-576 (2007).</li><li>Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nonobese+diabetic+scid+mouse:+model+for+spontaneous+thymomagenesis+associated+with+immunodeficiency.">The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).</li></ol>

Alle Mäuse wurden an der Penn State College of Medicine specific pathogen-freie (SPF)-Anlage in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Penn State Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss untergebracht. Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

T1D in Empfängermäuse bei unterschiedlichen Wirkungsgrade durch adoptiven Transfer von ganzen Milzzellen oder T-Zell-Untergruppen von diabetischen NOD-Mäusen oder Mäusen transgenen TCR von diabetogene T-Zell-Klone abgeleitet induziert werden. Wir berichten hier über ein reproduzierbares Verfahren zur Induktion in Empfängermäuse innerhalb von zwei Wochen T1D bei 100% Inzidenz durch Übertragung FACS-gereinigten CD62L + BDC2.5 transgenen CD4 + T-Zellen in Mäusen NOD.SCID. Besondere Vor...

Die NOD-Maus entwickelt Autoimmundiabetes spontan und wurde vielfach als Tiermodell für die menschliche T1D 1,2 verwendet. Pathogenese der T1D in NOD-Mäusen durch Infiltration, beginnend bei 3-4 Wochen alt, der pankreatischen Langerhans-Inseln von dendritischen Zellen und Makrophagen durch T und B-Zellen folgte. Diese Phase der zerstörungsfreien peri-Insulitis führt zu einem langsamen, fortschreitenden Zerstörung der Insulin-produzierenden β-Zellen der Bauchspeicheldrüse, was zu manifester Diabetes von 4-6 Monaten 3 Jahren. Übertragen von Splenozyten 4,5, CD4 + oder CD8 + 6,7 8,9 T-Zellen von diabetischen NOD-Mäusen haben gezeigt, dass Diabetes bei immungeschwächten Mäusen NOD vermitteln, was anzeigt, dass Insel-reaktiven T-Zellen eine zentrale Rolle in T1D Pathogenese spielen. Abhängig von den experimentellen Bedingungen, entwickelt Diabetes in Empfängermäuse langsam, über mehrere Wochen in diesen Studien. Ebenso verschiedenen T-Zell-Klone, von Zeit-und kostenintensive abgeleitetKultivieren von diabetogenen T-Zellen wurde berichtet, Diabetes mehrere Wochen nach der Überführung in Empfängermäuse 7,10 vermitteln. Mit der Verfügbarkeit von transgenen Mäusen, die TCRs von CD4-oder CD8-restringierte T-Zell-Klone diabetogen, mehreren Laboratorien abgeleitet wurden später gezeigt, dass Milz-T-Zellen aus diesen Mäusen in der Lage, Diabetes Empfänger 11-13 übertragen wurden. Insbesondere sind BDC2.5 NOD-Mäuse transgen für das BDC2.5 TCR, die spezifisch für Chromogranin A, ein Protein in pankreatischen beta-Zellen 14-16 ist. Übertragen von in vitro-aktivierten oder un-aktivierte ganz oder fraktionierte Milzzellen offen Diabetiker oder prediabetic BDC2.5 Mäuse übertragen Diabetes bei Neugeborenen oder immungeschwächten NOD-Mäuse in unterschiedlichen Wirkungsgrade 11,17-19. Wir beschreiben eine einfache Methode, die gereinigt transgenen CD4 + T-Zellen nutzt von Pre-diabetischen Mäusen BDC2.5 in Empfängermäuse bei hohem Wirkungsgrad und consiste T1D induzierenncy. Eine große Anzahl von naiven Insel Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen aus diesen Mäusen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) für CD4 + CD62L + T Zellen, die das transgene TCR Vβ4 Kette isoliert. Gereinigtes transgenen T-Zellen werden dann ohne Aktivierung in NOD.SCID Mäusen, die Funktions-T-und B-Zellen fehlt und Insulitis-und Diabetes-freie 20 übertragen. Die Empfänger-Mäuse werden für erhöhte Konzentrationen von Urin Glucose T1D anzeigt, die sich schnell entwickelt sich innerhalb von zwei Wochen nach der T-Zell-Transfer überwacht. Im Gegensatz zu anderen Methoden, die übertragen diabetogene T-Zellen mit heterogenen Besonderheiten, unser Protokoll FACS-sortierten CD4 + T-Zellen, die fast ausschließlich Ausdruck der diabetogene BDC2.5 TCR verwendet. Aufgrund ihrer Homogenität, sind nur eine kleine Anzahl von T-Zellen übertragen (~ 1x10 6 Zellen / Maus) für die schnelle Entwicklung T1D innerhalb von 2 Wochen bei 100% Inzidenz erforderlich. Ein weiterer Vorteil ist, dass unser Protokoll irradiation des Empfängers Mäusen ist nicht notwendig, da es für einige andere Methoden. Ein möglicher Nachteil dieser Methode ist, dass es nicht zulassen, die Untersuchung der Beteiligung von CD4 und CD8 T-Zell-Untergruppen oder insbesondere CD8-T-Zellen bei Diabetes. Die beschriebene Protokoll wird nützlich für die Untersuchung schneller T1D Entwicklung von naiven monospezifischen CD4 + T-Zellen, sowie therapeutische Strategien vermittelt, um in Homing von Inselzellen-Antigen-spezifische Th-Zellen in das Zielorgan eingreifen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(Tcr&alpha;BDC 2.5, Tcr&beta;BDC 2.5)</td>
			<td>JAX</td>
			<td>004460</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J)</td>
			<td>JAX</td>
			<td>001303</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td>
			<td>Themo Scientific</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bayer Diastix</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM2803</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical tweezers</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile small pair scissors</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile large pair scissors</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &mu;m cell strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 &mu;m cell strainer cap tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSFlowTM sheath fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS staining buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD4 (APC) mAb</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1005616</td>
			<td>clone RM4-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TCR V&beta;4 (FITC) mAb</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553365</td>
			<td>clone KT4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD62L (PE) mAb</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553151</td>
			<td>clone MEL-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>e.g. BD FACSAria III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat lamp</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309602</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18-1&frac12; gauge needles (sterile)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27&frac12; gauge needles (sterile)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305109</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

accelerated type 1 diabetes induction in mice by adoptive transfer of diabetogenic cd4+ t cells

Die nonobese diabetischen (NOD) Maus spontan entwickelt Autoimmun-Diabetes nach 12 Wochen alt und ist der am intensivsten untersuchten Tiermodell der menschlichen Typ-1-Diabetes (T1D). Zelltransfer Studien in bestrahlte Mäuse Empfänger haben festgestellt, dass T-Zellen sind entscheidende in T1D Pathogenese in diesem Modell. Wir beschreiben hier ein einfaches Verfahren, um schnell durch adoptiven Transfer von gereinigtem T1D induzieren primäre CD4 + T-Zellen von Pre-diabetischen NOD-Mäusen transgen für die Insel-spezifischen T-Zell-Rezeptor (TCR) BDC2.5 in NOD.SCID Empfängermäuse. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik sind, dass Isolation und adoptiven Transfer von T-Zellen diabetogene abgeschlossen werden kann innerhalb des gleichen Tages, Bestrahlung der Empfänger nicht erforderlich ist, und eine hohe Inzidenz von T1D ist innerhalb von 2 Wochen nach entlockte T-Zell-Transfer werden. So können Untersuchungen der Pathogenese und therapeutische Interventionen in T1D mit einer schnelleren Rate als bei Methoden, die auf heterogenen T-Zell-Populationen oder Klonen verlassen gehenabgeleitet von diabetischen NOD-Mäusen.

Unsere Ergebnisse zeigen, die Isolierung von transgenen BDC2.5 exprimieren CD62L, die kritisch für die T-Zellen, nach Hause zu sekundären lymphatischen Organe wie Lymphknoten an ist. Unsere Ergebnisse zeigen weiterhin die starke Fähigkeit dieses monospezifische T-Zell-Population, um schnell und effizient zu übertragen NOD.SCID Empfängermäuse T1D. Isolierung von diabetogenen CD4 + T-Zellen von Mäusen BDC2.5 ist in Abbildung 2 dargestellt. Ungefähr 5 x 10 7 ...

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Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Wir bieten eine reproduzierbare Methode, um Typ-1-Diabetes (T1D) bei Mäusen innerhalb von zwei Wochen zu induzieren durch den adoptiven Transfer von Insel-Antigen-spezifischen, primären CD4 + T-Zellen.

Accelerated Typ 1 Diabetes Induktion in Mäusen durch adoptiven Transfer von CD4 + T diabetogene Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.6K Aufrufe.  Pennsylvania State University College of Medicine. Wir bieten eine reproduzierbare Methode, um Typ-1-Diabetes (T1D) bei Mäusen innerhalb von zwei Wochen zu induzieren durch den adoptiven Transfer von Insel-Antigen-spezifischen, primären CD4 + T-Zellen.