Entzündliche Darmerkrankungen oder IBD stellen eine erhebliche gesundheitliche und finanzielle Belastung für den Einzelnen und die Gesellschaft dar. Dieses Colitis-Modell ist hilfreich, um die Mechanismen von IBD zu untersuchen und die Behandlungen für IBD zu bewerten. Dieses immundominante Cbir-Flagellin-T-Zell-spezifische adoptive Transferkolitis-Modell liefert Einblicke in die Art und Weise, wie das Antigen von Darmbakterien T-Zell-Reaktionen induziert, um Kolitis zu induzieren.
Nachdem Sie die Maus eingeschläfert haben, machen Sie einen etwa einen Zentimeter langen linken Bauchschnitt und ziehen Sie die Haut vom Bauchmuskelgewebe weg. Machen Sie dann einen etwa drei Zentimeter langen Schnitt im Bauchmuskelgewebe. Als nächstes entfernen Sie die Milz mit steriler Schere und Pinzette.
Legen Sie die Milz in eine Kulturschale mit fünf Millilitern vorgekühltem Waschpuffer. Schleifen Sie die Milz mit der rauen Oberfläche von zwei sterilen Glasobjektträgern. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, indem Sie sie durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb führen.
Glasobjektträger und Kulturschale mit fünf Millilitern vorgekühltem Waschpuffer abspülen und in das Röhrchen geben. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension, verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie die Zellen mit fünf Millilitern vorgewärmtem Tris-Ammoniumchlorid-Lysepuffer pro Milz. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
10 Milliliter vorgekühlten Waschpuffer in das Röhrchen geben. Dann zentrifugieren Sie die Zellsuspension, verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie die Zellen mit 10 Millilitern vorgekühltem Isolationspuffer. Um die Zellen zu zählen, mischen Sie jeweils 10 Mikroliter Zellsuspension und Trypanblau gründlich und laden Sie 10 Mikroliter auf einen Objektträger.
Führen Sie dann den Schieber in den automatisierten Zellzähler ein, um die lebensfähige Zellnummer zu erhalten. Zentrifugieren Sie die verbleibende Zellsuspension und verwerfen Sie alle Überstände. Wirbeln Sie die Anti-Maus-CD4-Magnetpartikel, fügen Sie direkt 50 Mikroliter der Partikel pro 10 Millionen Zellen hinzu und mischen Sie sie gründlich mit Zellpellets.
Die Mischung 30 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Die Zellpartikelsuspension in ein steriles Sammelröhrchen überführen. 3,5 Milliliter vorgekühlten Isolationspuffer in das Rohr geben.
Legen Sie das Röhrchen acht Minuten bei Raumtemperatur auf den Zelltrennmagneten. Dann den Überstand vorsichtig mit einer Drei-Milliliter-Transferpipette absaugen. Entfernen Sie das Rohr vom Zelltrennmagneten.
Anschließend werden die Zellen mit 3,5 Millilitern vorgekühltem Isolationspuffer wieder eingependelt und das Rohr für vier Minuten bei Raumtemperatur auf den Magneten gelegt. Den Überstand vorsichtig mit einer Drei-Milliliter-Pipette absaugen. Schließlich resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter vorgekühlten FACS-Puffer.
Um die Zellen in die Empfängermäuse zu übertragen, resuspendieren Sie die Cbir1 TCR transgen-naiven CD4-positiven T-Zellen auf 5 Millionen Zellen pro Milliliter in 1x PBS. Erwärmen Sie die Mäuse unter einer Wärmelampe und halten Sie die Mäuse mit einem Mausfessel zurück. Intravenös 200 Mikroliter der Zellsuspension in die Schwanzvene der Mäuse injizieren.
Nachdem Sie die Maus eingeschläfert haben, machen Sie einen etwa einen Zentimeter großen ventralen Mittellinien-Hautschnitt. Ziehen Sie die Haut vom Bauchmuskelgewebe weg. Machen Sie dann einen drei Zentimeter langen Schnitt im Bauchmuskelgewebe.
Als nächstes identifizieren Sie das Coecum und entfernen Sie den gesamten Dickdarm mit steriler Schere und Pinzette. Befeuchten Sie den Dickdarm mit vorgekühltem PBS in einer Kulturschale. Schneiden Sie den Dickdarm der Länge nach ein und spülen Sie ihn mit vorgekühltem PBS aus.
Schneiden Sie 1/3 des Dickdarms längs ab. Legen Sie den Dickdarmstreifen in ein Papiertuch mit der Lumenalseite nach oben. Führen Sie Swiss-Rolling mit einem Zahnstocher durch.
Legen Sie den Doppelpunkt Swiss in eine Kassette und legen Sie die Kassette für 24 Stunden in 10% gepuffertes Formalin. Dehydrieren und paraffinen Sie den Dickdarm mit einem automatisierten Prozessor ein. Schneiden Sie dann fünf Mikrometer schwere Gewebeschnitte auf einem Mikrotom.
Montieren Sie das Gewebe auf Objektträgern und führen Sie eine Hämatoxylin- und Eosinfärbung durch. Die Rag-Knockout-Mäuse begannen etwa drei Wochen nach dem Zelltransfer an Gewicht zu verlieren, und ihr Gewicht erreichte sechs Wochen nach dem Zelltransfer etwa 80 bis 85% ihres ursprünglichen Gewichts. Empfängermäuse zeigten sechs Wochen nach dem Zelltransfer eine kurze Dickdarmlänge.
Die Empfängermäuse zeigten vier Wochen nach dem Zelltransfer mehr Zellinfiltration in der Intestinallamina propria. Sie zeigten Kelchzellverlust und intestinale Epithelzellhyperplasie fünf Wochen nach dem Zelltransfer sowie Schleimhauterosion und entzündliche Zellinfiltration in der Submukosa des Dickdarms sechs Wochen nach dem Zelltransfer. Die histopathologischen Scores stiegen erheblich von vier auf sechs Wochen.
Gleichzeitig gab es keine Entzündung bei Rag-Knockout-Mäusen, die PBS allein erhielten. Mit diesem Verfahren konnten die Kolonzytokinspiegel mittels ELISA und qPCR bestimmt werden.
