Este trabajo es apoyado por el Consejo Australiano de Investigación (ARC DP0988227) y la Iniciativa de Investigación de Ciencias Biomédicas subvención de la disciplina de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Sydney. El amplificador de patch clamp equipo EPC 8 fue financiado por el Fondo de inicio de la disciplina de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Sydney. El Instrutech LIH 8 8 Sistema de Adquisición de Datos equipos se compraron con los fondos de la Fundación Rebecca L. Cooper y el Fondo de inicio de la disciplina de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Sydney. Nos gustaría agradecer a los revisores anónimos por sus sugerencias y comentarios perspicaces.

1. Configuración general y preparación de tejidos <ol><li> Mantenga el puntero del ratón en la oscuridad durante 30 min (tratar de reducir su nivel de estrés). Mientras espera, preparar 1 l de solución extracelular. En primer lugar se disuelven 1,9 g de bicarbonato de sodio en medio de un litro de agua Milli-Q. Su pH se mantiene en el 7,4 por burbujeo con un 95% de O2 y 5% de CO 2. Cinco minutos más tarde, se disuelven 8,8 g de Ames Medio en 100 ml de agua Milli-Q, se suman a la solución de bicarbonato de sodio, superior a 1 L con agua Milli-Q y mezclar bien. Mantener esta solución carboxygenated para el resto del experimento. </li><li> Tomar 250 ml del carboxygenated Ames medio y establecer el sistema de reperfusión líquido en el electrofisiológico configuración. Guardar la solución carboxygenated. </li><li> Uniformemente frotis de una capa fina de grasa de vacío en la parte inferior de la cámara de perfusión. Selle con una hoja de cubierta y asegúrese de que es hermético. Tomar una pequeña cantidad de grasa (~ 2 mm de diámetro) y colóquelo en la parte superior eextremos inferiores de la cámara. Estas bolas se mantenga la red (marco de platino colgados con hilo dental) en su lugar y evitar que presionar demasiado sobre la retina. Fije la cámara en la plataforma y alinee los dos orificios. </li><li> El animal es primero anestesiaron con isoflurano durante 2 min, y luego sacrificadas por dislocación cervical. Quite rápidamente los ojos con un par de tijeras pequeñas (hojas curvas), lavar con abundante líquido extracelular carboxygenated en un pequeño vaso de precipitados, y luego se coloca en una placa de Petri llena de líquido extracelular carboxygenated. </li><li> Bajo el microscopio de disección, crea un orificio de inserción en la córnea (~ 2 mm del borde) usando una aguja de calibre 19. Repita para el otro ojo. Este importante paso debe ser rápido para permitir la oxigenación de ambas retinas. Retire una córnea con un pequeño par de tijeras de iris mediante la reducción paralela a su borde. A continuación, quitar el iris y la lente con un par de pinzas finas. Repita para el otro ojo. Transferir un ocular en un vaso que contienecarboxygenated solución extracelular. </li><li> Con una hoja de bisturí, cortar una copa para el ojo en un medio, para ser capaz de aplanar la de todo el montaje y para obtener dos todo-montas por la retina. Separe cuidadosamente la retina del epitelio pigmentario utilizando una sonda de disección roma o tirando de él fuera. Una vez separada, la retina es bastante transparente. Tenga en cuenta la superficie convexa es el lado fotorreceptores. La superficie cóncava es el lado de las células ganglionares y que puede pegarse a sí misma debido a la presencia del humor vítreo pegajosa. </li><li> Con un par de pinzas finas, mantenga el borde de la retina separada cerca del tejido a la ora serrata y apoderarse de la ora serrata con otro par de pinzas finas, tire de él hacia el centro de la retina. Este es un proceso delicado y puede tomar varios intentos. Si tiene éxito, ora serrata, cuerpo ciliar y el humor vítreo se eliminan mediante este proceso, y la curvatura de la retina se reduce (es decir, plana). </li><li> Recorte los bordes, y luego transferirlo al porcámara de fusión con las células ganglionares hacia arriba. Mantenga el tejido en su lugar mediante la colocación de la rejilla sobre las bolas de grasa. Coloque el resto del tejido con la otra copa para el ojo para su uso posterior. Procedimientos similares para la disección de la retina se describen en Middleton y Protti 16 y Pottek et al. 17. </li><li> Monte la cámara de grabación bajo un microscopio vertical. Inmediatamente configurar la perfusión continua de la retina con una solución extracelular carboxygenated (35,5 ° C) a una tasa de 3 - 5 ml / min. Asegúrese de que la toma de tierra está en su lugar. </li><li> Se adjunta a la microscopio es una cámara digital que permite la visualización del tejido. Todo el conjunto se sienta encima de una mesa de aire (amortiguación) y dentro de una jaula de Faraday (bloques de campos eléctricos estáticos y no estáticos externos). </li><li> Encienda la fuente de luz (infrarroja,&gt; 850 nm) y con un objetivo de 40X, ponga su foco en los cuerpos celulares de las células ganglionares. Encuentra el área central de la de todo el montaje para recording. </li><li> Descongelar un vial congelado de solución basada en K + intracelular (300 l, pH = 7,4) que contiene (en mM) K-gluconato: 140, ácido HEPES: 10, MgCl2: 4,6, ATP-Na +: 4, GTP-Na + : 0,4 y EGTA: 10. Todos los reactivos adquiridos de Sigma-Aldrich. </li></ol> 2. Cuerpos celulares de parches de células ganglionares retinianas <ol><li> Primera fuego pulir los extremos del tubo capilar de vidrio de borosilicato, luego tire con un extractor de microelectrodos de vidrio con dos etapas de calentamiento (resistencia: 5-8 mW). </li><li> Añadir 3 l de Amarillo Lucifer (concentración final 0,2%) a la solución intracelular, mezclar bien, y centrifugar. A continuación, transferir el 85% superior de la solución en una jeringa de 1 ml, conectarlo a una unidad de m ilter 0,22 f, y luego a un G aguja hipodérmica reutilizable 30. Refrigere. </li><li> Fijar la pipeta de vidrio, del tamaño de la punta similar a los utilizados para las grabaciones, en su soporte y moverlo en el microscopio utilizando una micromanipulator. En virtud de un objetivo de 40X, baje lentamente la pipeta hasta que se hace un pequeño hoyuelo en la superficie de la membrana limitante interna. Avanzar con cuidado la pipeta hacia adelante hasta que las capturas de una pequeña cantidad de tejido, y luego moverlo hacia arriba y / o hacia los lados para rasgar un pequeño agujero para exponer los cuerpos celulares de las células ganglionares. Cuanto más pequeño sea el orificio, mayor se mantiene el grado de integridad de la red de la retina. Si se desea, sulforodamina 101 (SR101; 0,5-1 mM) se puede añadir al medio extracelular para etiquetar las neuronas dañadas mediante el uso de microscopía de fluorescencia 15. </li><li> Llenar una pipeta limpia con 8-10 l de solución intracelular. Inserte en el soporte fijado a la etapa de la cabeza del amplificador y asegúrese de que el electrodo de cloruro de plata clorada está sumergido. Desechar si la suciedad y / o burbujas de aire es / están presentes. </li><li> Encienda todos los equipos. Hemos utilizado un amplificador de 8 de patch clamp EPC controlado por PatchMaster para lograr grabaciones de células enteras de fijación de voltaje configuración. Tenga en cuenta que otros amplificadores que permiten grabaciones de corriente con la pinza en el modo rápido también se pueden utilizar. Aplicar y mantener la presión positiva en la solución de la pipeta. Seleccione una celda con un cuerpo de la célula grande, así que lo más probable es una célula de ganglio en lugar de una célula amacrinas desplazadas o una célula glial. Lentamente baje la punta de la pipeta por lo que está haciendo un pequeño hoyuelo en la superficie de la membrana, detener y liberar la presión. Bajar inmediatamente el potencial de mantenimiento de - 60 mV. Una vez que un gigaseal (GΩ) se logra entre ellos, aspirar con cuidado para romper la membrana para lograr una configuración de patch clamp de células enteras. Este procedimiento es una etapa delicada, si se aplica demasiada presión negativa, entonces la conexión se hace con fugas; si es demasiado pequeño, la membrana permanece intacta. </li><li> Con el tiempo, Amarillo Lucifer va a llenar la celda, permitiendo la visualización de la morfología de la célula. Si es estable, esta configuración debe durar 30 minutos o más. </li></ol> 3. Grabaciones de las células ganglionares Uso Dynamic Clamp <ol><li> En primer lugar, una prueba de corriente-voltaje (de - 75 a + 35 mV cada 10 mV) se ejecuta utilizando PatchMaster. Proceder a las pruebas posteriores sólo si una gran corriente de Na + (&gt; 1 nA) está presente. Cabe destacar que en las raras ocasiones en que se remienda una célula amacrinas desplazadas, en ese caso, no se responderá con los trenes de potenciales de acción a las inyecciones de corrientes posteriores. </li><li> Abra LabVIEW y ejecutar el programa Neuroakuma escrita personalizada, cargan varias formas de onda de la conductancia. Establecer el número de repeticiones a 8 (6-8 para fines estadísticos). Establecer los potenciales de inversión de conductancias excitatorios e inhibitorios en 0 y - 75 mV, respectivamente. Seleccione un par a juego de conductancias excitatorios e inhibitorios para la prueba. Trace conductancia excitatorios (en verde) y trace la conductancia inhibitoria (en rojo) aparecerán en el panel inferior. </li><li> Volver a PatchMaster, seleccione el modo de pinza de corriente y cambiar inmediatamente el amplificador en modo de pinza de corriente &#39;CC + Comm FAST. Este modo permite accurately seguir los cambios rápidos en el potencial de membrana. Si se mantiene un buen sello entre la membrana y la pipeta, poco / no se necesita compensación, de lo contrario, la grabación no durará mucho tiempo. En Neuroakuma, presione el botón &quot;grabar&quot;. La respuesta celular (por lo general con una explosión fásica de potenciales de acción, la figura 1A) aparecerá en el panel superior. Inyecte corriente en la celda con baja escala de conductancias primero, si poco / no se observa respuesta, aumentar en forma gradual hasta que se produce una fuerte respuesta. Inyección de corriente excesiva puede matar a la célula. Una vez que las pruebas se han completado, seleccione un nuevo par de formas de onda de la conductancia, repetir lo anterior para todos los pares de conductancias fisiológicos y artificial. Las corrientes fisiológicas (I) inyectados en tiempo real se basan en: I (t) = G exc (t) x (V m (t) - V exc) + G inh (t) x (V m (t) - V inh) </li></ol> Conductancia (G IN NS) podría ser synaptic o artificial. Excitatorios e inhibitorios formas de onda de la conductancia sináptica se recogieron a partir de experimentos previos realizados por Protti, Di Marco, Huang, Vonhoff, Nguyen y Solomon (resultados no publicados) en respuesta a diferentes estímulos visuales en condiciones de control y en presencia de la tetrodotoxina (TTX, 1 mM) . Formas de onda de la conductancia Artificial se modelaron usando una función alfa. V m (en mV) es el potencial de membrana grabada. Exc T y G inh representan conductancias excitatorios e inhibitorios respectivamente, mientras que V y V exc inh representan los potenciales de inversión de conductancias excitatorios e inhibitorios respectivamente. El tiempo es t en ms. La velocidad de muestreo es de 40 kHz. I s I = 0 (t / α) e-αt La ecuación anterior es una función alfa (I 0 = corriente máxima; 1 / α = tiempo hasta el pico (seg-1) de la corriente). El tiempo de subida y tiempo de caída del sinápticaactual está dictada por α 4. La conductancia excitatorio se mantuvo sin cambios, mientras que la latencia de la conductancia inhibitoria fue modificada, reduciendo su retraso con respecto al inicio de la excitación (Figura 2D). <ol start="4"><li> Después de grabar, retroceder con cuidado la pipeta para que el cuerpo de la célula se mantiene intacta. Inmediatamente fijar el tejido en 4% de paraformaldehído durante 30 min, seguido de tres lavados de 10 min con 0,1 M de tampón de fosfato. Refrigerar y realizar la tinción de anticuerpos el día siguiente o dentro de una semana. </li></ol> 4. Tinción de anticuerpos contra Lucifer amarillo lleno células ganglionares retinianas <ol><li> La tinción de anticuerpos contra las células ganglionares de Lucifer Yellow llenas a temperatura ambiente (anti-IgG de conejo Amarillo Lucifer primario (dilución = 1:10.000) durante cinco días, en el sexto día, la tinción durante la noche con secundario de cabra anti-IgG de conejo (dilución 1:500 = )). Humedezca montar la retina en fluorescentes Medios Conservación. Cubra resbalar y sellar con esmalte polish. </li><li> Tomar imágenes confocales de la morfología de las células utilizando un microscopio confocal Leica Spec-II (Figura 1B). La presencia de un axón permite la confirmación de las células ganglionares. </li></ol>

<ol>
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F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+clamp:+computer-generated+conductances+in+real+neurons.">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).</li><li>Johnson, D., Wu, S. M. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Foundations of cellular neurophysiology. , (1995).</li><li>Taylor, W. R., Vaney, D. 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In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series.</a> Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience. 1, (2009).</li><li>Marco, S. D. i., Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+functional+reorganization+of+retinal+circuits+induced+by+early+long-term+visual+deprivation.">Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).</li><li>Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. 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L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina.">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).</li><li>Middleton, T. P., Protti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+modulate+spontaneous+synaptic+activity+in+retinal+ganglion+cells.">Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells.</a> Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).</li><li>Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+GFP-expressing+cell+populations+in+the+intact+retina.">Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina.</a> J. Vis. Exp. (57), e3457 (2011).</li></ol>

Todos los procedimientos fueron aprobados por primera vez por el Comité de Ética de Cuidado de Animales de la Universidad de Sydney, y luego se realizan de acuerdo con las directrices del Código Australiano de Prácticas para el Cuidado y Uso de Animales con Fines Científicos (Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica de Australia ).

Aquí se muestra el uso de la abrazadera dinámico para evaluar la influencia de la relación y la temporización relativa de la excitación y la inhibición en la producción de células ganglionares de la retina. Abrazadera dinámica hace uso de simulaciones por ordenador para introducir conductancias sinápticas fisiológicamente grabados o artificiales en neuronas vivas. Esta metodología proporciona una herramienta interactiva por el cual las conductancias pueden ser modificados y se inyecta en las neuronas para ca...

La retina es un tejido neural casi transparente que recubre la parte posterior del ojo. Muchos estudios utilizan la retina como modelo para investigar los primeros pasos en el procesamiento visual y los mecanismos de señalización sináptica. Dado que la red de la retina en la preparación de todo el montaje se mantiene intacta después de la disección, se representa un sistema ideal para estudiar las interacciones sinápticas como sus respuestas fisiológicas son muy similares a las condiciones in vivo. Por lo tanto, el uso de una retina aislada de las propiedades de las neuronas puede ser estudiado mediante técnicas de patch clamp (para revisiones en la técnica, véase 6,9,13). Identificación de la contribución exacta de los circuitos y los neurotransmisores a la respuesta de células ganglionares específicos, sin embargo, se ve obstaculizada por lo general como agentes farmacológicos actúan en varios sitios. Respuestas fisiológicas de neuronas de la retina a la luz, el estímulo natural se pueden grabar con pipetas de vidrio llenos de líquido intracelular. Con cl patchtécnicas de amplificación, las respuestas neuronales a la estimulación de luz se pueden grabar como membrana fluctuaciones potenciales (pinza de corriente) o como corrientes (fijación de voltaje). Al mantener el potencial de membrana a diferentes voltajes y la implementación de un análisis de la conductancia a posteriori, es posible aislar entradas sinápticas inhibitorias y excitatorias 5,12. Este tipo de experimentos se puede llevar a cabo en un medio de baño normal y en la presencia de diferentes agentes farmacológicos para aislar la contribución de los diferentes neurotransmisores y receptores a las respuestas neuronales. Una gran cantidad de estudios de muchos laboratorios caracteriza la dependencia de la adición de salida y entradas excitatorias e inhibitorias en las propiedades de estímulo, como el tamaño, el contraste, las frecuencias espaciales y temporales, la dirección, orientación y otras variables de estímulo. Aunque estos enfoques experimentales proporcionan información acerca de la relación entre la salida de pico y entradas sinápticas como una función de las propiedades de estímulo,interpretación de la contribución de los tipos de células específicas y de sus entradas sinápticas a la excitabilidad celular no es sencillo. Esto es debido al hecho de que los insumos típicamente tanto excitatorios e inhibitorios varían con las propiedades de estímulo y, por tanto, no es posible evaluar el impacto preciso que los cambios en cualquiera de estas entradas tiene en spiking neuronal. Un enfoque alternativo para eludir estas limitaciones es para llevar a cabo abrazadera grabaciones dinámicos, que permiten una evaluación crítica de la contribución de las entradas sinápticas individuales para clavar de salida. La técnica de la pinza dinámica permite la inyección directa de la corriente en la célula y la cantidad de corriente inyectada en un momento dado depende del potencial de membrana registrada en ese momento 1,2,3 (para una revisión, ver 7,14). Se trata de una pinza de corriente modificada configuración donde a, interacción rápida retroalimentación en tiempo real entre la célula en la grabación y el equipo que comprende hardware especializado, softwarey se logra un ordenador. La cantidad de corriente inyectada en la célula se calcula en consecuencia. Por lo tanto, la ventaja de este método es que la célula puede ser estimulada con diferentes combinaciones de formas de onda de la conductancia, y su respuesta se imitan la activación de los receptores que median las entradas sinápticas. Por ejemplo, la comparación de la respuesta a la inyección de las conductancias de excitación e inhibición para una pequeña mancha con la respuesta a la inyección de la conductancia excitador para un pequeño punto sólo proporciona información sobre el impacto de la inhibición de la respuesta celular. Del mismo modo, otras combinaciones de conductancias registrados fisiológicamente pueden ser co-inyectaron a revelar cómo estímulo dependiente de los cambios en las conductancias excitatorios y / o inhibidor afecta a la salida pico. En nuestro estudio, la técnica de la pinza dinámica se utiliza para demostrar el impacto de la amplitud relativa y el momento de entradas sinápticas sobre las propiedades de disparo de las células ganglionares de la retina. Varios conductanciasobtenido a partir de experimentos fisiológicos en condiciones de control o en presencia de agentes farmacológicos fueron empleados como entradas. Además, también se utilizaron las conductancias artificiales basados ​​en funciones alfa con el fin de investigar cómo entradas sinápticas están integrados por las neuronas. Por lo tanto esta es una técnica versátil que permite distintos tipos de conductancia generado ya sea fisiológicamente, farmacológicamente o computacionalmente para ser inyectada en la misma célula ganglionar, lo que la comparación de las respuestas a estas entradas se puede hacer.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Inhalation Anaesthetic</td>
			<td>Pharmachem</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ames Medium with L-Glutamate (Powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Gluconate, Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution (4.9 mol/l)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Powder, 95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Preserving Media</td>
			<td>BioFX Laboratories Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0794</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Stage Glass Microelectrode Puller</td>
			<td>Narishinge Japan</td>
			<td>Model PP-830</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 2</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV 0.22 &mu;m Filter Unit</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G</td>
			<td>Smith &amp; Nephew (Australia)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Inline Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>Model SH-27B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Automatic Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Stereomicroscope SZ61</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0-30 V 2.5 A DC Power Supply</td>
			<td>Dick Smith Electronics</td>
			<td>Q1770</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Microscopic Camera ProgResMF cool</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator MP-225</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch Clamp Amplifier EPC 8</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer: DELL</td>
			<td>Dell Corporation</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementing dynamic clamp with synaptic and artificial conductances in mouse retinal ganglion cells

Las células ganglionares son las neuronas de salida de la retina y su actividad refleja la integración de múltiples entradas sinápticas derivados de circuitos neuronales específicas. Técnicas de patch clamp, de fijación de voltaje y configuraciones de corriente con la pinza, se utilizan comúnmente para estudiar las propiedades fisiológicas de las neuronas y caracterizar sus entradas sinápticas. Aunque la aplicación de estas técnicas es altamente informativo, plantean varias limitaciones. Por ejemplo, es difícil de cuantificar cómo las interacciones exactas de las entradas excitadoras e inhibidoras determinan de salida de respuesta. Para solucionar este problema, se utilizó una técnica de modificación actual abrazadera, abrazadera dinámica, también llamada la conductancia abrazadera 1, 2, 3 y examinamos el impacto de entradas sinápticas excitatorios e inhibitorios sobre la excitabilidad neuronal. Esta técnica requiere la inyección de corriente en la célula y es dependiente de la retroalimentación en tiempo real de su potencial de la membrana en ese momento. El injectéd actual se calcula a partir predeterminados conductancias sinápticas excitatorias e inhibitorias, sus potenciales de inversión y instantánea potencial de membrana de la célula. Los detalles de los procedimientos experimentales, patch clamp células para lograr una configuración de célula y el empleo de la técnica de sujeción dinámico se ilustran en este artículo de vídeo. Aquí, se muestra las respuestas de las células ganglionares de la retina de ratón para varias formas de onda de la conductancia obtenido a partir de experimentos fisiológicos en condiciones de control o en la presencia de drogas. Además, se muestra el uso de las conductancias excitatorios e inhibitorios artificiales generados usando funciones alfa para investigar las respuestas de las células.

La contribución de las diferentes fuentes de entradas inhibitorias a las respuestas de células ganglionares se demuestra a través de la aplicación de diversas formas de onda de la conductancia. Estas formas de onda se obtuvieron con estímulos de diferente luminancia en condiciones normales y en presencia de TTX, Na + dependiente de voltaje bloqueador de los canales que bloquea la generación de potencial de acción sólo en un subconjunto de interneuronas inhibidoras de la retina. Figura 2A</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells at JoVE.com

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Este artículo de vídeo ilustra los set-up, los procedimientos para remendar los cuerpos celulares y cómo implementar clamp grabaciones dinámicas de las células ganglionares de todo el montaje del ratón retinas. Esta técnica permite la investigación de la contribución precisa de entradas sinápticas excitatorias e inhibitorias, y su magnitud relativa y el momento para spiking neuronal.

Implementar Clamp dinámico con conductancias sinápticas y artificiales en células de ratón ganglionares retinianas

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.2K vistas.  University of Sydney. Este artículo de vídeo ilustra los set-up, los procedimientos para remendar los cuerpos celulares y cómo implementar clamp grabaciones dinámicas de las células ganglionares de todo el montaje del ratón retinas. Esta técnica permite la investigación de la contribución precisa de entradas sinápticas excitatorias e inhibitorias, y su magnitud relativa y el momento para spiking neuronal.

Video: Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Grabaciones de patch clamp de neuronas de ratón de retina en una rebanada preparación adaptada a la oscuridad

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Investigación

Neurociencias

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

Una preparación aislada de retina para registrar la respuesta de la luz a partir de semillas etiquetadas las células ganglionares retinianas

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Etiquetado retrógrada de células ganglionares retinianas en adultos de pez cebra con tintes fluorescentes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Grabación Luz evocó-Respuestas postsinápticos en las neuronas en adaptadas oscuro, Preparaciones ratón retina Slice Uso de técnicas Patch Clamp

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

RNA-Seq de una sola célula de subconjuntos definidos de células de ganglio retiniano

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Tomografía de coherencia óptica: Proyección de imagen de ratón ganglionares de la retina las células In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Combinando Optogenetics con microRNAs artificiales para caracterizar los efectos de Gene caída en la función presináptica en circuitos neuronales intactas

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic multiplicity). Synaptic multiplicity is plastic and changes throughout development and in different physiological conditions, being an important determinant for the efficacy of synaptic transmission. Here, we outline experiments for estimating the degree of multiplicity of synapses terminating onto a given postsynaptic neuron using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices. Specifically, voltage-clamp recording is used to compare the difference between the amplitude of spontaneous excitatory postsynaptic currents (sEPSCs) and miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs). The theory behind this method is that afferent inputs that exhibit multiplicity will show large, action potential-dependent sEPSCs due to the synchronous release that occurs at each synaptic contact. In contrast, action potential-independent release (which is asynchronous) will generate smaller amplitude mEPSCs. This article outlines a set of experiments and analyses to characterize the existence of synaptic multiplicity and discusses the requirements and limitations of the technique. This technique can be applied to investigate how different behavioral, pharmacological or environmental interventions in vivo affect the organization of synaptic contacts in different brain areas.

Here, we present a protocol for evaluating the functional synaptic multiplicity using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices.

Evaluación de multiplicidad sináptica mediante electrofisiología Patch-clamp de celulares

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

Aislamiento de retina de ratón y tratamiento con metanol para el estudio de las células ganglionares de la retina

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

Autor destacado: Preparación de montaje completo a base de metanol para la investigación de las células ganglionares de la retina  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

Preparación de montaje completo a base de metanol para la investigación de células ganglionares de la retina

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...