עבודה זו נתמכת על ידי המועצה למחקר האוסטרלית (ARC DP0988227) וחקר המדעים ביו גרנט היוזמה מהדיסציפלינה של המדע ביו, אוניברסיטת סידני. מגבר הצמד תיקון ציוד EPC 8 מומן על ידי קרן האתחול מהדיסציפלינה של מדע ביו, אוניברסיטת סידני. מערכת ציוד InstruTECH LIH 8 8 נתונים הרכישה נרכשה בכספים מרבקה ל &#39;קופר קרן וקרן אתחול מהדיסציפלינה של מדע ביו, אוניברסיטת סידני. ברצוננו להודות לסוקרים אנונימיים לקבלת ההצעות והערות תובנה שלהם.

1. הגדרה כללית והכנת רקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את העכבר בחושך במשך 30 דקות (במטרה להפחית את רמת המתח שלה). בזמן ההמתנה, להכין 1 ליטר של פתרון תאי. הראשון לפזר 1.9 גרם של סודה לשתייה בחץ ליטר המים מילי-Q. ה-pH שלו נשמר על ידי 7.4 מבעבעים עם 95% O 2 ו 5% CO 2. חמש דקות לאחר מכן, לפזר 8.8 גרם של איימס בינוני ב100 מ&quot;ל של מים מילי-Q, להוסיף לפתרון סודיום ביקרבונט, עליון עד 1 ליטר עם מים מילי-Q ומערבבים היטב. שמור פתרון זה carboxygenated לשארית של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 250 מ&quot;ל של איימס בינוני carboxygenated ולהגדיר את המערכת בנוזל reperfusion אלקטרו ההגדרה. שמור את פתרון carboxygenated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחיד למרוח שכבה דקה של שומן ואקום על החלק התחתון של חדר זלוף. לאטום אותו עם פיסת כיסוי ולוודא שהוא אוויר חזק. קח כמות קטנה של שומן (~ 2 מ&quot;מ קוטר) ולמקם אותו בחלק העליון ומסתיים תחתון של החדר. הכדורים האלה יחזיקו את הרשת (מסגרת פלטינה מתוחה עם חוט דנטלי) במקום ולמנוע אותה לחיצה חזקה מדי על הרשתית. תקן את התא על גבי פלטפורמה וליישר את שני הפתחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי החיים הוא מורדמים ראשון עם Isoflurane למשך 2 דקות, ולאחר מכן הקריבו על ידי נקע בצוואר רחם. להסיר במהירות את העיניים עם זוג מספריים קטנים (להבים מעוגלים), לשטוף ביסודיות עם נוזל חוץ תאי carboxygenated בכוס קטנה, ולאחר מכן למקם בצלחת פטרי מלאה בנוזל חוץ תאי carboxygenated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, לעשות חור כניסה בקרנית (~ 2 מ&quot;מ מהקצה) באמצעות מחט מד 19. חזור לעין השנייה. צעד חשוב זה צריך להיות מהיר כדי לאפשר חמצון של שניהם הרשתיות. הסר קרנית אחד עם מספריים קטנים קשתית על ידי חיתוך במקביל לקצה שלה. בשלב הבא, להסיר את הקשתית ועדשה עם זוג מלקחיים בסדר. חזור לעין השנייה. העבר את כוס עין אחת לתוך כוס המכילהcarboxygenated פתרון תאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם להב סכין מנתחים, לחתוך כוס עין אחת לשתיים, כדי שתוכל לשטח את כל ההר, וכדי לקבל שני שלם mounts לרשתית. להפריד בזהירות את הרשתית מאפיתל הפיגמנט באמצעות בדיקה לנתח בוטה או על ידי משייכתו בעדינות אותו. פעם אחת מנותק, הרשתית היא די שקופה. שימו לב למשטח הקמור הוא הצד הקולטני האור. המשטח הקעור הוא צד תאי גנגליון והוא עשוי להיצמד לעצמו בשל נוכחותם של הומור זגוגית דביק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג מלקחיים בסדר, להחזיק את הקצה של רקמת הרשתית המנותקת הקרובה לserrata האורה ולתפוס את serrata האורה עם זוג נוסף של מלקחיים עדינים, מושך אותו לכיוון מרכז הרשתית. זהו תהליך עדין ועלולים לקחת כמה ניסיונות. אם יצליח, serrata אורה, גוף הריסים והומור זגוגית יוסרו על ידי תהליך זה, והעקמומיות של הרשתית מצטמצמת (כלומר להחמיא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את הקצוות, ולאחר מכן להעביר אותו לכלקאמרי איחוי עם תאי הגנגליון פונים כלפי מעלה. החזק את הרקמות במקום על ידי הצבת הרשת על גבי כדורי הגריז. הנח את הרקמה שנותרה עם כוס העין השנייה לשימוש מאוחר יותר. נהלים דומים לנתיחת רשתית מתוארים במידלטון וProtti 16 וPottek et al. 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר חדר ההקלטה תחת מיקרוסקופ זקוף. מייד הקים זלוף המתמשך של הרשתית עם פתרון carboxygenated תאי (35.5 מעלות צלזיוס) בשיעור של 3 - 5 מ&quot;ל / דקה. ודא אלקטרודה ההארקה נמצאת במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצורף למיקרוסקופ הוא מצלמה דיגיטלית המאפשרת הדמיה של הרקמות. כל הסט עד יושב מעל שולחן אוויר (ספיגת זעזועים) ובתוך כלוב פאראדיי (שדות סטטיים ואינם סטטית חיצוניים בלוקים חשמליים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מקור האור (אינפרא אדום,&gt; 850 ננומטר) ועם מטרת 40X, להביא את המיקוד שלה על גופי התא של תאי הגנגליון. מצא את האזור המרכזי של כל ההר לrecorדינג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר בקבוקון קפוא של K + פתרון מבוסס תאי (300 μl, pH = 7.4) המכיל (מ&quot;מ) K-גלוקונאט: 140, חומצת HEPES: 10, MgCl 2: 4.6, ה-ATP-Na +: 4, GTP-Na + : 0.4 וEGTA: 10. כל חומרים כימיים שנרכשו מסיגמה אולדריץ. </li></ol> 2. גופי תא תיקון של תאי הגנגליון ברשתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אש ראשונה ללטש את הקצוות של צינורות זכוכית נימי ורוסיליקט, ולאחר מכן למשוך אותם עם חולץ microelectrode זכוכית עם שני שלבי חימום (התנגדות: 5 - 8 MΩ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 μl של צהוב לוציפר (ריכוז סופי של 0.2%) לפתרון תאי, ומערבב היטב, וצנטריפוגות זה. בשלב הבא, להעביר את 85% העליון של הפתרון לתוך מזרק 1 מ&quot;ל, לחבר אותו ליחידת ilter F מיקרומטר 0.22, ולאחר מכן למחט מזרק לשימוש חוזר 30-G. שומר במקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את פיפטה הזכוכית, בגודל קצה דומה לאלה המשמשים להקלטות, במחזיק בו ולהעביר אותו תחת מיקרוסקופ באמצעות micromanipulaטור. תחת מטרת 40X, לאט לאט להוריד את פיפטה עד שהוא עושה גומה קטנה על פני השטח של קרום הגבלה הפנימי. להתקדם בזהירות פיפטה קדימה עד שתופס כמות קטנה של רקמות, ולאחר מכן להעביר אותו כלפי מעלה ו / או לצדדים לקרוע חור קטן כדי לחשוף את גופי התא של תאי הגנגליון. קטן החור, גבוה יותר את מידת היושרה של רשת הרשתית נשמר. אם תרצה, sulforhodamine 101 (SR101; 0.5 - 1 מיקרומטר) ניתן להוסיף למדיום תאי לתייג תאי עצב שניזוקו על ידי שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את פיפטה נקיות עם 8 - 10 μl של פתרון תאי. הכנס אותו לבעל המצורף לבמה את ראשו של המגבר ולוודא את האלקטרודה כלוריד כסף כלור היא שקועה. בטל אם לכלוך ו / או בועות אוויר היא / הם הווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את כל הציוד. אנחנו השתמשנו מגבר מהדק תיקון 8 EPC הנשלט על ידי PatchMaster להשיג כל תא הקלטות בקון מהדק מתחפיגורציה. שימו לב שיכולים לשמש גם מגברים אחרים המאפשרים הקלטות מהדק הנוכחיות במצב במהירות. להחיל ולשמור על לחץ חיובי בפתרון פיפטה. בחר תא בגוף תא גדול כל כך סביר להניח שזה תא גנגליון במקום תא amacrine עקור או תא גליה. לאט לאט להוריד את קצה פיפטה כך שזה עושה גומה קטנה על פני השטח של הקרום, לעצור, ולשחרר את הלחץ. מייד להוריד את פוטנציאל ההחזקה ל-- 60 mV. ברגע שgigaseal (GΩ) מושגת ביניהם, בעדינות למצוץ לשבור את הקרום כדי להשיג תצורת מהדק תיקון כל תא. הליך זה הוא צעד עדין, אם לחץ שלילי יותר מדי מוחל, אז החיבור הופך דולף, אם מעט מדי, הקרום נשאר שלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך זמן, לוציפר צהוב ימלא את התא, ומאפשר הדמיה של המורפולוגיה של התא. אם יציב, הגדרה זו צריכה להימשך 30 דקות או יותר. </li></ol> 3. הקלטות של תאי הגנגליון שימוש Dynamiג קלאמפ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, בדיקה נוכחית במתח (מ - 75 עד 35 + mV כל 10 mV) מבוצע באמצעות PatchMaster. המשך לבדיקות מאוחרות יותר רק אם Na גדול + נוכחי (&gt; 1 Na) הוא הווה. יצוין, כי באירוע הנדיר שבו תא amacrine העקורים הוא תוקנו, במקרה זה, לא יגיב עם רכבות של פוטנציאל פעולה לזריקות שוטפות לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LabVIEW הפתוח ולבצע את תכנית Neuroakuma נכתב המותאמת אישית, ולאחר מכן לטעון את גל מוליכות שונים. להגדיר מספר חוזר עד 8 (6 - 8 למטרה סטטיסטית). הגדר פוטנציאלי היפוך של conductances המעוררות והמעכב וב0 - 75 mV בהתאמה. בחר זוג תואם אחד conductances המעוררות והמעכב לבדיקה. עקבות מוליכות מעוררות (בירוק) ועקבות מוליכות מעכבות (באדום) יופיעו בפנל התחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור לPatchMaster, בחר מצב מהדק נוכחי, ולעבור באופן מיידי למצב מגבר המהדק הנוכחי &quot;CC + תקשורת מהירה&quot;. מצב זה מאפשר לACCurately בצע שינויים מהירים בפוטנציאל הממברנה. אם איטום טוב בין הקרום ופיפטה נשמר, / אין צורך בפיצוי קטן, אחרת ההקלטה לא תימשך זמן רב. בNeuroakuma, לחץ על הכפתור &quot;הרשומה&quot;. התגובה התאית (בדרך כלל עם פרץ phasic של פוטנציאל פעולה, איור 1 א) תופיע בפנל העליון. הזרק נוכחי לתוך התא עם דרוג נמוך של conductances הראשונה, אם מעט / אין תגובה הוא ציין, להגדיל במרווחים קטנים עד שהוא מייצר תגובה חזקה. הזרקה נוכחית מוגזמת יכולה להרוג את התא. בדיקות לאחר השלמה, בחר זוג חדש של צורות גל מוליכות, חזור מעל לכל הזוגות של conductances הפיזיולוגי והמלאכותית. הזרמים הפיסיולוגיים (אני) הוזרקו בזמן אמת המבוססים על: אני (לא) = G exc (t) x (V מ &#39;(t) - V exc) + G INH (t) x (V מ&#39; (t) - V INH) </li></ol> מוליכות (G בNS) יכולה להיות סאיnaptic או מלאכותי. מניסויים קודמים שבוצעו על ידי Protti, די מרקו, הואנג, Vonhoff, נגויין וסולומון (תוצאות לא פורסמו) בתגובה לגירויים חזותיים שונים בתנאי בקרה ובנוכחות של צורות גל tetrodotoxin מוליכות הסינפטי מעוררות ומעכבות נאספו (TTX, 1 מיקרומטר) . גל מוליכות מלאכותי היה מודל באמצעות פונקצית אלפא. V מ &#39;(בmV) הוא פוטנציאל הממברנה המוקלט. G ו-G exc INH מייצגים conductances המעוררות והמעכב בהתאמה תוך exc V ו-V INH מייצגים את פוטנציאלי ההיפוך של conductances המעוררות והמעכב, בהתאמה. זמן הוא לא בטרשת נפוצה. קצב דגימה הוא 40 קילוהרץ. אני S = אני 0 (ט / α) דואר αt המשוואה לעיל היא פונקצית אלפא (אני 0 = זרם מרבי; 1 / α = זמן השיא (שניות -1) של נוכחי). זמן העלייה וזמן דעיכה של הסינפטינוכחי מוכתב על ידי α 4. המוליכות מעוררות נותרות ללא שינוי בזמן ההשהיה של מוליכות מעכבות שונה, הפחתת העיכוב ביחס להתפרצות של עירור (איור 2 ד). <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקלטה, לחזור בו בזהירות פיפטה כך גוף התא נשאר ללא פגע. מייד לתקן רקמות בparaformaldehyde 4% למשך 30 דקות, ואחרי שלוש דקות עם 10 שוטף 0.1 מ &#39;של חיץ פוספט. מכניס למקרר ולבצע נוגדנים מכתימים את היום שלמחרת או בתוך שבוע. </li></ol> 4. מכתים נוגדן נגד תאי רשתית גנגליון וציפר צהובים מלאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים נוגדן נגד תאי וציפר צהובים מלא הגנגליון בטמפרטורת חדר (העיקרי נגד לוציפר ארנב IgG הצהוב (= דילול 1:10,000) לחמישה ימים; ביום השישי, מכתים הלילה עם שני עיזים נגד ארנב IgG (= דילול 1:500 )). הרטב לעלות רשתית במדיה שימור פלורסנט. כיסוי להחליק ולאטום עם המסמר עמ &#39;olish. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות confocal של המורפולוגיה של התאים באמצעות מיקרוסקופ confocal Spec-השני לייקה (איור 1). נוכחותו של האקסון מאפשרת אישור לתאי גנגליון. </li></ol>

<ol>
	<li>Robinson, H. P. C., Kawai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+digitally+synthesized+synaptic+conductance+transients+to+measure+the+integrative+properties+of+neurons.">Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).</li><li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+clamp:+artificial+conductances+in+biological+neurons.">The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons.</a> Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).</li><li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+clamp:+computer-generated+conductances+in+real+neurons.">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).</li><li>Johnson, D., Wu, S. M. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Foundations of cellular neurophysiology. , (1995).</li><li>Taylor, W. R., Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+synaptic+mechanisms+generate+direction+selectivity+in+the+rabbit+retina.">Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina.</a> Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).</li><li>Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+patch+clamp+technique+in+ion+channel+research.">The patch clamp technique in ion channel research.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).</li><li>Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+clamp+comes+of+age.">The dynamic clamp comes of age.</a> Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).</li><li>Williams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+compartmentalization+and+functional+impact+of+conductance+in+pyramidal+neurons.">Spatial compartmentalization and functional impact of conductance in pyramidal neurons.</a> Nature Neuroscience. 7 (9), 961-967 (2004).</li><li>Perkins, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-attached+voltage-clamp+and+current-clamp+recording+and+stimulation+techniques+in+brain+slices.">Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).</li><li>Feng, S. S., Jaeger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+SK+calcium-dependent+potassium+currents+in+regulating+the+activity+of+deep+cerebellar+nucleus+neurons:+a+dynamic+clamp+study.">The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study.</a> Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).</li><li>Butera, R., Lin, R., Destexhe, A., Bal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+factors+for+improving+dynamic+clamp+performance.+In:+Dynamic-Clamp+From+Principles+to+Applications+Series.">Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series.</a> Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience. 1, (2009).</li><li>Marco, S. D. i., Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+functional+reorganization+of+retinal+circuits+induced+by+early+long-term+visual+deprivation.">Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).</li><li>Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+technique:+review+of+the+current+state+of+the+art+and+potential+contributions+from+nanoengineering.">Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering.</a> Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).</li><li>Lobb, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+NMDA+receptor+conductance+in+rat+midbrain+dopaminergic+neurons+using+the+dynamic+clamp+technique.">Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique.</a> J. Vis. Exp. (46), e2275 (2010).</li><li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina.">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).</li><li>Middleton, T. P., Protti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+modulate+spontaneous+synaptic+activity+in+retinal+ganglion+cells.">Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells.</a> Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).</li><li>Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+GFP-expressing+cell+populations+in+the+intact+retina.">Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina.</a> J. Vis. Exp. (57), e3457 (2011).</li></ol>

כל ההליכים אושרו תחילה על ידי ועדת האתיקה של הטיפול בבעלי החיים באוניברסיטה של ​​סידני, ולאחר מכן בוצעו בהתאם להנחיות של הקוד האוסטרלי של אימון לטיפול והשימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות (בריאות הממלכתית ומועצה למחקר רפואי של אוסטרליה ).

כאן אנו מציגים את השימוש במהדק דינמי כדי להעריך את ההשפעה של היחס והתזמון יחסי של עירור ועיכוב בתפוקת תא הגנגליון ברשתית. מהדק דינמי עושה שימוש בסימולציות מחשב כדי להציג את conductances סינפטיים פיזיולוגית מוקלט או מלאכותי לנוירונים חיים. מתודולוגיה זו מספקת כלי אינטראקט...

הרשתית היא רקמה עצבית כמעט שקופה המצפה את החלק האחורי של העין. מחקרים רבים משתמשים ברשתית כמודל כדי לחקור את צעדיו הראשונים בעיבוד חזותי ומנגנונים של איתות הסינפטי. מאז רשת הרשתית בהכנה כל ההר נשארה שלמה לאחר נתיחה, הוא מייצג מערכת אידיאלית ללמוד אינטראקציות הסינפטי כתגובות הפיזיולוגיות שלו דומות מאוד לתנאים בvivo. כך, באמצעות רשתית מבודדת את המאפיינים של תאי העצב שלו ניתן ללמוד תוך שימוש בטכניקות מהדק תיקון (לביקורות על הטכניקה, ראה 6,9,13). זיהוי התרומה של מעגלים ומוליכים עצביים לתגובת תא גנגליון הספציפיים המדויקת, לעומת זאת, בדרך כלל הפריע כסוכנים תרופתיים לפעול באתרים שונים. תגובות פיסיולוגיות של תאי עצב ברשתית לאור, הגירוי הטבעי, ניתן להקליט עם pipettes זכוכית מלא בנוזל תוך תאי. באמצעות תיקון CLטכניקות מגבר, תגובות עצביות לגירוי אור ניתן להקליט כמו תנודות פוטנציאל הממברנה (מהדק נוכחי) או כזרמים (מהדק מתח). על ידי החזקת פוטנציאל הממברנה במתחים שונים וביישום ניתוח מוליכות בדיעבד, אפשר לבודד את תשומות סינפטיים מעכבות ומעוררות 5,12. סוג זה של ניסויים יכול להתבצע במדיום רחצה רגיל ובנוכחותם של סוכנים תרופתיים שונים כדי לבודד את תרומתו של נוירוטרנסמיטורים ואת הקולטנים לתגובות עצביות שונים. שפע של מחקרים ממעבדות רבות אפיין את התלות של תפוקה ותשומות spiking מעוררות ומעכבות על נכסי תמריצים כגון גודל, בניגוד, תדרי מרחב ובזמן, כיוון, כוונה ומשתנים גירוי אחר. אם כי אלה גישות ניסיוניות לספק מידע על הקשר בין התפוקה ותשומות ספייק סינפטיים כפונקציה של מאפייני גירוי,הפרשנות של התרומה של סוגי תאים מסוימים והתשומות סינפטיים לרגישות תא היא לא פשוטה. זאת בשל העובדה שהן בדרך כלל תשומות מעוררות ומעכבות להשתנות עם מאפייני גירוי ולכן, לא ניתן להעריך את ההשפעה המדויקת ששינויים בכל אחד מתשומות אלה יש בspiking העצבי. גישה חלופית כדי לעקוף מגבלות אלו היא לבצע הקלטות מהדק דינמיות, המאפשרות הערכה ביקורתית של התרומה של תשומות סינפטיים בודדות לspiking פלט. טכניקת המהדק הדינמית מאפשרת הזרקה ישירה של זרם לתוך התא ואת כמות המוזרקת נוכחי בזמן נתון תלויה בפוטנציאל הקרום נרשם באותה תקופה 1,2,3 (לסקירה, ראה 7,14). זוהי הגדרת מהדק נוכחי שונה שבו אינטראקציה משוב בזמן אמת, במהירות בין התא מתחת להקלטה והציוד הכולל חומרה מיוחדת, התוכנהומחשב מושגת. כמות המוזרקת הנוכחי לתוך התא מחושבת בהתאם. לפיכך, היתרון של שיטה זו הוא שהתא יכול להיות מגורה עם שילובים של צורות גל מוליכות שונות, והתגובה שלה תהיה לחקות את ההפעלה של קולטנים שמתווכים תשומות סינפטיים. לדוגמה, השוואה בין התגובה להזרקה של conductances המעוררות והמעכב לנקודה קטנה עם התגובה להזרקה של מוליכות הגירוי לנקודה קטנה מספקת מידע לגבי ההשפעה של עיכוב בתגובת תא בלבד. כמו כן, שילובים אחרים של conductances נרשם פיסיולוגיים יכולים להיות שותף הזריק לחשוף כיצד גירוי תלוי שינויים בconductances המעוררות ו / או מעכבות משפיעים על התפוקה בספייק. במחקר שלנו, נעשתה שימוש בטכניקת המהדק הדינמית כדי להדגים את ההשפעה של המשרעת והעיתוי של תשומות סינפטיים על מאפייני הירי של תאי הגנגליון ברשתית היחסי. conductances השוניםהמתקבל מניסויים פיסיולוגיים בתנאי בקרה או בנוכחות של סוכנים תרופתיים הועסקו כתשומות. בנוסף, conductances מלאכותי המבוסס על פונקציות אלפא שמשו גם כדי לחקור כיצד תשומות סינפטיים משולבות על ידי תאי עצב. לכן זו היא טכניקה צדדי המאפשרת סוגים שונים של מוליכות נוצרו גם מבחינה פיזיולוגית, פרמקולוגית או המחשוב להיות מוזרקים לתוך אותו תא גנגליון, ולכן השוואה של תגובות לתשומות אלה יכול להתבצע.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Inhalation Anaesthetic</td>
			<td>Pharmachem</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ames Medium with L-Glutamate (Powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Gluconate, Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution (4.9 mol/l)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Powder, 95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Preserving Media</td>
			<td>BioFX Laboratories Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0794</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Stage Glass Microelectrode Puller</td>
			<td>Narishinge Japan</td>
			<td>Model PP-830</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 2</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV 0.22 &mu;m Filter Unit</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G</td>
			<td>Smith &amp; Nephew (Australia)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Inline Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>Model SH-27B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Automatic Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Stereomicroscope SZ61</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0-30 V 2.5 A DC Power Supply</td>
			<td>Dick Smith Electronics</td>
			<td>Q1770</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Microscopic Camera ProgResMF cool</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator MP-225</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch Clamp Amplifier EPC 8</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer: DELL</td>
			<td>Dell Corporation</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementing dynamic clamp with synaptic and artificial conductances in mouse retinal ganglion cells

תאי הגנגליון הם תאי עצב הפלט של הרשתית ופעילותם משקפת את האינטגרציה של קלטים סינפטיים מרובים הנובעים ממעגלים עצביים ספציפיים. טכניקות תיקון מהדק, מהדק מתח ובתצורות מהדק הנוכחי, משמשות בדרך כלל כדי ללמוד את המאפיינים הפיסיולוגיים של תאי עצב ולאפיין התשומות סינפטיים שלהם. למרות היישום של טכניקות אלה הוא אינפורמטיבי מאוד, הם מציבים מגבלות שונות. לדוגמה, קשה לכמת את האופן שבו האינטראקציות המדויקות של תשומות מעוררות ומעכבות לקבוע פלט תגובה. כדי לטפל בבעיה זו, השתמשנו בטכניקה שונה נוכחית מהדק, מהדק דינמי, המכונית גם מוליכות 1 מהדק, 2, 3 ובדקנו את ההשפעה של תשומות סינפטיים מעוררות ומעכבות על רגישות עצבית. טכניקה זו דורשת הזרקה של זרם לתוך התא ותלוי במשוב בזמן אמת של פוטנציאל הקרום שלה באותו זמן. Injecteד הנוכחי מחושב מראש conductances מעוררים והמעכב, הפוטנציאלים סינפטיים היפוכם ואת הפוטנציאל המיידי הקרום של התא. פירוט השיטה הניסיוני, תיקון הידוק תאים כדי להשיג תצורה כל תא ותעסוקה של טכניקת המהדק הדינמית באות לידי ביטוי במאמר זה וידאו. כאן, אנו מציגים את התגובות של תאי הגנגליון ברשתית עכבר לצורות גל מוליכות שונות המתקבלות מניסויים פיסיולוגיים בתנאי בקרה או בנוכחותו של סמים. יתר על כן, אנו מציגים את השימוש בconductances מעוררים והמעכב המלאכותיים שנוצר באמצעות פונקציות אלפא לחקור את התגובות של התאים.

תרומתם של מקורות תשומות מעכבות לתגובות תא הגנגליון שונים באה לידי ביטוי באמצעות היישום של צורות גל מוליכות שונות. גל אלה התקבלו עם גירויים שונה של בהירות בתנאים רגילים ובנוכחותו של TTX, + חוסם מתח מגודרת Na ערוץ ש2A פעולת לוקי דור פוטנציאלי היחידה בקבוצת מ...

Watch this Scientific Journal Video about Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells at JoVE.com

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

מאמר זה וידאו מדגים את ההגדרה, את ההליכים לתיקון גופי תא וכיצד ליישם את הקלטות מהדק דינמיות מתאי הגנגליון בכל הר עכבר רשתיות. טכניקה זו מאפשרת החקירה של התרומה המדויקת של תשומות סינפטיים מעוררות ומעכבות, ואת העצמה היחסית והעיתוי שלהם לspiking העצבי.

יישום קלאמפ דינמי עם Conductances Synaptic ומלאכותי בתאי עכבר גנגליון רשתית

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

implementing-dynamic-clamp-with-synaptic-artificial-conductances

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.2K Views.  University of Sydney. מאמר זה וידאו מדגים את ההגדרה, את ההליכים לתיקון גופי תא וכיצד ליישם את הקלטות מהדק דינמיות מתאי הגנגליון בכל הר עכבר רשתיות. טכניקה זו מאפשרת החקירה של התרומה המדויקת של תשומות סינפטיים מעוררות ומעכבות, ואת העצמה היחסית והעיתוי שלהם לspiking העצבי.

Video: Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

הכנה רשתית מבודד להקליט תגובה האור תווית גנטית לתאי הגנגליון ברשתית

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

תיוג מדרדר של תאים ברשתית גנגליון מבוגרים דג הזברה עם צבעי ניאון

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

הקלטת אור עורר תגובות Postsynaptic בנוירונים מותאמים-Dark, תכשירי עכבר רשתית Slice באמצעות טכניקות הצמד התיקון

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

יחיד תא RNA-Seq של קבוצות מוגדרות של תאים גנגליון רשתית

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

טומוגרפיה אופטית קוהרנטית: הדמיה העכבר גנגליון תאים In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

שילוב Optogenetics עם מיקרו Rna מלאכותי כדי לאפיין תופעות נוקאאוט גנטי על פונקציה Presynaptic בתוך מעגלים עצביים ללא פגע

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic multiplicity). Synaptic multiplicity is plastic and changes throughout development and in different physiological conditions, being an important determinant for the efficacy of synaptic transmission. Here, we outline experiments for estimating the degree of multiplicity of synapses terminating onto a given postsynaptic neuron using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices. Specifically, voltage-clamp recording is used to compare the difference between the amplitude of spontaneous excitatory postsynaptic currents (sEPSCs) and miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs). The theory behind this method is that afferent inputs that exhibit multiplicity will show large, action potential-dependent sEPSCs due to the synchronous release that occurs at each synaptic contact. In contrast, action potential-independent release (which is asynchronous) will generate smaller amplitude mEPSCs. This article outlines a set of experiments and analyses to characterize the existence of synaptic multiplicity and discusses the requirements and limitations of the technique. This technique can be applied to investigate how different behavioral, pharmacological or environmental interventions in vivo affect the organization of synaptic contacts in different brain areas.

Here, we present a protocol for evaluating the functional synaptic multiplicity using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices.

הערכה של ריבוי סינפטית באמצעות תאים כל תיקון-קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

בידוד רשתית עכבר וטיפול במתנול לחקר תאי גנגליון ברשתית

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

מחבר זרקור: הכנה מלאה מבוססת מתנול לחקר תאי גנגליון ברשתית  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

תכשיר שלם על בסיס מתנול לחקר תאי גנגליון ברשתית

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...