Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB 655) und der Europäischen Union (ZF-Health) unterstützt.

1. Vorbereitung des Einspritzmischung <ol><li> Verwenden vivo Morpholinos als Zellen verinnerlichen effizienter als normale Morpholino Moleküle. Siehe Angaben des Herstellers für Details (Tabelle 1: Reagenzien und Materialien). </li><li> Verwendung eines fluoreszierenden Markierungsfarbstoff (zB CellTracker Red CMTPX, Invitrogen), um die Genauigkeit der Einspritzung zu visualisieren. Dieser Farbstoff wird in der Zelle abgebaut und wird nur in der Zelle nach der Aufnahme fluoreszierend. Deshalb ist dieser Schritt von entscheidender Bedeutung für die Zellen, die effizient durch die cerebroventricular Mikroinjektion werden gezielt zu bestimmen. </li><li> Bereiten Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH-Wert: 7,4) zum Verdünnen Morpholino Lösung. Wenn eine Verdünnung der Morpholino-Lösung erforderlich ist, verwenden Sie immer PBS. </li><li> Bereiten Sie 10 ul der Injektion Mischung durch Zugabe von 9 ul der Morpholino-Lösung und 1 ul the Zelle tracker Farbstoff (verdünnt oder unverdünnt Die Aktie Konzentration der Morpholino Lösung ist 500 pM Unsere bisherigen Ergebnisse zeigen, dass 22 verschiedene Dosen des Morpholino -.. im Bereich von 50 um bis 500 um - Ergebnis in verschiedenen Ebenen der Knockdown von einem effizienten Knockdown zu hypomorphen Phänotypen). 1 ul Lösung ist genug für die Injektion in einem Zebrafisch Gehirn. </li><li> Gut durchmischen und bei Raumtemperatur bis zur Injektion. </li></ol> 2. Herstellung des Injektionsgeräts <ol><li> Bereiten Sie das Glas Injektionskapillaren mit einer Nadel abziehen. Verwenden Sie die folgenden Parameter: Heizung Zyklus Wert: 463, zieht Zyklus Wert: 230, Geschwindigkeit: 1,5 Sek., Zeit: 75 ms. </li><li> Schalten Sie den Druck Quelle und passen Sie die Einstellung, um den 50 psi oder 3,5 bar. </li><li> Passen Sie die Mikroinjektor Einstellungen wie folgt: Druck halten 20 psi, 10 psi Druck Auswurf, Zeit-Wert von 2,5 und 100 ms Bereich von Gating. </li><li> Drehenauf dem Ring Illuminator und suchen Sie den Ring über das Mikroskop Bühne. </li><li> Legen Sie die Kapillarenhalter in eine geeignete Position neben dem Mikroskop. </li><li> Legen Sie die Glaskapillare in die Halterung. Stellen Sie die Einspritzwinkel bis 45 Grad. </li><li> Brechen Sie die Spitze der Glaskapillare mit einer feinen Pinzette-End-und kalibrieren den Druck Ausgang aus der Öffnung. Dies muss durch Eintauchen der Spitze der Nadel in den Fisch Wasser und damit eine zusammenhängende Druckimpuls getestet werden. Die Luftblasen entstehen sollte nur eine Zeile, die ein Indiz für optimale Druck / Öffnung Größe sein. Bitte sehen Sie das Video zur Demonstration dieser Kalibrierung. </li><li> Laden Sie die Glaskapillare mit der Injektionslösung ohne Luftblasen. </li><li> Druck ausüben, um die Luft zwischen der Spitze der Glaskapillare und der geladenen Injektionslösung zu entfernen. </li></ol> 3. Anästhesie <ol><li> Bereiten Sie die Stammlösung der Anästhetika (0,1% MESAB - Ethyl-m-aminobenzoate Methansulphonat). </li><li> Entfernen gewünschte Anzahl der Fische aus ihren Tanks in Kunststoff Mäusekäfige oder andere Transportbehälter mit genügend Menge Wasser. </li><li> Bereiten Sie die Lösung Betäubung in einem kleinen Kunststoff-Box durch Mischen von 200 ml Wasser von Fischen mit 5 ml Stammlösung Anästhetika. Endkonzentration der Anästhetika: 0,0025% (v / v). </li><li> Half-füllen eine Kunststoff-Petrischale mit Anästhetika. Verwenden Sie dieses Gericht für Injektionen. </li><li> Inkubieren Sie die Fische in den Anästhetika bis der Fisch dämpft. </li></ol> 4. Inzision und cerebroventricular Mikroinjektion <ol><li> Entfernen Sie den Fisch aus der Dose mit einem Fischernetz und legen Sie sie in der Petrischale. </li><li> Halten Sie das Fischen mit der Pinzette und orientieren sich der Kopf in einer Weise, dass es leicht nach unten kippt. Dies erleichtert den Schnitt. </li><li> Generieren Sie einen kleinen Schlitz auf den Schädel mit einer 30-Gauge-Nadel mit Widerhaken-Ende. Verwenden Sie nur die Spitze der Nadel und dringen nicht mehr alsgenug in das Gehirn, da dies zu Schäden am Hirngewebe und manifestieren wird als Blutung. </li><li> Halten Sie den Fisch und legen Sie die Spitze des Glases durch den Einschnitt Website Kapillare. </li><li> Richten Sie die Spitze des Glases in Richtung telencephalon Kapillare. Berühren Sie das Hirngewebe als dies schafft Gewebeschäden und verhindert auch, dass die Dispersion des injizierten Lösung. </li><li> Injizieren Sie die Lösung. Die Flüssigkeit verteilt sich sofort nach der Injektion. </li></ol> 5. Erholung und Analyse der Genauigkeit Injection <ol><li> Entfernen Sie den Fisch aus dem Setup-Injektion und in einen Kunststoff-Box mit frischem Fisch Wasser. </li><li> Erlauben Erholung. </li><li> Erneut betäuben die Fische mit 0,0025% MESAB kurz und überprüfen Sie den Fisch unter dem Fluoreszenzmikroskop. Eine gründliche Verteilung der roten Fluoreszenz ist ein Indiz für weite Verbreitung der eingespritzten Flüssigkeit. </li><li> Setzen Sie den Fisch zurück in die Kunststoff-Box. </li><li> Verbinden Sie den Kunststoff-Box zu ter Kreislaufsystem mit Sauerstoff der Fische und für längere Zeit aufrecht zu erhalten. </li><li> Verwenden Sie den Fisch für die gewünschten Zwecke wie Verhaltens-Analysen oder die Tiere opfern zu gewünschten Zeitpunkten nach der Injektion, um Gewebeproben für weitere Analysen (histologische Färbungen, Immunhistochemie, etc.) vorzubereiten. Die folgenden Hinweise geben Beispiele dafür, wie die erwachsenen Zebrafisch Gehirn analysieren: 9,11,17-20,24-27. Die schnellste Zeit, um einen effizienten Knockdown beobachten (mehr als 50% Aufgeld) war 12 Stunden in unseren Studien 22. </li></ol> 6. Empfohlene Scientific Bedienelemente <ol><li> Verwenden Sie einen Mismatch Morpholino Molekül, das nicht soll, jede Phänotyp als negative Kontrolle führen. Verwenden Sie entweder eine Standard-Morpholino Molekül oder speziell Design Morpholino Kontrollen für jedes Gen von Interesse. Darüber hinaus verwenden die Lösungsmittel (in diesem Fall PBS) als weitere Negativ-Kontrolle, um die unspezifische Effekte oder Toxizität des mus beurteilenatch / steuern Morpholino-Injektionen. </li><li> Verwenden PCNA Morpholinos zuvor beschriebenen 22 als positive Kontrollen. Dies bewirkt eine effiziente Morpholino Knockdown in der erwachsenen Zebrafisch Gehirn (75-95% Knockdown Effizienz innerhalb von 1 Tag nach der Injektion) 22. </li></ol>

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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li><li>Rikin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse+genetic+approach+to+test+functional+redundancy+during+embryogenesis.">A reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis.</a> J. Vis. Exp. (42), e2020 (2010).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Methode, die wir hier beschreiben, ermöglicht eine einfache und schnelle Verwaltung von Morpholinos in der erwachsenen Zebrafisch Gehirn. Wir haben gezeigt, dass unsere Injektionsverfahren schirmt Genexpression in den ventrikulären Zellen und führt zu funktionellen Konsequenzen in der Neurogenese Antwort. Es gibt wichtige Punkte, vorsichtig zu sein bei der Ausführung des cerebroventricular Mikroinjektion. Zum Beispiel hängt die Wirkung der Morpholino-Moleküle von der verwendeten Konzentration. Diese Konzentration ist durch den Endbenutzer bestimmt werden. Wir empfehlen, beginnend mit der Stammlösung (500 &amp;mgr; M) und die Durchführung serielle Verdünnungen und ideal für Pre-Test durch Injektion in Embryonen mit Standard-Embryo Injektionsprotokolle 28-30. Zuvor erhalten wir verschiedene Ebenen der Knockdown Effizienz mit Konzentrationen von Morpholinos von 50 um bis 500 um 22. Zweitens sollte die Öffnung der Glaskapillare nicht large, da dies zu umfangreiche liquide Zustrom in das Gehirn nach der Injektion führen. Ebenso muss die Öffnung nicht zu eng sein, da dies ausreichend Injektion verhindert. Man kann die optimale Öffnung Druck Kombination von Pumpen von Luft in eine Petrischale mit Wasser bestimmen. Die Blasen, die sich in einer einzigen Reihe, jedoch nicht in mehreren Reihen sein. Wir zeigen dies in dem Video. Drittens Inkubation der Fische in den Anästhetika ist kritisch. Der Fisch sollte nicht länger als 2 min in der Anästhesie gehalten werden. Dies behindert die Recovery Rate nach der Injektion. Viertens ist die Lage des Schnittes kritisch gründlich Dispergieren der injizierten Flüssigkeit. Die ventrikuläre Region im Tectum opticum größer ist oberhalb der Mittellinie und wird schmaler seitlich. Daher sollte der Experimentator erzeugen den Schlitz in den Schädel in der Nähe der Mittellinie und nur kaudal des Schädels Platte für den telencephalic Region. Einer der Vorteile des cerebroventricular injection (CVMI) Verfahrens ist seine Schnelligkeit. CVMI ist eine schnelle Methode zur Bestimmung von Genfunktionen. Diese Funktion ist wichtig und nützlich, wenn die Erzeugung von transgenen Linien für funktionelle Studien, die in der Regel mehrere Monate dauern, verglichen. Zusätzlich führt CVMI um eine gleichmäßige Verteilung der injizierten Flüssigkeit und somit ein relativ gründliche Manipulation der Genaktivität bei fokaler Injektionen oder Elektroporation verglichen. Mit CVMI können mehrere Gene gleichzeitig gedrückt werden durch Injektion vorbereiten mischt mit mehreren Morpholinos Oligonukleotid klopfte. CVMI können unterschiedliche Konzentrationen einer gegebenen Morpholino Oligonukleotiden injizieren, und kann daher zum Analysieren hypomorphen Phänotypen verwendet werden können. Schließlich ist diese Injektion Paradigma nicht zu Toxizität und beeinträchtigt das Überleben der Tiere. Die Technik könnte für CVMI andere Art von Studien wie Injektion von modulatorische Peptide, Drogen, Plasmid-DNA oder RNA modulatorische mo erweitert werdenlecules oder andere Substanzen, die die Physiologie der Zellen beeinflussen könnte. Untersuchen Kombination von Molekülen und Durchführen Dosis-Wirkungs-Analysen möglich sind wir mit unserer Methode, so dass das Studium hypomorphen Phänotypen. Mit diesen Eigenschaften erweist CVMI um eine schnelle und einfache Test zum Ausdruck Studien in der erwachsenen Zebrafisch Gehirn und eröffnet schnelles Screening und funktionelle Analysen. Die erwachsenen Zebrafisch Gehirn konstitutiv produzieren neue Nervenzellen entlang der gesamten rostrokaudalen Achse und es kann auch nach traumatischen Verletzungen regenerieren. Dies steht in krassem Gegensatz zu Säugetieren Gehirn mit begrenzten Neurogenese und wenn überhaupt, eher schlechte Regenerationsfähigkeit. Diese weit verbreitete Stammzellen Aktivität und Erholung Fähigkeit macht Zebrafische ein nützliches Modell für das Verständnis der molekularen Programme für zentrale Nervensystem die Regeneration erforderlich, die derzeit weitgehend unbekannt. Daher untersuchen die molekularen Grundlagen der regenerativen Eignung zebrafish Gehirn ist ein interessanter Bereich der Forschung, die den grundlegenden Unterschied, wie Fische und Säuger-Gehirn nach einer Verletzung zu reagieren, und auch verleihen Wege für regenerative medizinische Therapien beim Menschen erklären könnte. Um die molekularen Infrastruktur von Wirbeltieren Plastizität des Gehirns und die Regeneration zu verstehen, dienen Gliazellen als wichtiges Forschungsgebiet, da sie die neurogenen Vorläuferzellen 3,8,20 sind. Somit ist die Verwendung CVMI Technik, um Genfunktionen in der radialen Gliazellen des Gehirns verändern Zebrafisch ist in der Aufklärung instrumental wie Fisch Gehirn koppeln können Vorläuferzellen Aktivität, um eine effiziente und regenerative adulte Neurogenese Antwort. Vor kurzem haben wir das Engagement und die Anforderung von mehreren Faktoren und Signalwege in der regenerativen Neurogenese Reaktion der erwachsenen Zebrafisch Gehirn 24,26,27 gezeigt, und diese Studien wurden durch den Einsatz von CVMI Verfahren. Insgesamt könnten die Erkenntnisse, die wir aus Zebrafischgehirn gewinnen genutzt werden, um Regeneration zu verhängenrative Fähigkeit zu den Säugetieren Gliazellen, die zu Verletzungen reagieren und somit helfen, Gestaltung klinischer Therapien für menschliche neurologische Störungen und akuten Verletzungen.

Adulte Neurogenese ist ein gemeinsames Merkmal von Wirbeltieren, jedoch der Grad der Verbreitung und Effizienz variiert mit der Stammesgeschichte 1,2,3,4,5,6. Zum Beispiel enthalten adulten Gehirn Stammzellen Regionen weitgehend dem Vorderhirn 7,8 beschränkt, während die Knochenfische Zebrafisch enthält sechzehn verschiedenen Stammzell-Domänen und die damit verbundenen neurogenen Zonen in seiner gesamten Gehirn 4,5,9,10. Diese Variation zwischen Säugetieren und Zebrafisch könnte darüber nachdenken, eine Disparität in den Mechanismen der Stammzell-Wartung und der neurogenen Kapazität der Vorläuferzellen. Die lebenslange Kompetenz der Zebrafisch zu Neuronen im Gehirn könnte auch darstellen klinischen Auswirkungen wie die molekularen Mechanismen, durch Zebrafischgehirn beschäftigt für therapeutische Anwendungen genutzt werden könnte, um die neurodegenerativen Erkrankungen beim Menschen zu bekämpfen. Mehrere Stammzellen Zonen des Erwachsenen Zebrafischgehirn wurden analysiert, und es wurde gezeigt, dass dieZellen der ventrikulären Oberfläche dieser Regionen dienen als Vorläuferzellen 9,11-20. Ausführliche Analysen im Zebrafisch telencephalon zum Beispiel identifiziert die radialen Gliazellen, die die ventrikuläre Oberfläche dieser Gehirnregion abzugrenzen neurogene Vorläuferzellen 19, 20 sein. Dies gilt auch für andere Regionen wie dem Kleinhirn und dem Tectum opticum, wo ventrikulär gelegene Neuroepithelzellen die neurogene Eingang 16,21 bereitzustellen. Zu diesem Zweck, das Verständnis der molekularen Mechanismen, die die weit verbreitete neurogenen Kompetenz in der Erwachsenenbildung Zebrafischgehirn erfordert Manipulation der Genexpression in den Vorläuferzellen. Verschiedene Methoden wurden bisher für die Modulation der Genfunktion in Zebrafisch beschrieben. Hervorzuheben sind die folgenden Generation bedingten transgenen Linien, die gewünschten Varianten eines einzigen Proteins, Plasmid basierender Schwerpunkt Injektionen gekoppelt Elektroporation oder chemische Behandlungen. Wir haben vorher entwickelt einVerfahren zur Verabreichung verschiedener Substanzen einschließlich Morpholino Oligonukleotide oder Proteine ​​in der erwachsenen Zebrafisch Gehirn mit cerebroventricular Mikroinjektion als eine schnelle und effiziente Art der Modulation der Genfunktion in den ventrikulären Zellen des erwachsenen Zebrafisch Vorderhirn 22. In unseren Studien wurden vivo Morpholinos aufgrund ihrer Chemie, die die Morpholino Molekül kovalent an reich Lieferung Peptide, die effiziente Bereitstellung zu ermöglichen, die Zellen von Interesse, ohne Notwendigkeit für zusätzliche Permeabilisierung wie Elektroporation 23 Arginin. Dies würde es ermöglichen eine gründliche Targeting des gewünschten Gewebes nach der Injektion, wie, was wir in erwachsenen Zebrafisch telencephalon 22 beobachtet. Verwendung vivo Morpholinos sind daher überlegen bereits bestehenden Methoden des Tissue Targeting wie Elektroporation oder fokale Injektion von DNA-Molekülen. Hier zeigen wir, visuell, wie wir diese Operation durchzuführen und bieten einSchritt-für-Schritt-Protokoll. Wir beginnen mit Erläuterung Herstellung der Einspritzung des Gemischs und die Fische, die injiziert werden, und gehen durch den Nachweis, wie das Injektionsgerät eingerichtet ist. Wir bieten Ihnen eine Beschreibung des cerebroventricular Injektionsverfahren, das Erzeugen eines Schnittes in den Schädel und Injektion der Morpholinos mit Mikroinjektor beinhaltet. Wir haben auch über die kritischen Punkte muss man vorsichtig sein, während des gesamten Verfahrens mit der Feststellung, sie als Optimierung oder Anleitungen zur Fehlerbehebung zu erarbeiten.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Red CMTPX</td>
 <td>Life Technologies, Invitrogen</td>
 <td>C34552</td>
 <td>Use at 1:100 dilution for measuring the injection accuracy</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A5040</td>
 <td>For anesthetizing the fish</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>821,472</td>
 <td>For handling the fish during injection and imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate-buffered saline</td>
 <td>Life Technologies, GIBCO</td>
 <td>10010-056</td>
 <td>As sterile dilution medium</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vivo morpholinos</td>
 <td>Gene Tools Inc.</td>
 <td>Customized</td>
 <td>More info on vivo morpholinos: <a href="http://www.gene-tools.com" target="_blank">www.gene-tools.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Barbed-end needle</td>
 <td>Becton-Dickinson</td>
 <td>305178</td>
 <td>To generate the incision in the skull</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting microscope</td>
 <td>Olympus, Leica, Zeiss </td>
 <td>Varies with the manufacturer</td>
 <td>Part of the whole injection setup</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont Tweezers</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501985</td>
 <td>To snap off the tip of the glass capillary</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescence camera</td>
 <td>Zeiss, Nikon, Leica</td>
 <td>Varies with the manufacturer</td>
 <td>To visualize the fluorescence after injection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gillies Dissecting Forceps</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501265</td>
 <td>To hold the fish in position</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass injection capillaries</td>
 <td>World Precision Instruments </td>
 <td>TWF10 </td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PicoNozzle kit (microinjector holder)</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>5430-12</td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pneumatic PicoPump (microinjector)</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>SYS-PV820 </td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ring illuminator; Ring Light Guide</td>
 <td>Parkland Scientific</td>
 <td>ILL-RLG </td>
 <td>For illuminating the specimen</td>
 </tr>
	</tbody>
 </table>

micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides

Manipulation der Genexpression in Geweben erforderlich ist, um funktionelle Untersuchungen durchzuführen. In diesem Beitrag zeigen wir die cerebroventricular Mikroinjektion (CVMI)-Technik als Mittel zur Modulation der Genexpression in der erwachsenen Zebrafisch Gehirn. Durch die Verwendung von CVMI können Stoffe in die cerebroventricular Flüssigkeit verabreicht werden und gründlich entlang der rostrokaudalen Achse des Gehirns verteilt werden. Besonders für die Verwendung von Antisense-Morpholino-Oligonukleotide, die eine starke Werkzeuge für umzuwerfen Genexpression in vivo zu konzentrieren. Bei unserer Methode, wenn angewandt, sind Morpholino Moleküle von den Zellen der ventrikulären Oberfläche gemacht. Diese Zellen sind die radialen Gliazellen, die als neurogenen Vorläuferzellen handeln. Daher umzuwerfen Genexpression in den radialen Gliazellen ist von größter Bedeutung, um die weit verbreitete Reaktion Neurogenese im Zebrafisch zu analysieren und würde auch Einblick in Wirbeltieren könnte erwachsenen Neurogen Sustain liefernesis Antwort. Ein solches Verständnis würde auch helfen, die Bemühungen für die klinische Anwendung in der Human-und neurodegenerativen Erkrankungen des zentralen Nervensystems Regeneration. So stellen wir die cerebroventricular Mikroinjektionsverfahren als eine schnelle und effiziente Möglichkeit, die Genexpression und Neurogenese Antwort in der erwachsenen Zebrafisch Vorderhirn verändern. Wir bieten auch Tipps zur Fehlerbehebung und andere nützliche Informationen darüber, wie die Durchführung der CVMI Verfahren.

Cerebroventricular Mikroinjektion führt zu weit verbreiteten Verteilung der injizierten Lösung Mit dem Workflow-und technische Regelung des cerebroventricular Mikroinjektion in Abbildung 1 dargestellt, wir Morpholino Oligonukleotiden in die erwachsenen Zebrafisch Gehirn verabreicht. Eine genaue Injektionsprotokolls führt zu einer Streuung der eingespritzten Flüssigkeit im Gehirn und effizienten Ausrichtung der Zellen in der Nähe der ventrikulären Oberfläche (2A). Injektionen in die Glaskapillare durchbohrt das Hirngewebe haben eine dichte Fluoreszenzsignal an der Stelle der Injektion (Abb. 2B). Wenn die injizierte Menge ist nicht genug, wird schwach fluoreszierende Signal beobachtet (Abbildung 2C) werden. Cerebroventricular Mikroinjektion kann umzuwerfen Genexpression auf der ventrikulären Bereich der erwachsenen Zebrafisch Gehirn verwendet werden Wir haben gezeigt, thin vivo Morpholinos eindringen kann ein paar Zelldurchmessern innerhalb der ventrikulären Oberfläche und kann somit effizient zielen auf die ventrikuläre Zellen (3A, 3B). Morpholino Injektion kann Knockdown Genexpression, da es die Produktion des entsprechenden Proteins (ein Beispiel ist PCNA, wie in den 3C, 3D gezeigt) zu lindern. Wir haben bereits gezeigt, dass umzuwerfen Gene mit dieser Technik führt zu funktionellen Konsequenzen während der adulten Neurogenese (3E, 3F) oder Regeneration Reaktion (Abb. 3G, 3H). Wir haben gezeigt, dass die effiziente Knockdown Bereich (mehr als 50% Zuschlag) etwa 12 Stunden nach Injektion des Morpholinos 22 erreicht. Wir haben auch beobachtet, dass eine effiziente Knockdown Zeitraum bis etwa 5 Tage nach der Injektion für die PCNA Protein 22 ist. Mehr als 70% Aufgeld, wurde bis 3 Tage nach der Injektion 22 gesehen. Die Knockdown Kurven sind abhängig on das Niveau der Expression der endogenen Proteine ​​und die Effizienz der Morpholino-Moleküle, und muss für jedes Gen vom Experimentator bestimmt werden. In unseren Studien haben wir nicht sehen, dass das Verfahren CVMI das Überleben des Tieres beeinträchtigt, wahrscheinlich, weil die Verwaltung der Morpholino Moleküle ist lokal und nicht zu einer systemischen Toxizität. <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des cerebroventricular Injektionstechnik. (A) Die Injektion von dorsal des erwachsenen Zebrafisch (1) auf der Ebene der optischen tectum (ot, 2) durchgeführt wird. Ein Schnitt wird über die Optik tectal Schädel Platte mit einer 30-Gauge-Nadel (3) gemacht. Mit Glaskapillaren sind die Morpholino-Moleküle in die ventrikuläre Fluid (4) eingespritzt wird. Eine gründliche Dispersion ist einsofort (5) chieved. (B) Die Kanüle und die Widerhaken-Ende in starker Vergrößerung dargestellt. (C) Die Ausrichtung der Nadel vor dem Einschnitt. (D) Der Schnitt eingekreist und mit gestrichelten Linien dargestellt. (E) Die Injektionskapillare befindet, wie gezeigt und Einspritzung durchgeführt. Alle Platten wurden aus ref angepasst. 22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig2.jpg" /> Abbildung 2. Vergleich der Injektion Effizienz und Genauigkeit. (A) gute Injektion führt zu Ausrichtung der Zellen in der Nähe der ventrikulären Oberfläche. (B) Wenn die Glaskapillare in das Hirngewebe eingeführt wird, wird diese erzeugen ein zentral gelegenes Fluoreszenzsignal. (C </strong&gt;) Wenn die Einspritzmenge ist gering, dafür wird die schwächere Fluoreszenz-Signal führen. <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3.jpg" /> Abbildung 3. . Morpholino Penetration, die Effizienz der Gen Niederschlägen und funktionelle Konsequenzen (A) GFP Immunfärbung auf den telencephalic Querschnitte Kontrolle Tg (H2A: GFP)-Morpholino injiziert transgene Linie zeigt GFP-positive Kerne. (B) GFP Immunfärbung auf den telencephalic Querschnitte gfp Antisense Tg (H2A: GFP)-Morpholino injiziert transgene Linie zeigt GFP-positive Kerne. Man beachte den Unterschied in der GFP-Signal an der ventrikulären Region. v: Ventrikels. (C) PCNA Immunfärbung auf Kontrolle Morpholino-injizierten Gehirn zeigt weite Verbreitung von PCNA-positiven Zellen. ( <strong&gt; D) PCNA Immunfärbung auf PCNA Antisense-Morpholino-injizierten Gehirn zeigt deutlich reduzierte Mengen von PCNA-positiven Zellen, die zeigen, dass CVMI Can Knockdown endogenen Genen. (E) und BrdU HuC / D Immunfärbung auf Kontrolle Morpholino injiziert Gehirne neugeborener Neuronen nach einem BrdU Pulse-Chase-Experiment vor 22 beschrieben zu bestimmen. (F) und BrdU HuC / D Immunfärbung auf PCNA Antisense Morpholino injiziert Gehirne neugeborener Neuronen nach einem BrdU Pulse-Chase-Experiment vor 22 beschrieben zu bestimmen. (G) nach unten PCNA Klopfen führt zu einer signifikanten Verringerung der Erzeugung von neugeborenen Neuronen, die anzeigt, dass CVMI den Zuschlag endogener Gene, die Anlass zu funktionellen Folgen verwendet werden. Alle Platten wurden aus ref angepasst. 22 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> .

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Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

In diesem Artikel zeigen wir ein Verfahren zur Manipulation der Genexpression in den Zellen des ventrikulären erwachsenen Zebrafisch telencephalon Verwendung von Antisense-Morpholino-Oligonukleotide. Wir präsentieren diese Methode als eine effiziente und schnelle Protokoll, das für funktionelle Studien in der erwachsenen Gehirn von Wirbeltieren eingesetzt werden können.

Mikromanipulation der Genexpression in der Erotik-Zebrafischgehirn Mit cerebroventricular Mikroinjektion von Morpholino Oligonukleotiden

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

micromanipulation-gene-expression-adult-zebrafish-brain-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.1K Aufrufe.  Cluster of Excellence (CRTD) and Biotechnology Center (BIOTEC) of the Technische Universität Dresden. In diesem Artikel zeigen wir ein Verfahren zur Manipulation der Genexpression in den Zellen des ventrikulären erwachsenen Zebrafisch telencephalon Verwendung von Antisense-Morpholino-Oligonukleotide. Wir präsentieren diese Methode als eine effiziente und schnelle Protokoll, das für funktionelle Studien in der erwachsenen Gehirn von Wirbeltieren eingesetzt werden können.

Serie: Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Spinal Cord Elektrophysiologie II: Extrazelluläre Saugelektrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Forschung

Neurowissenschaften

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

Hochauflösende Live-Bildgebung von Zell-Verhalten in der Entwicklung von Neuroepithel

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to the display of physiological and behavioural phenotypes. Such environmental programming is likely to increase the susceptibility to metabolic, cardiovascular and mental diseases 3,4.
DNA methylation and histone modifications are considered key processes in the mediation of the gene-environment dialogue and appear also to underlay environmental programming 5. In mammals, DNA methylation typically comprises the covalent addition of a methyl group at the 5-position of cytosine within the context of CpG dinucleotides.
CpG methylation occurs in a highly tissue- and cell-specific manner making it a challenge to study discrete, small regions of the brain where cellular heterogeneity is high and tissue quantity limited. Moreover, because gene expression and methylation are closely linked events, increased value can be gained by comparing both parameters in the same sample.
Here, a step-by-step protocol (Figure 1) for the investigation of epigenetic programming in the brain is presented using the 'maternal separation' paradigm of early life adversity for illustrative purposes. The protocol describes the preparation of micropunches from differentially-aged mouse brains from which DNA and RNA can be simultaneously isolated, thus allowing DNA methylation and gene expression analyses in the same sample.

A streamlined workflow to study DNA methylation and gene expression changes upon early-life stress is shown. Starting from maternal separation of newborn mice and isolation of discrete brain tissues, we represent a protocol to simultaneously isolate DNA and RNA from brain tissue punches for subsequent bisulfite sequencing and RT-PCR analysis.

Optimierte Analyse von DNA-Methylierung und Genexpression von Klein, Anatomisch-definierte Bereiche des Gehirns

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Elektrophysiologische Aufnahme im Gehirn von erwachsenen Zebrafisch Intact

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective treatment for several movement disorders that have failed to respond to medication. Recent progress in the field of DBS surgery has begun to extend the application of this surgical technique to other conditions as diverse as morbid obesity, depression and obsessive compulsive disorder. Despite these expanding indications, little is known about the underlying physiological mechanisms that facilitate the beneficial effects of DBS surgery. One approach to this question is to perform gene expression analysis in neurons that receive the electrical stimulation. Previous studies have shown that neurogenesis in the rat dentate gyrus is elicited in DBS targeting of the anterior nucleus of the thalamus1. DBS surgery targeting the ATN is used widely for treatment refractory epilepsy. It is thus of much interest for us to explore the transcriptional changes induced by electrically stimulating the ATN. In this manuscript, we describe our methodologies for stereotactically-guided DBS surgery targeting the ATN in adult male Wistar rats. We also discuss the subsequent steps for tissue dissection, RNA isolation, cDNA preparation and quantitative RT-PCR for measuring gene expression changes. This method could be applied and modified for stimulating the basal ganglia and other regions of the brain commonly clinically targeted. The gene expression study described here assumes a candidate target gene approach for discovering molecular players that could be directing the mechanism for DBS.

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Die Analyse der Genexpression Veränderungen im Hippocampus Ratte nach Tiefenhirnstimulation des Anterior Thalamuskern

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

Modeling Amyloid-&amp;#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Modellierung von Amyloid-β42 Toxizität und Neurodegeneration bei Erwachsenen Zebrafisch-Gehirn

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene reporters. This new and easy to use in vivo fluorescence monitoring system was developed to record the transcriptional rhythm of the clock gene, Cry1, in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of freely moving mice. To do so, a Cry1 transcription fluorescence reporter was designed and packaged into Adeno-associated virus. Purified, concentrated virus was injected into the mouse SCN followed by the insertion of an optic fiber, which was then fixed onto the surface of the brain. The animals were returned to their home cages and allowed a 1-month post-operative recovery period to ensure sufficient reporter expression. Fluorescence was then recorded in freely moving mice via an in vivo monitoring system that was constructed at our institution. For the in vivo recording system, a 488 nm laser was coupled with a 1 &#215; 4 beam-splitter that divided the light into four laser excitation outputs of equal power. This setup enabled us to record from four animals simultaneously. Each of the emitted fluorescence signals was collected via a photomultiplier tube and a data acquisition card. In contrast to the previous bioluminescence in vivo circadian clock recording technique, this fluorescence in vivo recording system allowed the recording of circadian clock gene expression during the light cycle.

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

This newly developed fluorescence-based technology enables long-term monitoring of the transcription of circadian clock genes in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of freely moving mice in real-time and at a high temporal resolution.

In Vivo Überwachung der circadianen Uhr Genexpression in der Maus Suprachiasmatischen Kern mit Fluoreszenz-Reporter

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study of neuroscience as cellular function is determined by the composition and activity of cellular proteins. In this article, we describe how immunocytochemistry can be combined with near-infrared high-resolution scanning to provide a semi-quantitative measure of protein expression in distinct brain regions. This technique can be used for single or double protein expression in the same brain region. Measuring proteins in this fashion can be used to obtain a relative change in protein expression with an experimental manipulation, molecular signature of learning and memory, activity in molecular pathways, and neural activity in multiple brain regions. Using the correct proteins and statistical analysis, functional connectivity among brain regions can be determined as well. Given the ease of implementing immunocytochemistry in a laboratory, using immunocytochemistry with near-infrared high-resolution scanning can expand the ability of the neuroscientist to examine neurobiological processes at a systems level.

Here, we present a protocol that uses near-infrared dyes in conjunction with immunohistochemistry and high-resolution scanning to assay proteins in brain regions.

Einsatz von Infrarot-Fluoreszenz und hochauflösendem Scannen zur Messung des Protein-Expression im Rodentrains

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Bewertung der Langzeit-Depressionsinduktion bei erwachsenen Cerebellarscheiben

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...