Diese Arbeit wurde unterstützt ya CIRM Promotionsstipendium (EDK), NARSAD Young Investigator Award (DK) und das NIMH BRAINS Auszeichnung (R01MH087495) (DK).

Anästhesie und Analgesie: Dreißig Minuten vor der Narkose, injizieren die Ratte mit 0,05 mg / kg subkutan zur Analgesie Buprenorphin. Initiieren einer Narkose mit 30-40 mg / kg intraperitoneal Natrium-Pentobarbital. An diesem Punkt auch zu injizieren, um respiratorische Insuffizienz Atropin (0,4 mg / kg, subkutan) und Meloxicam weitere Schmerz (2 mg / kg subkutan) zu verhindern. Wenn nach 5 Minuten, ist die Ratte immer noch mobil oder als Reaktion auf Zehen und Zuziehen, geben weitere Dosen von Natrium-Pentobarbital bei 5 mg / kg (intraperitoneal), bis die Ratte ist nicht mehr auf die Schmerzen. Vor der Durchführung des ersten Schnittes injizieren Lidocain (5 mg / kg, intradermal) an der Einschnittstelle zur Lokalanästhesie. Sechs bis acht Stunden nach der ersten Injektion, injizieren die Ratte mit 0,05 mg / kg subkutan zur Analgesie Buprenorphin. Buprenorphin kann alle 6-8 Stunden danach injiziert werden, wenn nötig, auch wenn dies meist nicht erforderlich. Es ist wichtig zu beachten, dass andere Formen der Anästhesie cein mit exzitotoxische Läsionen stören. Zum Beispiel, obwohl Ketamin ist eine häufig verwendete Form der Anästhesie bei Nagetieren, kann es mit Läsionen mit NMDA-induzierte stören, weil es ein NMDA-Rezeptorantagonist ist. Es ist wichtig, ein Verfahren zum Induzieren Anästhesie, die nicht reduziert Läsionsgröße auszuwählen. Wenn Gas Anästhesie gewünscht wird, können die meisten stereotaktischen Geräten wie den hier beschriebenen unterbringen Gasmaske Adapter. Hinweis: Materialien werden in der Tabelle der Reagenzien und Ausrüstung beschrieben. 1. Vorbereitung der Pumpe und Stereotax <ol><li> Füllen Sie eine 10 ul Hamilton-Spritze mit sterilem Wasser und montieren Sie ihn in den Einkaufskorb einer Spritze 6 programmierbare Pumpe. Sichern des Endes des Spritzenkolbens in die geklemmte Halter an der Pumpe. </li><li> Prefill PE20-Schlauch mit sterilem Wasser unter Verwendung einer Nadel und 1 ml Spritze gassterilisiert. Schieben des offenen Endes des Schlauches auf der Hamilton-Spritze, wobei PflegeFUL nicht entstehen Luftblasen in dem Rohr. </li><li> Einspannen 30ga, flach geschnittenen, 1 Zoll Infusionsnadel Ende des Schlauchs an den Arm eines stereotaktischen Vorrichtung unter Verwendung eines Barrel-Stil-Elektrode Manipulators. Legen Sie die Infusionsnadel zwischen der Klemme und der gerillten Barrel. Sichern der Klammer um ein Stück des Schlauchs mit Metallnadel darin zu vermeiden Abflachen des Schlauchs und die Beschränkung Fluidströmung. </li><li> Stellen Sie die Pumpe zu Rate&gt; 5 ml / min und schalten Sie die Pumpe. Ein Wulst aus Wasser sollte an der Spitze der Infusionsnadel angezeigt. Prüfen Sie die Länge des Schlauchs und seine Gelenke, um sicherzustellen, keine Lecks vorhanden sind. </li><li> Wischen Sie das Wasser Wulst mit einem sterilen Tupfer und die Pumpe auf, sich zurückzuziehen. Ziehen Sie einen 2 ul Luftblase. Der obere Teil der Blase sichtbar sein soll in dem Schlauch. </li><li> Tauchen der Infusionsnadel Spitze in einer 20 mg / ml Lösung von NMDA in sterilem 0,1 M PBS und zurückzuziehen 4-5 ul. Eine Luftblase sichtbar sein zwischen dem sterilen Wasser und der NMDA-Lösungin der Spitze. Es ist wichtig anzumerken, dass NMDA ein starkes Nervengift ist und Vorsicht ist bei der Herstellung und Handhabung dieser Lösung verwendet werden. Handschuhe und Schutzbrille sind zu jeder Zeit beraten. </li></ol> 2. Montieren Sie die Ratte in der stereotaktischen Gerät <ol><li> Abbildung 1 zeigt die grundlegenden Teile der stereotaktischen Gerät. Nach dem Rasieren der Ratte den Kopf von der Linie der Augen zu den Ohren, laden der Ratte Frontzähne über die Biss-Bar, mit der Ratte der Körper ruht auf einem Heizkissen auf Medium gesetzt. Die Zunge sollte unter dem Stich-Bar hängen, mit dem Unterkiefer. Falls vorhanden, wäre ein Temperatur-Feedback Heizkissen vorzuziehen sein. Die Überwachung Rektaltemperatur wäre auch ideal. </li><li> Halten der Ratte Hals mit Daumen und Zeigefinger, bewegen Sie den rechten horizontalen Gehörgang auf dem rechten Ohr bar. Die Bar sollte das Gefühl, es auf eine feste Stelle ruht, nicht wie es sinkt tief in den Kopf. Halten Sie die rechte Seite der Kopf ruhig, schieben Sie den linken Ohrbar in der Ratte linken horizontalen Gehörgang. Es sollte das Gefühl, es auf einem soliden Platz ruht. Die Ohrmuscheln aussehen sollte symmetrisch und sollte angezeigt werden, zu lügen am Ohr Bars flach. Nach oben Abfackeln von Ohrmuscheln zeigt falsche Platzierung der Ohr Bars. Der Kopf sollte nicht als Reaktion auf Druck am Hals wackeln. </li><li> Schrauben Sie die Nase bar. Seien Sie sanft. Die Knochen in der Nase sind empfindlich und die Nase Bar muss nicht dicht sein. Prüfen Sie, ob die Ratte noch bevor betäubt. </li></ol> 3. Vorbereiten der Rat für Chirurgie <ol><li> Mit einem sterilen Tupfer leicht mit einer geringen Menge der veterinärmedizinischen ophthalmisches Schmiermittel Salbe in jedem der Mausaugen um sie vor dem Austrocknen und Schmutz zu schützen. </li><li> Konzentrisch von der geplanten Inzisionsstelle an den Rand des dem rasierten Bereich, wischen der Ratte Kopfhaut mit 2% Chlorhexidin-Lösung 70% Ethanol gefolgt dreimal. Chlorhexidin Peeling können ebenfalls verwendet, wenn mehr wirksame Desinfektionsmittel erwünscht ist.Beenden Sie durch Abwischen mit 10% Povidon-Iod-Lösung. Die vorbereitete Kopfhaut ist jetzt steril und sollte nur mit sterilen Materialien berührt werden. </li><li> Don sterile Handschuhe für weitere Schritte, weil Sie mit dem vorbereiteten Operationsstelle nächste wird umzugehen. </li><li> Legen Sie eine sterile Abdeckung, so dass die Fensterung der chirurgischen Stelle verfügbar macht. </li></ol> 4. Erstellen des OP-Fenster <ol><li> Mit einem Skalpell Nr. 10, einen Einschnitt (ca. 2 cm lang) entlang der Längs-Mittellinie der Kopfhaut. Der Schnitt sollte beginnen hinter der Linie der Augen. Mit dem Daumen und Zeigefinger der nicht-dominanten Hand halten die Kopfhaut in Spannung senkrecht zur Richtung des Einschnitts. </li><li> Ziehen Sie die Faszie über den Schädel Oberfläche an den Kanten der chirurgischen Stelle mit sterilen Baumwoll-Tipps. Es wird einige Kraft, um den Schädel zu löschen, damit sie angezeigt werden kann. </li><li> Verwenden Sie vier gebogenen, steril Hämostaten, um eine chirurgische Fenster zu erstellen. Clamp-Faszie (NICHT Haut) auf EAch Seite der vorderen und hinteren Aspekte des Einschnitts und dann lag die Klammern neben dem Tier aus, wodurch sie den Einschnitt offen und vollständig Aussetzen des Schädels. </li></ol> 5. Ausrichten der Schädel und Erstellen der Vorbohrung <ol><li> Suchen Bregma, der vordere Punkt, wo die drei Platten des Schädels, wie in 2 dargestellt. Bewegen Sie die Infusionsnadel so die Nadelspitze gerade berührt den Schädel an Bregma. Beachten Sie die dorsal-ventrale Koordinatensystem. Abbildung 3 zeigt, wie Koordinaten auf einer Stoelting stereotaktischen Gerät lesen können. Hinweis an dieser Stelle, sind Handschuhe nicht mehr steril und sollten nicht berührt werden sterile Operation direkt vor Ort. Hinweis: Nach Berühren des unsterilen stereotaktischen Gerät, ist der Chirurg nicht mehr steril und sollten nicht berührt werden Operationsstelle noch Teile der Einrichtung, der das Operationsfeld berühren wird. </li><li> Suchen Lambda, der hintere Punkt, wo die drei wichtigsten Platten des Schädels gerecht zu werden, als depicted in 2. Heben Sie die Infusionsnadel leicht und bewegen Sie ihn sofort wieder auf Lambda. Senken Sie die Nadel bis sie berührt nur den Schädel bei Lambda. Lesen Sie die dorsal-ventrale Koordinatensystem. Wenn der Schädel ist flach, wird sie innerhalb von 0,1 mm des Bregma Lektüre sein. Wenn es weiter geht als das ist, bewegen Sie die Nadel nach oben (aus dem Weg), lösen Sie die Nase bar, entweder anheben oder absenken Beißwulst Plattform, je nachdem, welches Ende des Kopfes ist zu hoch, und dann noch einmal nachgemessen werden. </li><li> Bewegen Sie die Infusionsnadel über Bregma und notieren Sie die anterior-posterior und medial-lateralen Koordinaten. Berechnen, wo die Nadel basierend auf den Koordinaten des Gehirns Bereich von Interesse gemäß einer Hirnatlas 12 bewegt werden muss. Für die BLA, subtrahieren 2,8 mm von der Vorwärts-Rückwärts-Koordinate und entweder addieren oder subtrahieren 5,1 mm nach / von der medial-lateralen Koordinate je nachdem, ob Sie wünschen, um die nach links oder rechts zielen. Bewegen der Infusionsnadel in die berechnete Position. </li><li> Schwenken Sie die needle aus dem Weg, wobei darauf zu verfolgen, wo es sich befand halten und dann ein Loch bohren, ca. 2 mm Durchmesser an dieser Stelle mit einem Dremel Moto-Tool mit einer sterilen zahnärztlichen Bohrer befestigt. Bohren Sie sorgfältig, wie wenn der Bohrer die Schädeldecke durchstößt, wird er dazu neigen, nach unten ziehen, möglicherweise eine Beschädigung der Dura und Hirngewebe darunter. Nachreiben Loch, um es zu vergrößern. </li><li> Sie nehmen selbst Blut mit einem sterilen Wattestäbchen. </li></ol> 6. Die Infusion von Neurotoxin <ol><li> Schwenken Sie die Nadel wieder in Position. Senken Sie die Nadel bis sie die Oberfläche des Gehirns berührt. Notieren Sie sich die dorsal-ventrale Koordinatensystem. Dies ist die Ebene von Dura. Subtrahieren Sie den entsprechenden Wert, um das Gehirn Region von Interesse zu erreichen. Für den basolateralen Amygdala, subtrahieren 6,7 mm. </li><li> Senken Sie die Infusionsnadel auf die berechnete Niveau langsam. Dann heben sie wieder auf, deutlich über dem Schädel. Verwenden Sie eine Hamilton-Spritze Reinigung Draht an die Spitze der Infusionsnadel unclog, ohne sie zu tSchmerzempfinden das Ende des Drahtes, der in Kontakt mit der Infusionsnadel mit nicht-sterile Handschuhe kommt. </li><li> Führen Sie die Pumpe bei&gt; 5 ml / min und stellen Sie sicher, Sie sehen einen Wulst von Flüssigkeit aus der Infusionsnadel kommen. Wenn nicht, mit dem Draht befreien und erneut versuchen. </li><li> Senken Sie die Infusionsnadel in die gewünschte dorsal / ventral Niveau langsam. </li><li> Stellen Sie die Geschwindigkeit auf der Infusionspumpe bis 0,1 ml / min und starten Sie die Infusion. Die Infusion für 2 min. </li><li> Sobald die Infusion gestartet wurde, markieren die beiden Enden der Luftblase im Schlauch mit einem schwarzen Marker. Wenn beide Enden nicht bewegen, wird die Nadel verstopft. Stoppen Sie die Infusion, heben Sie die Nadel, unclog mit dem Draht, für den Durchfluss mit einem hohen Durchsatz zu überprüfen, neu zu senken und die Nadel erneut versuchen. </li><li> Sobald die Infusion beendet ist, stoppen Sie die Pumpe ein und warten 5 Minuten für den NMDA-zu diffundieren weg von der Nadelspitze. </li><li> Heben Sie die Nadel 0,5 mm, und ziehen erneut für 1 min. Warten 2,5 min für den NMDA-zu diffundieren von der Nadelspitze. Diese zusätzliche Infusion erLPS sicherzustellen, dass alle von der BLA durch die Infusion abgedeckt wird. Ob dies für die anderen Hirnregionen müssen experimentell bestimmt. </li><li> Heben Sie die Nadel aus dem Gehirn langsam und schwingen Sie den stereotaktischen Arm aus dem Weg. </li></ol> 7. Das Schließen der Inzision <ol><li> Don neue sterile Handschuhe, um den Schnitt zu schließen. </li><li> Wischen Sie überschüssiges Blut auf dem Schädel mit steriler Baumwolle-Tipps und entfernen Sie die Klemmen von der Faszie. </li><li> Mit Hilfe einer Pinzette London, drücken Sie die beiden Seiten des Schnittes zusammen. Die inneren Ränder der Haut erfüllen sollten und die Außenkante der Haut sollten nicht gestattet, in den Einschnitt rollen werden. Halten Sie den Einschnitt geschlossen, gelten Wundklammern, um den Vorsprung fest zu schließen. Fortfahren, um die Haut zusammen und heften sich entlang der Länge des Einschnitts zu drücken. Dies dauert normalerweise 3-5 Wundklammern. </li><li> Nach dem Platzieren alle Wundklammern, verwenden Sie die Zange, um die Klammern wieder kneifen, so dass sie sicher sind. Je sicherer ter Clips, desto weniger wahrscheinlich eine Ratte ziehen Sie sie heraus, bevor der Schnitt verheilt ist. </li><li> Swab der geheftete Schnitt mit 10% Povidon-Jod-Lösung und gibt die Ratte auf seinem eigenen Käfig und Monitor, bis die Mobilität wieder hergestellt ist (in der Regel 1-2 Stunden nach der Anästhesie, Chirurgie insgesamt Induktion von Zeit zu Schließung als 30-45 min). An diesem Punkt kann die Ratte in die Kolonie Raum wieder zugeführt werden. Nach einer Woche entfernen Heftklammern mit einer Heftklammer-Entferner Tool unter Isofluran-Narkose. </li><li> Verwenden Sie eine heiße Perle Sterilisator, um die Spitze Oberflächen aller Instrumente vor Gebrauch auf der nächsten Ratte zu sterilisieren. Die Instrumente sollten in den Perlen für nicht länger als 15 Sekunden getaucht werden, oder sie können zu heiß werden zu handhaben. Die Instrumente sollten vollständig abgekühlt sein, bevor an einem anderen Tier verwendet. </li></ol> 8. Erholung <ol><li> Es ist möglich, dass Ratten wird epileptischer Aktivität in den Tagen nach der Läsion zeigen. Je nach Hirnregion beschädigt, andere Verhaltensweisen wie Nahrungsaufnahme oder GROoming können betroffen sein. Es ist wichtig, dass die Tiere auf einer täglichen Basis, um sicherzustellen, dass sie gesund bleiben während der Wiederherstellung überwacht werden. Unterstützende Maßnahmen, wie flüssige Nahrung, kalorienreiche Nahrung oder zusätzliche Analgesie erforderlich sein kann. Die Mortalität durch Anästhesie tritt in einem kleinen Anteil von Ratten, in der Regel weniger als 5%. Die Sterblichkeit durch andere Ursachen (Infektionen, Blutungen) ist extrem selten. Jegliche Anzeichen von Leiden nach der Wiederherstellung der Anästhesie kann für den Ausschluss von zukünftigen Studien werden dazu führen, sind aber extrem selten. Abbildung 4 zeigt den Gewichtsverlust während der ersten Tage nach der Operation, wie es zu erwarten wäre. Das Körpergewicht sollte innerhalb von 1 Woche erholen. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse Eine Woche oder länger nach NMDA-Infusion kann die Läsion wird über einen Kresyl-violett Gegenfärbung und Hellfeldmikroskopie. Gehirne sollte mit eiskaltem 4% Paraformaldehyd, äquilibriert in 30% Saccharose in 0,1 M PBS und gefr perfundiert werdenen. Sie sind dann bei 30-60 um geschnitten zu werden, in einer Reihe von 1:6 bis 1:12 und montiert auf mit Gelatine beschichteten Objektträger bevor sie einer Standard-Cresylviolett Gegenfärbung. Die Läsion sollte zu einer &quot;Glatze&quot; oder einer Fläche von verringerten Kresylviolett Fleck aufgrund Zelltod nach Läsion entsprechen. 5A und B zeigen einen repräsentativen Läsion des BLA und CEA. Dieses Bild wurde mit einem Flachbettscanner mit einer hochauflösenden Scan (1200 dpi). Um die Läsion zu visualisieren, hilft es, eine Reihe von Schnitten durch einen Großteil der Gewebe rund um das Zielgebiet so ein verlegter Läsion gefunden werden kann Gegenfärbung. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig1.jpg" /> Abbildung 1. Stereotaktische Setup. Diese Abbildung zeigt die Ratte mit stereotaktischen relevanten Teile beschriftet. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig2.jpg" /> Abbildung 2. Bregma und Lambda an der Ratte skull. Diese Abbildung zeigt die Standorte der Bregma und Lambda. Alle Koordinaten werden relativ zum Bregma gemessen. Lambda wird verwendet, um sicherzustellen, daß der Schädel Pegel ist. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig3.jpg" /> Abbildung 3. Lesen stereotaktischen Koordinaten. Diese Zeichnung zeigt einen Standard-stereotaktischen Lesen. Um die Ziffern nach links von der Dezimalstelle zu erhalten, verwenden Sie die Markierungen auf der rechten Seite. Die markierte Stelle entspricht der Zehnerstelle (dh 1 = 10, 2 = 20). Die Striche zwischen den markierten Stellen auf die einzelnen Einheiten (1-9) entsprechen. Die Null-Linie zeigt an, was die ganze stereotax eingestellt ist. Hier ist die Null-Linie zwischen dem Marker 10 und 11, was anzeigt, dass der Messwert zwischen 10 und 11 ist. Um die Zahlen auf der rechten Seite von der Dezimalstelle zu bestimmen, verwenden Sie die Markierungen auf der linken Seite. Die Striche auf der linken Seite werden von 0 bis 10 nummeriert, wobei jede unmarkierte Hash repräsentiert eine Einheit Unterschied ausdiejenigen daneben. Unabhängig von der Hash-Markierungen auf der linken Linien bis am besten mit den Hash-Zeichen auf der rechten Seite zeigt die erste Dezimalstelle des Koordinatensystems Lesen. Hier wird der Hash-Symbol auf der linken Seite entsprechend Nummer 9 Zeilen am besten mit der rechten Seite Hash-Zeichen, so dass die Dezimalstelle ist 9. Die abschließende Lesung ist 10,9 mm. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig4.jpg" /> Abbildung 4. Gewichtsveränderung nach der Operation. Diese Grafik zeigt die durchschnittliche (± SEM) Gewicht der Ratten, die stereotaktische Operation unterzogen (n = 17) oder hatten keine Operation (n = 6). Tag 0 ist der Tag der Operation. Nach der Operation wird das Gewicht der Ratten für 2-3 Tage nach der Operation verringert und dann erhöht um Tag 5-6. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig5.jpg" /> Abbildung 5. Exzitotoxische Läsion Beispiel. A) Dieses Bild zeigt ein Kresylviolett auf einem 30 pm koronare Schicht Gegenfärbung mit der &quot;Glatzespot &quot;von NMDA-Läsion der basolateralen Amygdala. Die weißen Pfeile skizzieren die Läsion. Es auf der kontralateralen Seite des Gehirns Scheibe, die keine Läsion. B) Eine ähnliche Läsion des zentralen Kern der Amygdala hat verglichen werden kann.

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	<li>Kirby, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basolateral+amygdala+regulation+of+adult+hippocampal+neurogenesis+and+fear-related+activation+of+newborn+neurons.">Basolateral amygdala regulation of adult hippocampal neurogenesis and fear-related activation of newborn neurons.</a> Mol. Psychiatry. , (2011).</li><li>Goosens, K. A., Maren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contextual+and+auditory+fear+conditioning+are+mediated+by+the+lateral,+basal,+and+central+amygdaloid+nuclei+in+rats.">Contextual and auditory fear conditioning are mediated by the lateral, basal, and central amygdaloid nuclei in rats.</a> Learn Mem. 8, 148-155 (2001).</li><li>Korz, V., Frey, J. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die stereotaktische hier vorgestellte Methode ermöglicht exzitotoxische Läsion von bestimmten Hirnarealen durch Infusion von NMDA. Die grundlegenden stereotaktischen Verfahren können adaptiert werden, um eine Vielzahl von pharmakologischen und biologischer Agenzien in einer ortsspezifischen Weise durchdringen werden. Es kann auch dazu ausgelegt, eine Vielzahl von Bereichen des Gehirns, die durch ihre Koordinaten in einem stereotaktischen Hirnatlas 12 definiert abzuzielen. Eine Anpassung an andere Arten, wi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> N-Methyl-D-Asparaginsäure 98% </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC32919-0500 </td><td></td></tr><tr><td> Dual-Lab Standard Stereotaktische W/45 deg. Ohr-Bars </td><td> Stoelting </td><td> 51653 </td><td> Alternative Anbieter: Kopf * Anmerkung zur Vorsicht: die Kompatibilität der stereotaktischen Zubehör, wenn Kauf von mehreren Anbietern </td></tr><tr><td> 10 &amp;mgr; SYR SPECIAL (* / * / *) </td><td> Hamilton </td><td> 701SN </td><td></td></tr><tr><td> Dremel Moto-Tool </td><td> Stoelting </td><td> 58600 </td><td> Alternative Anbieter: Köpf </td></tr><tr><td> Hartmetallbohrer, Handstück HP, Größe 2 </td><td> Schein Dental </td><td> 2284578 </td><td></td></tr><tr><td> Stoelting 6 Spritze Programmbaren Pump </td><td> Stoelting </td><td> 53140 </td><td> Alternative Anbieter: Köpf </td></tr><tr><td> Edelstahl 316 Hypodermic Regelmäßige Wand Tubing 30 Gauge 0,0123 &quot;AD x 0,00625&quot; ID x .003 &quot;Wall (Infusionsnadel) </td><td> Kleinteile </td><td> HTXX-30R-06-05 </td><td></td></tr><tr><td> Intramedic PE 20-Schlauch (Infusionsset) </td><td> VWR </td><td> 63019-025 </td><td></td></tr><tr><td> Reflex Clips, 9mm, nicht steril </td><td> Kent Scientific Corp </td><td> INS500346 </td><td> Alternative Anbieter: Fine Science Tools </td></tr><tr><td> Reflex Clip-Applikator für 9mm Clips </td><td> Kent Scientific Corp </td><td> 12031-09 </td><td> Alternative Anbieter: Fine Science Tools </td></tr><tr><td> Gebogene Hartman Gefäßklemme </td><td> Fine Science Tools </td><td> 13003-10 </td><td></td></tr><tr><td> London Zange </td><td> Feine Werkzeuge Sceince </td><td> 11080-02 </td><td></td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> 2% Chlorhexidin-Lösung </td><td> Allivet </td><td> 30159 </td><td> Alternative Anbieter: PetSolutions </td></tr><tr><td> 10% Povidon-Jod-Lösung </td><td> CVS </td><td> SKU # 739575 </td><td></td></tr><tr><td> Hot Wulst Sterilisator </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 610183 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte.

stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat

Viele Verhaltensfunktion bei Säugern, einschließlich Nagern und Menschen, werden hauptsächlich von diskreten Hirnregionen vermittelt. Eine gängige Methode für anspruchsvolle Funktion der verschiedenen Hirnregionen für das Verhalten oder anderen experimentellen Ergebnissen ist, um eine lokalisierte Ablation von Funktion zu implementieren. Beim Menschen werden Patientenpopulationen mit lokalisierten Hirnläsionen oft für Defizite studiert, in der Hoffnung auf die darunterliegende Funktion der beschädigten Stelle. Bei Nagetieren, kann man experimentell induzieren Läsionen bestimmter Hirnregionen. Läsion kann auf verschiedene Arten erreicht werden. Elektrolytische Läsionen können lokale Schäden, sondern eine Vielzahl von Zelltypen sowie durchqueren Fasern aus anderen Hirnregionen, die in der Nähe der Läsion zufällig beschädigen. Induzierbarer genetischer Techniken unter Verwendung von Zelltyp-spezifische Promotoren können auch ermöglichen gezieltes Targeting. Diese Techniken sind komplex und nicht immer praktisch abhängig von dem Ziel Hirnregion. Excitotoxischen Läsion mit stereotaktischen Chirurgie hingegen ist einer der zuverlässigsten und praktischen Methoden der Läsion exzitatorischen Neuronen ohne Beschädigung lokalen Gliazellen oder durchqueren Fasern. Hier stellen wir ein Protokoll für stereotaktische Infusion der Excitotoxin, N-Methyl-D-Aspartat (NMDA), in der basolateralen Amygdala komplex. Mit anatomischen Indikation, wenden wir stereotaktischen Koordinaten, um die Position der Ziel-Hirn-Region zu bestimmen und zu senken einer Injektionsnadel an Ort und Stelle direkt über dem Ziel. Wir haben dann erfüllt unsere Excitotoxin in das Gehirn, was zu exzitotoxische Tod von Neuronen in der Nähe. Während unsere Versuchsperson der Wahl ist eine Ratte, können die gleichen Methoden zu anderen Säugetieren angewandt werden, mit den entsprechenden Einstellungen in Einrichtungen und Koordinaten. Dieses Verfahren kann auf einer Vielzahl von Hirnregionen verwendet werden, einschließlich der basolateralen Amygdala 1-6, anderen Amygdala Kerne 6, 7, Hippocampus 8, entorhinal Cortex 9 und 10 präfrontalen Kortex. Es kann auch verwendet werden, um biologische Verbindungen, wie virale Vektoren 1, 11 infundieren werden. Die grundlegende stereotaktischen Technik könnte auch für die Implantation von mehr permanente osmotische Pumpen angepasst werden, so dass mehr längerer Exposition zu einer Verbindung von Interesse.

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Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Gezielte Abtragung von spezifischen Hirnregionen (en) durch Infusion unter Verwendung eines stereotaktischen Koordinaten Excitotoxin beschrieben. Diese Technik könnte auch für die Infusion von anderen Chemikalien in dem Gehirn der Ratte angepasst werden.

Stereotaktischen Chirurgie für Exzitotoxische Läsion Spezifische Hirnareale in der erwachsenen Ratte

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

stereotaxic-surgery-for-excitotoxic-lesion-specific-brain-areas-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

35.2K Aufrufe.  University of California Berkeley. Gezielte Abtragung von spezifischen Hirnregionen (en) durch Infusion unter Verwendung eines stereotaktischen Koordinaten Excitotoxin beschrieben. Diese Technik könnte auch für die Infusion von anderen Chemikalien in dem Gehirn der Ratte angepasst werden.

Serie: Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to investigate the effects of locally manipulated neurotransmitter and signaling pathways in awake, behaving animals. Moreover, the stereotaxic implantation of electrodes for electrophysiological stimulation and recording studies has been instrumental to our current understanding of neuroplasticity and brain networks in behaving animals. Ever-increasing knowledge about optimizing surgical techniques in rodents1-4, public awareness concerning animal welfare issues and stringent legislation (e.g., the 2010 European Union Directive on the use of laboratory animals5) prompted us to refine these surgical procedures, particularly with respect to implementing new procedures for oxygen supplementation and the continuous monitoring of blood oxygenation and heart rate levels during the surgery as well as introducing a standardized protocol for post-surgical care. Our observations indicate that these modifications resulted in an increased survival rate and an improvement in the general condition of the animals after surgery (e.g. less weight loss and a more active animal). This video presentation will show the general procedures involved in this type of stereotaxic surgery with special attention to our several modifications. We will illustrate these surgical procedures in rats, but it is also possible to perform this type of surgery in mice or other small laboratory animals by using special adaptors for the stereotaxic apparatus6.

Stereotaxic surgery on rodents allows for targeted administration of drugs or electrical stimulation and recordings in awake, behaving animals. In this video presentation we will demonstrate recent procedural refinements to this long-standing procedure that successfully improved survival rate and reduced post-surgical weight loss.

Rodent stereotaktischen Chirurgie und Tierschutz Outcome Verbesserungen für Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

Forschung

Neurowissenschaften

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Erweiterung der embryonalen und adulten neuralen Stammzellen<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation oder Viral stereotaktische Injektion

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Mikromanipulation der Genexpression in der Erotik-Zebrafischgehirn Mit cerebroventricular Mikroinjektion von Morpholino Oligonukleotiden

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Hirnschnitt Biotinylierung: Eine<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Region spezifische Plasma Membrane Protein Handel Erwachsene Neuronen messen

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Stereotaktische Infusion von oligomeren Amyloid-beta in die Maus-Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

Stereotaktischen Chirurgie für Genmanipulation in Striatale Zellen des Neugeborenen Mäusegehirnen

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injektionen für optogenetische Stimulation von Long-Range-Eingängen in Maus Gehirn Scheiben

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Bewertung der Langzeit-Depressionsinduktion bei erwachsenen Cerebellarscheiben

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Stereotaxic Surgery for Implantation of Microelectrode Arrays in the Common Marmoset (Callithrix jacchus)

Marmosets (Callithrix jacchus) are small non-human primates that are gaining popularity in biomedical and preclinical research, including the neurosciences. Phylogenetically, these animals are much closer to humans than rodents. They also display complex behaviors, including a wide range of vocalizations and social interactions. Here, an effective stereotaxic neurosurgical procedure for implantation of recording electrode arrays in the common marmoset is described. This protocol also details the pre- and postoperative steps of animal care that are required to successfully perform such a surgery. Finally, this protocol shows an example of local field potential and spike activity recordings in a freely behaving marmoset 1 week after the surgical procedure. Overall, this method provides an opportunity to study the brain function in awake and freely behaving marmosets. The same protocol can be readily used by researchers working with other small primates. In addition, it can be easily modified to allow other studies requiring implants, such as stimulating electrodes, microinjections, implantation of optrodes or guide cannulas, or ablation of discrete tissue regions.

Stereotaxic Surgery for Implantation of Microelectrode Arrays in the Common Marmoset Callithrix jacchus

This work presents a protocol to perform a stereotaxic, neurosurgical implantation of&#160;microelectrode arrays in the common marmoset. This method specifically enables electrophysiological recordings in freely behaving animals but can be easily adapted to any other similar neurosurgical intervention in this species (e.g., cannula for drug administration or electrodes for brain stimulation).