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HINWEIS: Ethik Hinweise: Alle Verfahren in diesem Manuskript beschrieben werden, werden in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien für Tierforschung (Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren) und werden von der Harvard Medical School IACUC Ausschuss genehmigt. 1. Präoperative Vorbereitung <ol><li> Stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Instrumente werden entweder durch Autoklavieren oder durch Reinigung mit einer antiseptischen Lösung und / oder Ethanol bei Bedarf sterilisiert. Verwenden Sie möglichst sterile Einweg-Geräte wie Skalpelle, Nadel und Spritzen. </li><li> Decken Sie die Werkbank mit OP-Abdeckungen und stellen Sie sicher, dass es ein Biohazard Entsorgung zur Verfügung. </li><li> Wiegen Sie die Ratte und berechnen Anästhesie Dosis. Verwenden Sie einen Ketamin / Xylazin-Mix (Ketamin 75 mg / kg und Xylazin 10 mg / kg), um die Ratten zu betäuben. HINWEIS: 200-250 g ist das optimale Gewicht für eine ordnungsgemäße Befestigung des Tieres in der stereotaktischen Rahmens als auch für eine genaue Ausrichtung der ATN. Isoflurane kann auch als die betäubende Mittel verwendet werden. </li><li> Aufziehen und sichern zwei sterilen Elektroden am Elektrodenhalter (durch Autoklavieren oder mit Ethylenoxid sterilisiert) (Abbildung 2) einer stereotaktischen Operations Rahmen und mit Hilfe eines Mikroskops (10-40x Vergrößerung), überprüfen Sie die Spitzen der Elektrode für die ordnungsgemäße Ausrichtung. Befestigen Sie die beiden Elektroden 3,0 mm. HINWEIS: Achten Sie darauf, um eine Beschädigung der Elektrodenspitze durch Berühren auf harten Oberflächen. </li></ol> 2. DBS Chirurgie <ol><li> Injizieren Sie die Ketamin / Xylazin mischen intraperitoneal an das Tier, und bestätigen, dass das Tier eine chirurgische Ebene der Narkose erreicht (indem Sie für die Zehen Prise Reflex, Atemfrequenz und -tiefe und Ordnungsmäßigkeit der Atmung). Entfernen Sie Haare aus dem Bereich der Kopfhaut, die eingeschnitten wird und desinfizieren Sie die Kopfhaut mit 3 Wechsel Peelings jedem Betadin und entweder Alkohol oder steriler Kochsalzlösung. Sichern Sie und positionieren Sie das Tier auf der stereotaktischen frame. </li><li> Verwenden zirkulierenden Warmwasserpolster auf Körpertemperatur des Tieres auf einem optimalen Niveau zu halten. Bewerben Auge Schmiermittel die Augen des Tieres, um vor dem Austrocknen zu schützen. </li><li> Verwenden Sie die folgenden stereotaktischen Koordinaten für die Ausrichtung der ATN (Anterior Thalamuskern): anterioposterior -1,6 mm, mediolateral 1,5 mm und 5,2 mm dorsoventrale 1. HINWEIS: Die stereotaktischen Koordinaten werden auf der Paxinos und Watson (6. Auflage) Rattenhirnatlas 36 basiert. </li><li> Einen Einschnitt in der Kopfhaut sagittal, um den Schädel zu offenbaren. Mit ein Paar von Wundhaken sichern die Kopfhaut eingeschnitten, um den Schädel freizulegen. Verwenden steriler Kochsalzlösung, um den Einschnitt zu spülen. Wenn Einschnitt zu nass, sterile Wattestäbchen trocknen. Suchen Sie die Bregma und markieren Sie mit einem schwarzen Marker. Um die Lage der Bohrlöcher von der Pfeilnaht und 1,6 mm hinter dem coron führen, stellen zwei weitere Marken auf etwa 1,5 mm mediolateral auf beiden Seitenal Naht. </li><li> Verwenden Sie eine Handbohrmaschine, um die Bohrlöcher zu machen. Achten Sie darauf, die Spitze des Bohrloch ist steril durch Sterilisieren mit Ethanol. Halten Sie den Bohrer bei etwa einem Winkel von 45 ° zu der Schädeloberfläche beim Bohren. Häufig zwischen den beiden Bohrlöchern übermäßigen Wärme an der Stelle jedes Bohrloch zu vermeiden. </li><li> Weiter Bohren bis die Dura freigelegt wird. Mit einer Nadel mit der Spitze gebogen ähnelt die Form eines &quot;L&quot;, entfernen Sie alle Bruchstücke des Knochens, die das Einführen der Elektrode behindern würde. Achten Sie darauf, um eine Beschädigung der darunter liegenden Dura und / oder Hirngewebe beim Entfernen von Knochenfragmenten mit dem verbogenen Nadel. HINWEIS: Mit einem stumpfen Nadel oder feinem stumpfen Pinzette ist auch eine Option. </li><li> Fixieren den Dual-Elektroden-Anordnung an der Drehgriff des stereotaktischen Rahmen und fixieren den Griff in einem 90 ° -Winkel. Mit den Einstellungen in der stereotaktischen Rahmen, positionieren Sie den linken Elektrode genau über dem Bregma. </li><li> Mit dem Stereo-Taktik Anpassungen mediolateral Positionierung genau der linken Elektrode bewegen 1,5 mm an der linken Seite von Bregma, dass jetzt gibt es zwei Elektroden entlang der Kranznaht perfekt ausgerichtet, aber mit Abstand von 1,5 mm vom Bregma mediolateral. </li><li> Mit den anterioposterior stereotaktische Anpassungen, bewegen die Elektroden 1,6 mm hinter der Kranznaht. </li><li> Verwenden Sie die dorsoventrale Anpassungen, die Elektroden auf ersten Scheck zu senken, wenn die Bohrlöcher haben an der richtigen Stelle, so dass die Elektroden mit Leichtigkeit eingeführt werden gemacht, ohne sie zu berühren die Ecken und Kanten der Bohrlöcher. Wenn dem so ist, legen die Elektroden bis zu einer Tiefe von 5,2 mm von der Oberfläche des Schädels. </li><li> Die Elektroden über Leitungen an einen Stimulator bei 130 Hz, 2,5 V und 90 &amp; mgr; s Pulsbreite 1. </li><li> Liefern Hochfrequenz-Stimulation für eine Stunde (oder für eine gewünschte Zeitdauer nach Versuchsaufbau). Im Verlauf der Stimulation, vergessen Sie p versichernroper Anästhesietiefe regelmäßig durch Prüfen des MKSV Rückzug in Reaktion auf eine Zehe kneifen. Ergänzen Anästhesie mit etwa der Hälfte der Initialdosis zur Narkoseeinleitung. Vermeiden Sie die Kontamination des sterilen Handschuhen bei der Überprüfung der Narkosetiefe und bei Bedarf ändern. Führen Sie ein- oder beidseitige Stimulation auf der Grundlage eines experimentellen Anforderungen. Fügen Sie Steuerelemente wie Niederfrequenzstimulation (für z. B. 10 Hz) und nicht-stimulierten Tieren (Einfügen von Elektroden ohne nachfolgende Stimulation). </li><li> Nach Stimulation abgeschlossen ist, entfernen Sie die Elektroden vorsichtig und Naht der Schnitt mit 3-0 Nähten oder mit sterilen chirurgischen Klammern. </li><li> Verabreichen Buprenorphin (0,05 mg / kg) subkutan als Analgesie. Überwachen Sie das Tier, bis es zur normalen Aktivität zurück und dann wieder in das Gehäuse Anlage. </li><li> Nach einem festgelegten Zeitraum auf der Grundlage der experimentellen Gestaltung (zum Beispiel 0, 3, 6 oder 12 Stunden nach der Operation DBS), Einschläfern das Tier mit Narkosedosis. Nach der Bestätigung der Abwesenheit von Vitalfunktionen, enthaupten das Tier. </li><li> Präparieren Sie das Gehirn, indem Sie zuerst die Haut mit einer Schere entfernen. Durch den Knochen entlang der Pfeilnaht mit Dissektion Schere geschnitten. Machen Sie zwei weitere Einschnitte (etwa einen Zentimeter pro Stück) durch den Knochen auf beiden Längsseiten. Mit einer Pinzette, heben Sie den teilweise abgetrennten Knochenstück aus der Oberseite des Schädels, das Gehirn zu schützen. </li><li> Mit einer feinen Schere oder Zange, entfernen das Gehirn aus dem Schädel und übertragen in eine Petrischale mit kaltem PBS auf Eis. HINWEIS: Achten Sie darauf, um eine Beschädigung des Gehirns zu vermeiden und gleichzeitig die Einschnitte durch den Knochen. </li></ol> 3. Hippocampus Isolation HINWEIS: Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in diesem Abschnitt auf Eis. <ol><li> Stellen Sie das Gehirn auf eine vorgekühlte Acrylgehirnmatrix auf Eis. Mit einer Rasierklinge, schneiden Sie das Gehirn koronal mit etwa 7-8 mm von der vorderen äußersten edge des Gehirns. Einen zweiten Schnitt koronal und hinter dem ersten Schnitt, so dass eine etwa 5 mm dicke Gehirnschnitt entfernt werden könnte. </li><li> Übertragen Sie die Hirnschnitt in eine Petrischale mit eiskaltem PBS. Mit Rasierklinge, trennen die beiden halbkugelförmigen Abschnitte und kümmern uns um festzustellen, welche Hemisphäre zu den linken und rechten Seite jeweils entspricht. Dies ist besonders wichtig bei der Ausführung einseitige Stimulationen. </li><li> Mit einer feinen Pinzette und Schere entfernen Hippocampus sorgfältig. </li><li> Flash-frieren die Hippocampus-Gewebe auf Trockeneis und lagern in -20 ° C Gefrierschrank bis bereit für die nachfolgenden RNA-Extraktionsschritte. HINWEIS: Für die Langzeitlagerung ist es ratsam, um Gewebe in einem -80ºC Gefriergerät. </li></ol> 4. RNA-Extraktion und quantitative PCR <ol><li> Stellen Sie sicher, das Gewebe bleibt auf Trockeneis eingefroren, bis sie zur Homogenisierung. </li><li> HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt in der Kapuze. <ol><li> 1 ml Tri-Reagenz zu Hippocampal Gewebe in einem 1,5 ml Zentrifugenröhrchen geben und homogenisieren, indem es zunächst Pipettieren mehrmals, bis das Gewebe in kleinere Stücke gebrochen. Weitere Homogenisierung des Gewebes durch Durchleiten durch eine Spritze mit einer 25 G-Nadel, bis es keine ununterbrochene Gewebe sichtbar. Führen Sie die Schritte der Homogenisierung auf Eis. </li><li> Nach Homogenisieren des Gewebes, damit die Zellsuspension bei Raumtemperatur für 5 Minuten stehen, um die Zelllyse zu ermöglichen. HINWEIS: Nach dieser Stelle die Zellsuspension kann schnell sein, eingefroren und in -70 ° C bis zur weiteren Verarbeitung gespeichert. </li></ol></li><li> 0,2 ml Chloroform und mischen durch Vortexen für 20 Sekunden und lassen Sie die Lösung Rest bei Raumtemperatur für 15 min. </li><li> Zentrifugiere die Proben bei 12.000 g 15 min bei 4 ° C. Nach dem Zentrifugieren vorsichtig die Schläuche ohne die drei getrennten Schichten, die sichtbar sein wird stören. HINWEIS: Die unten (rot) Phase enthält Proteine, Mitte bewölkt Phase enthält DNA und die obere klare Phase enthält RN / A. </li><li> Übertragen Sie die obere klare Phase (RNA) in ein frisches 1,5 ml Zentrifugenröhrchen (typischerweise 500 ul des RNA-Phase, die erhalten wird). Um dies zu 0,5 ml Isopropanol und durch Vortexen mischen. Dazu gibt man 2-3 ul Glycogen (20 mg / ml) als Träger für die RNA. Die Probe wird auf dem Tisch bei Raumtemperatur für 10 Minuten ruhen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe bei 12.000 · g für 1 Stunde bei 4 ° C. Sicherstellen, dass das RNA-Pellet an der Unterseite des Rohres sichtbar sind. </li><li> Überstand verwerfen und waschen Sie die RNA-Pellet durch Zugabe von 1 ml 75% Ethanol (hergestellt mit Nuclease freies Wasser). Kehren Sie die Probe mehrmals, bis das Pellet verdrängt aus dem Boden der Röhre und schwimmt in der Lösung. Zentrifugieren der Lösung bei 12.000 g für 10 Minuten bei 4 ° C. HINWEIS: Die Pellet in 75% Ethanol bei -20 ° C bis zur weiteren Schritte gespeichert werden. </li><li> Ermöglichen die RNA-Pellet an der Luft trocknen, indem man die Röhrchen für 5 min bei Raumtemperatur geöffnet. Nehmen Vorsichtsmaßnahme, um zu vermeiden, over Trocknen der Pellets, da dies ihrer Auflösung in Wasser in der nachfolgenden Stufe zu beeinträchtigen. </li></ol> 5. Entfernen von DNA aus dem RNA-Präparat <ol><li> In 9 ul Nuklease-freies Wasser auf die RNA-Pellet und sicherstellen, dass das Pellet wird, bevor durch vorsichtiges Vortexen das Rohr gelöst. Um dieses Add 1 ul 10x DNase I-Puffer und 1 ul rekombinante DNase (von DNase I-Kit), mischen durch vorsichtiges Ausklopfen der Rohre, Spin kurz die Röhren und bei 37 ° C in einem Wasserbad für 30 min. </li><li> Add 2 ul DNase-Inaktivierung Reagenz (von DNase I-Kit) auf die Probe und bei Raumtemperatur für 2 min und oft mischen durch vorsichtiges Schwenken der Röhrchen. Zentrifuge bei 12.000 g für 10 min und Übertragung etwa 10 ul des klaren Überstands in ein frisches 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Messen Sie RNA-Konzentration mit einem Nanodrop oder Spektralphotometer. </li></ol> 6. Herstellung von cDNA aus RNA <ol><li> Fügen erforderliche Volumen thzumin enthält 1 ug RNA und bringt das Gesamtvolumen auf 8 &amp; mgr; l durch Zugabe von Nuklease freiem Wasser. Um dieses Add 1 ul 10 mM dNTP Mix und 1 ul Zufallshexameren aus dem Superscript First Strand Synthesis Kit. Vorsichtig mischen und inkubieren bei 65 ° C für 5 min in entweder einem Wasserbad oder auf einen vorprogrammierten Thermocycler. </li><li> Einen Vormischung, die folgenden Reagenzien: 2 ul 10x RT-Puffer, 4 ul 25 M MgCl 2, 2 &amp; mgr; l 0,1 M DTT und 1 ul RNAse OUT (40 U / ul). HINWEIS: Volumes gelten pro Reaktion, würde Benutzer müssen entsprechend den eigenen experimentellen Anforderungen skalieren. </li><li> Nach Entfernung des RNA-Probe, die von 65 ° C, eingestellt das Röhrchen bei Raumtemperatur für eine Minute. In 9 ul Basislösung und bei Raumtemperatur für 2 min. 1 &amp; mgr; l Superscript II Reverse Transkriptase (50 U / ul) und dann bei Raumtemperatur inkubiert für 10 min. </li><li> Inkubieren der Proben bei 42 ° C für 50min für die reverse Transkription auftritt. </li><li> Die Proben bei 70 ° C inkubieren, für 15 min, um die Reaktion zu beenden. </li><li> Legen Sie die Proben auf Eis kurz und fügen 1 ul RNAseH (2 U / ul) und bei 37 ° C für 20 min. </li><li> Die Röhrchen bei 3000 xg kurz zentrifugieren, um Spin-Down der Kondensatflüssigkeit. Anmerkung: Dies ist cDNA, die für die quantitative PCR verwendet wird. cDNA kann in -20 ° C Gefrierschrank bis PCR-Setup gespeichert werden. cDNA kann auch mit Nuklease-freies Wasser, bevor Sie mit PCR verdünnt werden. </li></ol> 7. Quantitative PCR <ol><li> Geben Sie eine Master-Mix enthält die folgenden Reagenzien (Mengen gelten pro Reaktion): 6,3 ul 2x Sybr Green Mix, 0,6 ul der Forward Primer (10 uM), 0,6 ul Reverse Primer (10 uM) und 0,5 ul Nuklease freiem Wasser . HINWEIS: Primer Entwurf wurde unter Verwendung gemacht die &quot;Pick-Primer &#39;Option im NCBI Nukleotid-Sequenz-Seite für das Gen von Interesse. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l Mastermix in jede Vertiefung einer 96 gut PCR Platte. In 2,5 ul cDNA früher die gut mit dem Mastermix hergestellt. Achten Sie darauf, dreifacher Ausfertigung PCR-Reaktionen für jede Probe einrichten. </li><li> Nach Beendigung der Zugabe von Mastermix und cDNA, umfassen die PCR-Platte mit Hilfe eines optischen Klebefolie, um die Vertiefungen abzudichten. Drehen die Platte kurz für 5 min bei 500 × g in einer Tischzentrifuge, um alle Flüssigkeit zu dem Boden des Bohrlochs zu regeln. </li><li> Laden Sie die PCR-Platte auf eine vorprogrammierte RT-PCR-Maschine. Verwenden Sie die in Tabelle 1 PCR-Parameter. </li><li> Datenanalyse: Verwenden Sie die C t Werte aus der qPCR-Ausgang für weitere Berechnungen. Zusammen mit dem Testgens, bis die PCR-Reaktionen für die interne Kontrollgene 18S rRNA und β-Aktin (negative Kontrolle) (auf gleiche Eingangs gewährleisten). Berechnen fachen Änderungen basierend auf ΔΔCt Verfahren 37. </li></ol>

The authors have no disclosures.

Nach dem Wahrzeichen Arbeit Benabid et al. Bei der Verwendung der tiefen Hirnstimulation zur Behandlung der Parkinson-Krankheit und essentiellem Tremor hat die DBS Operationstechnik mit großem Interesse den letzten zehn Jahren zu vielen neurologischen Erkrankungen 6,10,43 Behandlung untersucht. DBS Studien Targeting verschiedenen neuroanatomischen Regionen des Gehirns Schaltungen werden derzeit von vielen Gruppen durchgeführt, um wichtige neuronalen Erkrankungen ansprechen und sind in verschiedenen...

Die Geschichte hinter der Entwicklung der Tiefenhirnstimulation als neurochirurgische Technik stammt aus den 1870er Jahren, wenn die Möglichkeit der elektrischen Stimulation des Gehirns Schaltungen wurde 2 untersucht. Die Verwendung von chronischen Hochfrequenzstimulation zur Behandlung von neuronalen Erkrankungen begann in den 1960er Jahren 3. Später in den 1990er Jahren mit dem Aufkommen von chronischen Implantation DBS-Elektroden 4-6, die Anzahl von neuronalen Störungen, die von DBS behandelt wurden weiter zu. Tiefe Hirnstimulation wurde zum ersten Mal in den USA zur Behandlung von essentiellem Tremor 6 verwendet. Heute ist die Operation wird häufig zur neuronalen Störungen, die derzeit nicht behandelbar durch pharmakologische Intervention, zu behandeln. DBS ist derzeit zur Behandlung von Bewegungsstörungen Parkinson-Krankheit und Dystonie 7-9 behandeln. Alzheimer-Demenz, Huntington-Krankheit, Epilepsie, Schmerzen und neuropsychiatrischen Erkrankungen wie Depressionen, Zwangsstörungen, Tourette7; s Syndrom und Sucht sind einige der Bedingungen der Behandlung zugänglich durch DBS 10-12. Während DBS Operation FDA zur Behandlung von Parkinson, Dystonie und essentiellem Tremor genehmigt die Verwendung von DBS für die Behandlung von anderen oben genannten Bedingungen sind in verschiedenen Stadien der Labor- und klinischen Studien mit vielversprechend für Patienten 13,14. Klinisch wird DBS Operation in zwei Stufen durchgeführt. Die erste Stufe beinhaltet die chirurgische Positionierung der DBS-Elektroden an der gezielten anatomischen Lage mit einer Kombination aus radiologischen Positionierung, CT, MRT sowie Mikromesswerte für eine verbesserte Präzision. Die zweite Stufe beinhaltet die Implantation eines Impulsgenerators in der oberen Brustkorb des Patienten und die Installation Verlängerungskabel von der Kopfhaut an den Impulsgenerator. Bezogen auf das neurologische Erkrankung, haben mehrere Programmiersysteme für den Pulsgenerator standardisiert und wird verwendet, um die gewünschte Spannung zu liefern. Das Endvolumentage wird stufenweise erreicht, um die besten klinischen Reaktion mit minimaler Spannung 15 zu empfangen. In unseren Studien, im Gegensatz zu den chronischen DBS Implantate klinisch verwendet wird, für die der Einfachheit halber haben wir uns dem Studium eine einmalige Hochfrequenzstimulation (1 Stunde) in unserem Tiermodell zurückgegriffen. Ein Teil der Forschung unserer Gruppe konzentriert sich auf die Untersuchung der Verwendung von DBS Operation bei therapierefraktärer Epilepsie. Die stereotaktische chirurgische Ansätze mit Hochfrequenz-Stimulation wurde von vielen anderen als eine wirksame Möglichkeit, medizinisch refraktärer Epilepsie, die etwa 30% aller Fälle von Epilepsie 10,16,17 bildet Behandlung untersucht. Kleinhirn-Stimulation zur Förderung der kortikalen Oberfläche sowie den tiefen Kleinhirnkerne wurden in der Vergangenheit als Ziele verwendet, um Epilepsie 10,18,19 behandeln. Darüber hinaus hat Hippocampus Stimulation auch versucht worden, aber mit unterschiedlichen Ergebnissen 20,21. Einige der anderen untersuchtenDBS Ziele für Epilepsie sind die Großhirnrinde, Thalamus, Nucleus subthalamicus und Vagusnerv 8. Im Anschluss an die Ergebnisse mehrerer Studien in den letzten Jahren, die vordere Thalamuskern (ATN) hat als die häufigste DBS Ziel für Epilepsie-Behandlung 10,22 entstanden. Gestützt auf das Wissen über neuroanatomische Schaltung und Erkenntnisse aus Tiermodellen haben verschiedene Studien über die therapeutische Wirkung die tiefe Hirnstimulation der ATN bei der Behandlung von Epilepsie 23-26 konzentriert. Das ATN ist Teil des limbischen Kreis und ist in der Region des Gehirns, die Anfallshäufigkeit betrifft entfernt. Studien von Hamani et al., Haben die Wirksamkeit von ATN-DBS in einer Pilocarpin induzierten Epilepsie-Modell getestet und festgestellt, dass die bilateralen ATN Stimulation verlängerte Latenzen für Pilocarpin-induzierten Krampfanfällen und Status epilepticus 24. Darüber hinaus wurde Hochfrequenzstimulation des ATN gefunden Anfallsfrequenz in einem Pentylentetrazol (PTZ) Modell ep reduzierenilepsy 25,27-29. Lee et al., Haben eine mittlere Reduktion der Anfallshäufigkeit um etwa 75% auf chronische tiefe Hirnstimulation des ATN bei der Behandlung von refraktären partiellen Epilepsie 30 ausgewiesen. Eine neue klinische Studie zur Behandlung refraktärer Epilepsie hat vielversprechende Ergebnisse nach DBS Operation Ausrichtung der vorderen Thalamuskern (ATN) 22 gezeigt. Eine multizentrische randomisierte Studie mit 110 Patienten, die bilaterale DBS des ATN zur Behandlung refraktärer Epilepsie (SANTE-Studie) zeigte einen Rückgang der Anfallshäufigkeit um etwa 40% 31. Die Ergebnisse aus dieser Studie deutete auch auf eine verzögerte optimale Antiepileptikum Wirkung 2-3 Monate nach der Operation beobachtet. Weitere Studien von Toda et al., Mit diesen Ergebnissen untermauert, wo sie gezeigt, Neurogenese geschieht zu einem späteren Zeitpunkt nach der DBS (Tage 3-5) im Tiermodell ein. Zusätzlich Encinas et al., Haben hippocampalen neurogene gemeldetsis in der erwachsenen Maus Gyrus dentatus nach hochfrequente Stimulation des ATN 32. Frühere Studien 33-35 haben sinkende Neurogenese in bestimmten Fällen epileptischen wie chronische Temporallappen-Epilepsie und eine Assoziation mit Lerndefiziten, Gedächtnisstörungen und spontan wiederkehrenden Motorkrampfanfälle berichtet. Weiterhin gab es eine Verringerung in der neuralen Stammzellvorläufer Faktoren wie FGF2 und IGF-1 in der chronisch epileptischen Hippocampus im Tiermodell 33. In Anbetracht dessen, interventionelle Strategien wie DBS, die eine Steigerung der Neurogenese im Gyrus dentatus zeigen, sind spannende Möglichkeiten für die Forschung. Diese Ergebnisse haben uns ermutigt, weiter tief in den zugrunde liegenden Mechanismus der Neurogenese nach DBS Behandlung für Epilepsie zu erkunden. Wir haben die ATN sowohl einseitig ausgerichtet (Daten nicht angegeben) als auch auf bilateraler Ebene (in repräsentative Ergebnisse) und gesehen erhöht Neurotrophin (BDNF) Ausdruck in den Ratten Gyrus dentatus. Unsere current Hypothese ist, dass die BDNF-Expression initiiert eine Genexpression Kaskade, in der Neurogenese gipfelt, die dem anti-epileptische Wirkung DBS Operation übersetzt. In diesem Artikel präsentieren wir unsere Methoden zur DBS Operation gezielt den ATN bei Ratten, gefolgt von Genexpressionsanalyse als attraktiver Ansatz, um die zugrunde liegende Mechanismus die Vorteile des DBS zu studieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1211">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:236px;">Deep Brain Stimulation Surgery</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:604px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent/Equipment</td>
			<td>Vendor Name</td>
			<td>Catalog No.&#160;</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereotactic frame</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>Model 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Drill&#160;</td>
			<td>Dremmel</td>
			<td>7700, 7.2 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scalpel</td>
			<td>BD</td>
			<td>372610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ketamine</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-803-6637</td>
			<td>Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylazine</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-808-1947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buprenorphine</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-850-2280</td>
			<td>Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical staples</td>
			<td>ConMed Corporation</td>
			<td>8035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sutures (3-0)&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-3333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (1 ml, 29 1/2 G)</td>
			<td>BD</td>
			<td>329464</td>
			<td>Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (3 ml, 25 G)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309570</td>
			<td>Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305761</td>
			<td>Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25309B</td>
			<td>Use for general sterilization&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eye Lubricant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-898-350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stimulator</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>Model 3628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DBS electrodes</td>
			<td>Rhodes Medical Instruments, CA</td>
			<td>SNEX100x-100mm</td>
			<td>Electrodes are platinum, concentric and bipolar</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Betadine (Povidone-Iodine)&#160;</td>
			<td>PDI</td>
			<td>S23125</td>
			<td>Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="2" height="25" style="height:25px;">&#160;Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent/Equipment</td>
			<td>Vendor Name</td>
			<td>Catalog No.&#160;</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acrylic Rodent Brain Matrix</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>175-300</td>
			<td>www.emsdiasum.com</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Razor Blade</td>
			<td>V W R</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guillotine Scissors</td>
			<td>Clauss</td>
			<td>18039</td>
			<td>For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors</td>
			<td>Codman Classic</td>
			<td>34-4098</td>
			<td>Use for removing the brain from the skull</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72957-06</td>
			<td>Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Boston Bioproducts</td>
			<td>BM-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="2" height="25" style="height:25px;">&#160;RNA Extraction and cDNA Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent/Equipment</td>
			<td>Vendor Name</td>
			<td>Catalog No.&#160;</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tri Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9424</td>
			<td>Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (3 ml, 25 G)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309570</td>
			<td>Use for tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td>Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dnase I Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superscript First Strand Synthesis Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11904-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tabletop Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">&#160;Quantitative PCR</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent/Equipment</td>
			<td>Vendor Name</td>
			<td>Catalog No.&#160;</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SYBR Green PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>204143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Custom Oligos</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10668051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR Plates (96 wells)</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>C18080-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optical Adhesive Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclease free Water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30538-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Real Time PCR Machine</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>7500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of gene expression changes in the rat hippocampus after deep brain stimulation of the anterior thalamic nucleus

Tiefen Hirnstimulation (DBS) Chirurgie, die auf die verschiedenen Regionen des Gehirns, wie der Basalganglien, Thalamus und subthalamicus Regionen ist eine wirksame Behandlung für verschiedene Bewegungsstörungen, die ausgefallen sind, um Medikamente reagieren. Die jüngsten Fortschritte auf dem Gebiet der DBS Operation begonnen hat, die Anwendung dieser OP-Technik, um andere Bedingungen so vielfältig wie krankhafte Fettsucht, Depressionen und Zwangsstörungen zu erweitern. Trotz dieser Ausweitung Hinweise, ist nur wenig über die zugrunde liegenden physiologischen Mechanismen, die wohltuende Wirkung des DBS Operation erleichtern bekannt. Ein Ansatz für diese Frage ist es, Genexpressionsanalyse in Neuronen, die elektrische Stimulation erhalten zuführen. Frühere Studien haben gezeigt, daß Neurogenese bei der Ratte Gyrus dentatus wird in DBS ausgelöst Targeting des anterioren Nucleus des Thalamus 1. DBS Operation gezielt den ATN ist weithin für die Behandlung refraktärer Epilepsie eingesetzt. Es ist daher von sehr interest für uns, um die Transkriptionsänderungen durch elektrische Stimulation der ATN induzierte erkunden. In diesem Manuskript beschreiben wir unsere Methoden für die stereotaktisch geführte DBS Operation gezielt den ATN bei erwachsenen männlichen Wistar-Ratten. Wir haben auch die nachfolgenden Schritte für Gewebedissektion, RNA-Isolierung, cDNA-Präparation und quantitative RT-PCR diskutieren zur Messung der Genexpression ändert. Dieses Verfahren könnte angewandt und für die Stimulierung der Basalganglien und andere Regionen des Gehirns allgemein klinisch gezielt modifiziert werden. Die Genexpression Studie hier beschriebenen übernimmt einen Kandidaten Zielgen Ansatz für die Entdeckung der molekularen Spieler, die Regie führen konnte den Mechanismus für die DBS.

Die 1A und 1B zeigen die relative Expression von BDNF und GABRD relativ zum Steuer Gen β-Actin. BDNF ist ein Neurotrophin ist oft mit neuroprotektiven Wirkungen in vielen neuronalen Erkrankungen 38-41 verbunden. Es ist daher interessant, das Expressionsprofil von BDNF in Reaktion auf die Stimulation des ATN das therapeutische Vorteile zu epileptischen Patienten ergibt analysieren. In 1A, die das Genexpressionsprofil von BDNF in den angegebenen Zeitpunkten ze...

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Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Die Analyse der Genexpression Veränderungen im Hippocampus Ratte nach Tiefenhirnstimulation des Anterior Thalamuskern

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

analysis-gene-expression-changes-rat-hippocampus-after-deep-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.8K Aufrufe.  Brigham & Women's Hospital, Harvard Medical School. The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Serie: Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS: Mit dem Theta-Burst-Protokoll zu Mechasnism der Plastizität in Individuen sich mit Fragile X-Syndrom und Autismus

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Forschung

Neurowissenschaften

The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic fields. These rapidly alternating fields induce electrical currents within localized, targeted regions of the cortex which are associated with various physiological and functional brain changes.1,2,3
In 2007, O'Reardon et al., utilizing the NeuroStar device, published the results of an industry-sponsored, multisite, randomized, sham-stimulation controlled clinical trial in which 301 patients with major depression, who had previously failed to respond to at least one adequate antidepressant treatment trial, underwent either active or sham TMS over the left dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The patients, who were medication-free at the time of the study, received TMS five times per week over 4-6 weeks.4
The results demonstrated that a sub-population of patients (those who were relatively less resistant to medication, having failed not more than two good pharmacologic trials) showed a statistically significant improvement on the Montgomery-Asberg Depression Scale (MADRS), the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD), and various other outcome measures. In October 2008, supported by these and other similar results5,6,7, Neuronetics obtained the first and only Food and Drug Administration (FDA) approval for the clinical treatment of a specific form of medication-refractory depression using a TMS Therapy device (FDA approval K061053).
In this paper, we will explore the specified FDA approved NeuroStar depression treatment protocol (to be administered only under prescription and by a licensed medical profession in either an in- or outpatient setting).

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the FDA approved depression treatment protocol using the Neuronetics NeuroStar TMS device.

Die Neurostar TMS Device: Die Durchführung der FDA genehmigten Protokoll für die Behandlung von Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Spinal Cord Elektrophysiologie II: Extrazelluläre Saugelektrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to the display of physiological and behavioural phenotypes. Such environmental programming is likely to increase the susceptibility to metabolic, cardiovascular and mental diseases 3,4.
DNA methylation and histone modifications are considered key processes in the mediation of the gene-environment dialogue and appear also to underlay environmental programming 5. In mammals, DNA methylation typically comprises the covalent addition of a methyl group at the 5-position of cytosine within the context of CpG dinucleotides.
CpG methylation occurs in a highly tissue- and cell-specific manner making it a challenge to study discrete, small regions of the brain where cellular heterogeneity is high and tissue quantity limited. Moreover, because gene expression and methylation are closely linked events, increased value can be gained by comparing both parameters in the same sample.
Here, a step-by-step protocol (Figure 1) for the investigation of epigenetic programming in the brain is presented using the 'maternal separation' paradigm of early life adversity for illustrative purposes. The protocol describes the preparation of micropunches from differentially-aged mouse brains from which DNA and RNA can be simultaneously isolated, thus allowing DNA methylation and gene expression analyses in the same sample.

A streamlined workflow to study DNA methylation and gene expression changes upon early-life stress is shown. Starting from maternal separation of newborn mice and isolation of discrete brain tissues, we represent a protocol to simultaneously isolate DNA and RNA from brain tissue punches for subsequent bisulfite sequencing and RT-PCR analysis.

Optimierte Analyse von DNA-Methylierung und Genexpression von Klein, Anatomisch-definierte Bereiche des Gehirns

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Laser Capture Mikrodissektion von Angereichert Populationen von Neuronen oder Single Neurons zur Genexpressionsanalyse Nach Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Mikromanipulation der Genexpression in der Erotik-Zebrafischgehirn Mit cerebroventricular Mikroinjektion von Morpholino Oligonukleotiden

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for using blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) to image rodents with simultaneous DBS. DBS fMRI presents a number of technical challenges, including accuracy of electrode implantation, MR artifacts created by the electrode, choice of anesthesia and paralytic to minimize any neuronal effects while simultaneously eliminating animal motion, and maintenance of physiological parameters, deviation from which can confound the BOLD signal.&#160;Our laboratory has developed a set of procedures that are capable of overcoming most of these possible issues. For electrical stimulation, a homemade tungsten bipolar microelectrode is used, inserted stereotactically at the stimulation site in the anesthetized subject. In preparation for imaging, rodents are fixed on a plastic headpiece and transferred to the magnet bore. For sedation and paralysis during scanning, a cocktail of dexmedetomidine and pancuronium is continuously infused, along with a minimal dose of isoflurane; this preparation minimizes the BOLD ceiling effect of volatile anesthetics. In this example experiment, stimulation of the subthalamic nucleus (STN) produces BOLD responses which are observed primarily in ipsilateral cortical regions, centered in motor cortex. Simultaneous DBS and fMRI allows the unambiguous modulation of neural circuits dependent on stimulation location and stimulation parameters, and permits observation of neuronal modulations free of regional bias. This technique may be used to explore the downstream effects of modulating neural circuitry at nearly any brain region, with implications for both experimental and clinical DBS.

This protocol describes a standard method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and deep brain stimulation in the rodent. The combined use of these experimental tools allows for the exploration of global downstream activity in response to electrical stimulation at virtually any brain target.

Deep Brain Stimulation mit gleichzeitiger fMRT in Nagetiere

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Stereotaktische Infusion von oligomeren Amyloid-beta in die Maus-Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Microelectrode Guided Implantation of Electrodes into the Subthalamic Nucleus of Rats for Long-term Deep Brain Stimulation

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, dystonia or tremor. DBS is based on the delivery of electrical stimuli to specific deep anatomic structures of the central nervous system. However, the mechanisms underlying the effect of DBS remain enigmatic. This has led to an interest in investigating the impact of DBS in animal models, especially in rats. As DBS is a long-term therapy, research should be focused on molecular-genetic changes of neural circuits that occur several weeks after DBS. Long-term DBS in rats is challenging because the rats move around in their cage, which causes problems in keeping in place the wire leading from the head of the animal to the stimulator. Furthermore, target structures for stimulation in the rat brain are small and therefore electrodes cannot easily be placed at the required position. Thus, a set-up for long-lasting stimulation of rats using platinum/iridium electrodes with an impedance of about 1 M&#937; was developed for this study. An electrode with these specifications allows for not only adequate stimulation but also recording of deep brain structures to identify the target area for DBS. In our set-up, an electrode with a plug for the wire was embedded in dental cement with four anchoring screws secured onto the skull. The wire from the plug to the stimulator was protected by a stainless-steel spring. A swivel was connected to the circuit to prevent the wire from becoming tangled. Overall, this stimulation set-up offers a high degree of free mobility for the rat and enables the head plug, as well as the wire connection between the plug and the stimulator, to retain long-lasting strength.

A method for implanting electrodes into the subthalamic nucleus (STN) of rats is described. Better localization of the STN was achieved by using a microrecording system. Furthermore, a stimulation set-up is presented that is characterized by long-lasting connections between the head of the animal and the stimulator.

Mikroelektroden-geführte Implantation von Elektroden in den Nucleus subthalamicus des Rats für die Langzeit-Tiefe Hirnstimulation

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, ...