Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Institut für Psychiatrie und der Europäischen Union im Marie-Curie Initial Training Network (NINA Contract 238665) gefördert.

1. Die Programmierung von Early Life Missgeschick Mütterliche Trennung (MS) durchgeführt wird, um früh-Life-Stress (ELS) bei Jungtieren durch timed-trächtigen Mäusen C57BL/6N (postnatalen Tag 0 (P0) am Tag der Geburt) geliefert zu induzieren. <ol><li> Einzelne Würfe in sauberen Käfigen (mit Heizkissen) für 3 h täglich von P1-10. </li><li> Control (Nicht-ELS) Jungtiere ungestört im mütterlichen Nest ganz. </li><li> Die Jungen werden mit ihren Müttern bis zum Absetzen (P21), nach welcher Zeit sie in Sex-angepassten Gruppen (3-5 Mäuse pro Käfig) unter Standardbedingungen Versuchstier Haltungsbedingungen untergebracht sind, gehalten. </li></ol> 2. Isolierung und Präparation von Hirngewebe <ol><li> . Mäuse werden an gewünschten Zeiten durch Genickbruch getötet Hinweis: weil dieses Protokoll beinhaltet eine Stress-Paradigma, keine Betäubung vor dem Genickbruch gegeben, nicht zu stören normalen physiologischen Regulation von Stresshormonen. Schädel geöffnet undGehirn werden sorgfältig entfernt und sofort schockgefroren durch Eintauchen in Isopentan-Trockeneis, bevor es bei -80 ° C gelagert </li><li> Gehirne sind kryogeschnitten (10 um Dicke); Abschnitte sind auf Superfrost Glasobjektträger montiert und bei -20 ° C Verweis auf eine Standard-Maus stereotaktischen Atlas (zB Paxinos 6) wird verwendet, um anatomische Präzision zu verifizieren und Einbeziehung der Region of Interest (zB für Neuronen im PVN gewährleisten - PVN - sammeln Abschnitten zunächst auf der Ebene des rostralen PVN, Bregma -0,75 bis -0,85). </li><li> Die Schnitte werden mit Kresylviolett gefärbt, um die Identifizierung der verschiedenen Hirnstrukturen zu erleichtern. Stempel (0,8 mm) der Bereiche von Interesse (zB PVN) durch in loco Mikrodissektion erhalten. </li></ol> 3. Nukleinsäure-Extraktion von Brain Punches Ein optimiertes Protokoll für die gleichzeitige Gewinnung von DNA und RNA aus winzigen Gehirn definiert neuroanatomisch-regIonen für die Bisulfit-und Genexpressionsanalysen 7 beschrieben wird. Hinweis: Unter Berücksichtigung, dass die RNA weniger stabil als DNA in der GTC-Puffer ist, empfehlen wir die Verarbeitung RNA zuerst. Das Homogenat zur DNA-Reinigung verwendet werden kann bei Raumtemperatur (RT) während dieser Zeit gehalten werden. <ol><li> Homogenisieren Stempel mit einer Pipette und Vortexer in 400 ul Guanidiniumthiocyanat (GTC)-Puffer (4,5 M Guanidiniumthiocyanat, 2% N-Lauroylsarcosin, 50 mM EDTA pH 8,25 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M beta-Mercaptoethanol, 0,2% Antischaummittel A) bei RT, vorbei mehrmals durch eine Injektionsspritze (29G) (Abbildung 2). </li><li> Split Lysat in gleiche Teile, sowohl RNA und DNA kann zur gleichen Zeit gewonnen werden oder getrennt, abhängig von den jeweiligen experimentellen Anforderungen. </li><li> Für die RNA-Reinigung hinzufügen 1/10 Volumen von NaOAc, 1 Volumen AquaPhenol (Appligene) (pH 4) und 1/2 Volumen Chloroform: Isoamylalkohol (24:1) bis Lysat. Vortex kräftig nach jedem Schritt undInkubation auf Eis für 10 min, Zentrifuge (20 min bei 10.000 g bei 4 ° C); ein gleiches Volumen von 70% EtOH zu wässrigen Phase, die. </li><li> Übertragen Mischung, um ein RNA-Spin-Säule (zB NucleoSpin RNA II von Macherey-Nagel) und führen On-Column-DNase-Verdauung und Waschschritte (folgen Sie dem Protokoll des Herstellers); eluieren RNA in 25 ul H 2 O. </li><li> Für die DNA-Aufreinigung ein optimiertes Protokoll des Qiagen DNeasy Blut und Gewebe Kit verwendet wird. Äquilibrieren Lysat mit gleichen Volumina von Buffer AL und 100% EtOH, Last auf eine Spin-Säule zentrifugieren (1 min bei 10.000 g bei RT) und Durchfluss abschütten. </li><li> Fügen Sie 500 ul Buffer AW1, darunter 5 ul RNAse (1 mg / ml) zur Säule und Inkubation 10 min bei RT. Spin (1 min bei 10.000 g, RT) und Durchfluss abschütten. </li><li> Waschkolonne mit 500 ul Buffer AW2, Durchfluss-und Spin-trockenen leeren Spalte (1 min bei 15.000 g) zu verwerfen. </li><li> In vorgewärmte (70 ° C) Buffer AE und inkubieren Spalten für 10 min bei 70 ° C Eluieren durch Zentrifugation (1 min, 10.000 g), tragen Sie Flow-Through-und Zentrifugationsschritt wiederholen. </li></ol> Verwenden Sie ein Spektralphotometer zur DNA-und RNA-Konzentrationen zu bestimmen. Ein typisches PVN Punsch Ausbeuten ~ 600 ng DNA und ~ 400 ng RNA. Für die Genexpressionsanalyse mittels quantitativer PCR (qPCR), wir verwenden in der Regel ~ 100 ng RNA in die Reverse Transkription-Reaktion. 4. Bisulfit-Konvertierung Natriumbisulfit wird verwendet, um nicht-methylierte Cytosine zu Uracile konvertieren. Im Gegensatz dazu sind methylierte Cytosine aus der Umwandlung geschützt. Daher stellen alle Cytosine, die in der endgültigen Sequenzierung des PCR-Amplikon Bisulfit erkannt werden methylierte Cytosine. Bisulfit-Konvertierung verursacht erheblichen Abbau der DNA, die ein begrenzender Faktor sein können in PCR-Analyse. Optimierten Reaktionsbedingungen, die Cytosin-Konversion zu maximieren, DNA-Fragmentierung zu reduzieren und zu pflegen Einzelstrang-DNA auch bei niedrigeren Temperaturen kann erreicht werden durchQIAGENs EpiTect-Bisulfit-Kit. In unseren Händen ~ 200 ng DNA aus micropunches gereinigt eine ausreichende Menge an Ausgangsmaterial für die Bisulfit-Umsetzung. Um die Unterschiede in der Effizienz der Umwandlung Reaktion zu verhindern, sollte die Menge der Ziel-DNA konstant gehalten werden bei allen Proben, die während eines Experiments verarbeitet. Darüber hinaus liest Sequenz sollte für Umwandlungseffizienz durch Untersuchen der Anzahl der nicht umgesetzten nicht CpGs geprüft werden. Dieser Satz sollte höchstens 98% betragen. Niedrigere Werte weisen auf unvollständige oder ineffizient Bisulfit-Konvertierung und die zugrunde liegenden Sequenzen sollten aus der Analyse ausgeschlossen werden. 5. Bisulfit-PCR <ol><li> Design-Bisulfit-Sequenzierung Primer, die spezifisch für Bisulfit-konvertierter DNA (siehe Diskussion) sind; Methyl Primer Express-Software ( <a href="https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&amp;catID=602121" target="_blank">https://products.appliedbiosystems.com/ab</a>/ De / US / adirect / ab? Cmd = catNavigate2 &amp; catid = 602121) wird diese Hilfe und helfen, optimale Annealing-Temperaturen in Pilotversuchen zu bestimmen. </li><li> Planen PCR-Master-Mix (für eine Reaktion) wie folgt: 2,5 ul 10x PCR-Puffer 0,5 ul 10 mM dNTPs 1 ul 10 uM Vorwärtsprimer 1 ul 10 uM Rückwärtsprimer 0,125 ul Qiagen Hotstart Taq Plus- füllen bis zu 23 ul mit H 2 O </li><li> In 2 pl Bisulfit-behandelter DNA, um eine Reaktion. </li><li> Amplify unter folgenden Bedingungen: 1 Zyklus 6 min 95 ° C 45-50 Zyklen von 1 min 95 ° C, 1 min bei optimale Glühtemperatur, 1 min 72 ° C 1 Zyklus 5 min 72 ° C </li></ol> Analysieren 7 ul PCR-Produkts durch Agarose-Gelelektrophorese der Größe des Amplikons zu überprüfen und zu reinigen verbleibenden PCR-Reaktion für die anschließende Ligation unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen PCR Clean-up Kit (z. B. Macherey-NaGel NucleoSpin Extract). Bei zusätzlichen unerwünschten PCR-Produkte erhalten werden, wird Gelreinigung empfohlen. 6. Bisulfit-Sequenzierung Hochauflösende DNA-Methylierungs-Profile von einzelnen Klon Lesungen ableiten lassen erkennen, kleine Veränderungen in der DNA-Methylierung und identifizieren regulatorischen Regionen, die auf eine Behandlung (Umwelt-Programmierung) sind. Die Bisulfit-Sequenzierung Verfahren umfasst drei aufeinander folgenden Arbeitsschritten. Erstens, werden PCR-Produkte durch PCR erhalten vor Bisulfit in einen Vektor ligiert und in Bakterien. Zweitens wird von Kolonie-PCR einzelne Klone eingesetzt, um die korrekte Größe des Einsatzes zu bestimmen. Drittens sind positive Kolonie PCRs aufgeräumt und unterzogen Big-Dye-Sequenzierung-Reaktion. Nach einer Reinigung Schritt werden die Produkte auf einem kapillaren Elektrophorese Sequenzer. 6,1 Ligation und Transformation Hinweis: Wir verwenden routinemäßig den pGEM-T Vektor clenantrieb Kits (Promega). Unserer Erfahrung nach hängt die Klonierungseffizienz kritisch an dem Einsatz zu ligiert werden. Verschiedene Vektoren sollte getestet bei einer geringen Zahl von rekombinanten Klonen wiederholt erhalten werden. <ol><li> Richten Sie Ligationsreaktion: 5 ul 2x Ligationspuffer 1 ul pGEM-T Vektor 1 ul T4-Ligase 3 ul-up gereinigt PCR-Produkt </li><li> Mischen Reaktion durch Pipettieren und Inkubation über Nacht bei 4 ° C Hinweis: Ligation kann auch für 1 h bei RT durchgeführt werden sowie. Um die Anzahl der rekombinanten Klone zu erhöhen, über Nacht Ligation bei 4 ° C ist bevorzugt. </li><li> Clean-up von Ligationsprodukte durch Ethanolfällung: <ol class="lalpha"><li> Fügen Sie 1 ul Glycogen, 1 ul 3 M NaAc und 25 ul 100% EtOH auf die Ligationsreaktion und Niederschlag für 1 min in flüssigem Stickstoff. </li><li> Zentrifuge (15,0000 g für 30 min bei 4 ° C) und Überstand verwerfen. </li><li> Waschen mit 300 ul70% EtOH und dann zentrifugiert (15.000 g für 20 min bei 4 ° C), Überstand verwerfen und Pellet trocken bei RT (10 min). </li><li> Pellet in 10 ul H 2 O. </li></ol></li></ol> 6,2 Transformation von Ligationsprodukte in elektrokompetente Bakterien <ol><li> Vorkühlen Elektroporationsküvetten (1 mm breit) auf Eis und Tauwetter Aliquot elektrokompetente DH5a Bakterien auf Eis. </li><li> In 45 ul DH5a Bakterien zu 10 pl bis Ligationsprodukt gereinigt (siehe oben) und Transfer zum Küvette. </li><li> Verwandeln Bakterien bei 1,5 kV, 200 Ω, 15 uF und fügen Sie 1 ml vorgewärmten SOB-Medium direkt nach dem Puls-Lieferung. </li><li> Recover Bakterien für 1 h bei 37 ° C, verteilt 100 ul Suspension auf LB / Ampicillin-Platten mit IPTG / X-Gal beschichtet. </li><li> Platten über Nacht bei 37 ° C </li></ol> 6,3 Kolonie-PCR Hinweis: Kolonie-PCR aus einzelnen Klonen wird durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Einsätze sindder vorhergesagten Größe. Verzögerte Entwicklung von der Farbe blau / weiß-Screening, unerwünschte Rekombinationsereignisse während der Ligation, Einbau von oligomeren Primerpaare oder verkürzte PCR-Produkte kann sonst zu fehlerhaften Ergebnissen führen Sequenzierung. Wir verwenden routinemäßig T7-und SP6-Primer an klonierten Inserts zu verstärken; führt dieser Ansatz zusätzliche Vektorsequenzen von ca. 150 bp. T7-Primer wird in der Sequenzierreaktion in einem späteren Schritt verwendet. <ol><li> Einrichten Kolonie-PCR-Reaktion in 96-Well-Platte. Für eine Reaktion zu verwenden: 3 ul 2,5 mM MgCl 2 2,5 ul 10x Taq-Puffer 1,5 ul 10 mM dNTP 2 ul 2,5 mM Primer T7 2 ul 2,5 mM SP6-Primer 1 ul Fermentas Taq-Polymerase füllen bis zu 25 ul mit H 2 O </li><li> Je 25 ul / Vertiefung Master-Mix in jedes Well einer 96-Well-Platte. </li><li> Pick-positiven (weiß) von Klon Platte mit Pipettenspitze und tauchen Sie ein in PCR-Reaktion. </li><li> Amplify mit folfolgenden Bedingungen: 1 Zyklus 4 min bei 95 ° C 10 Zyklen von 30 s bei 94 ° C, 30 s bei 56 ° C und 30 s bei 72 ° C 30 Zyklen von 30 s bei 94 ° C, 30 s bei 48 ° C und 30 s bei 72 ° C 1 Zyklus von 5 min bei 72 ° C </li><li> Laden 5 ul Kolonie-PCR auf einem Agarosegel und bestimmen Reaktionen, die das Recht Insert-Größe enthalten. </li><li> Kolonie PCRs mit den gewünschten Amplikons bis Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits (Macherey Nagel Nucleofast) gereinigt. </li></ol> 6,4 Big-Dye Terminator Reaktion und Sequenzierung <ol><li> Und Master-Mix für Big-Dye-Reaktion. Für eine Reaktion zu verwenden: 1 ul H 2 O 0,5 ul Big-Dye-Reagenz 1,5 ul Sequenzierungspuffer </li><li> Dispense 3 ul / Vertiefung in jedes Well einer 96-Well-Platte, in jede Vertiefung hinzufügen 2 ul aufgeräumt Kolonie-PCR-Produkt und führen Reaktion auf einem Thermocycler mit folgenden Parametern: 35 Zyklen von 10 s bei 96 ° C, 5 s bei 50 ° C und 4 Minuten bei 60 ° C </li><li> Der Big-Dye Reaktion wird unter Verwendung eines kommerziellen Kits (Millipore Montage 96 Sequenzierung Clean-Up Kit) gereinigt und verarbeitet auf einem Kapillar-Sequenzer (zB ABI 3100 DNA). </li><li> Die Sequenzen werden mit Hilfe der Biq Analyzer ( <a href="http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/" target="_blank">http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/</a> ) oder das Online-Tool BISMA ( <a href="http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/" target="_blank">http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/</a> ) zur Ableitung der Methylierungsmuster der DNA-Region untersucht (Abbildung 4). </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Um einen Einblick in den Einfluss von ELS auf der AVP Expression und Methylierung Status zu erhalten, wurden C57BL/6N Mäuse nach der oben beschriebenen Workflow verarbeitet. Kurz gesagt, war eine Gruppe von Mäusen C57BL/6N subjected zu ELS während die Kontrollgruppe wurde in Ruhe gelassen. Die PVN und der Nucleus supraopticus (SON) gestanzt und DNA und RNA isoliert wurden gleichzeitig aus den einzelnen Schläge. RNA wurde revers transkribiert und die Ebenen von AVP-Transkripte wurden durch qPCR Analyse und normiert auf die Expression von HPRT und GAPDH Housekeeping-Gene gemessen. DNA wurde Bisulfit behandelt, amplifiziert mit Primern, die spezifisch den AVP-Enhancer (4a) und der PCR-Produkte wurden kloniert und sequenziert. Mindestens 20 rekombinante Klone von jeder Maus / PCR wurden analysiert, um die Frequenzen für die Methylierung CpGs in der PCR-Amplikons (4b) enthalten bestimmen. Im Vergleich zu Kontrollen, ELS einen signifikanten Hypomethylierung bei CpG10, CpG12, CpG13 und Cpg14 der AVP-Enhancer (p &lt;0,05, n = 6-8 Tiere) induziert darauf hindeutet, epigenetische Markierung dieser regulatorischen Region durch frühe Lebenserfahrungen. Im Gegensatz zu der PVN, Methylierungder AVP-Enhancer war unbeeinflusst von ELS im Sohn illustriert Gewebsspezifität epigenetische Markierung (Abbildung 4c). Die Analyse des DNA-Methylierungs-Status bei CpG10 und AVP-Genexpression in Kontrolltieren (n = 6) zeigte eine negative Korrelation, die auf eine Rolle der DNA-Methylierung in der Feinabstimmung der AVP-Genexpression (Abbildung 4d). <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig1.jpg" /> Abbildung 1. Micropunches werden aus sezierten Gehirne von Steuer-und im frühen betonte Mäusen erhalten. Nach DNA und RNA-Isolierung wird die Genexpression mittels qRT-PCR bestimmt, während Bisulfit behandelten DNA amplifiziert und gereinigt Produkte werden in einen geeigneten Vektor zur Identifizierung von rekombinanten Klonen von blau / Weiß-Selektion kloniert. Richtiger Einsatz Größen werden von geprüftenKolonie-PCR vor der Durchführung von Big-Dye Reaktions-und Bearbeitungszeiten auf einem Kapillar-Sequenzer. Methylierungsmuster werden visualisiert durch entsprechende Software-Tools. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig2.jpg" /> Abbildung 2. Timeline von DNA / RNA-Extraktion zur Bisulfit-Sequenzierung. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig3.jpg" /> Abbildung 3. Workflow für die gleichzeitige Extraktion von DNA und RNA. Der Stempel des hypothalamischen Nucleus paraventricularis, einem winzigen Avp exprimierenden Hirnregion, wird in 400 ul GTA Puffer gelegt, gevortext, bis gestört und weiter homogenisiert, indem sie durch eine Spritze (29G). Das Homogenat wird dann für die Aufreinigung von RNA und DNA gespalten. Die Spaltung kann 1:1 sein oder aus unterschiedlichen Anteilen jevon der jeweiligen experimentellen Frage. Homogenate sollten innerhalb weniger Stunden verarbeitet werden. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig4.jpg" /> Abbildung 4. CpG-Methylierung bei der AVP-Locus in 6 Wochen alt-Steuerung und ELS Tiere. (A) Schema der AVP und Oxytocin Gene orientiert Schwanz-Schwanz und getrennt von der Zwischengenregion (IGR). Exons sind durch offene (nummeriert) Boxen dargestellt. Die Verteilung von CpG-Reste angegeben wird und eine Größe und Position des jeweiligen PCR-Fragments mit CpG 10 bis CpG14 durch eine fette Linie markiert. (B) Methylierung der AVP-Enhancer im PVN in Steuer-und ELS Tiere (n = 6-8). (C) Methylierung der AVP-Enhancer an den Sohn in Steuer-und ELS Tiere (n = 8-10). (D) AVP-Genexpression wurde korreliertmit Methylierung an CpG10 (n = 6). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> .

<ol>
	<li>Jirtle, R. L., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+epigenomics+and+disease+susceptibility.">Environmental epigenomics and disease susceptibility.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 253-262 (2007).</li><li>Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+programming+of+the+HPA+axis:+Early+life+decides.">Epigenetic programming of the HPA axis: Early life decides.</a> Stress (Amsterdam, Netherlands). , (2011).</li><li>Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Buklijas, T., Low, F. M., Beedle, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+that+underpin+metabolic+and+cardiovascular+diseases.">Epigenetic mechanisms that underpin metabolic and cardiovascular diseases.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 5, 401-408 (2009).</li><li>Murgatroyd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+DNA+methylation+programs+persistent+adverse+effects+of+early-life+stress.">Dynamic DNA methylation programs persistent adverse effects of early-life stress.</a> Nat. Neurosci. 12, 1559-1566 (2009).</li><li>Murgatroyd, C., Wu, Y., Bockm&#252;hl, Y., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+learn+from+stress:+How+infantile+trauma+programs+us+for+depression.">Genes learn from stress: How infantile trauma programs us for depression.</a> Epigenetics. 5, (2010).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact: The Coronal Plates and Diagrams: Compact. The Coronal Plates and Diagrams. , (2008).</li><li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics.">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC research notes. 4, 314 (2011).</li><li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Reed, K., Poulin, M. L., Yan, L., Parissenti, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+bisulfite+sequencing+PCR+with+pyrosequencing+for+measuring+differences+in+DNA+methylation.">Comparison of bisulfite sequencing PCR with pyrosequencing for measuring differences in DNA methylation.</a> Anal. Biochem. 397, 96-106 (2010).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Epigenetischen Programmierung wird zunehmend als wichtiger Mechanismus zugrunde liegen, Gesundheit und Krankheit anerkannt. Hier präsentieren wir eine verfeinerte Methode zur simultanen Isolierung von DNA und RNA aus micropunches und die nachfolgenden Schritte, um DNA-Methylierungs-Profile durch Bisulfit-Sequenzierung zu erhalten. Der optimierte Workflow ermöglicht eine bequeme Analyse der epigenetischen Programmierung im Gehirn als Reaktion auf Reize aus der Umwelt. Darüber hinaus ermöglicht dieser Ansatz für die Untersuchung von den funktionalen Zusammenhang zwischen DNA-Methylierung und Genexpression sowohl aus derselben Probe analysiert. Schließlich kann der Tiernummer für das Experiment benötigten signifikant reduziert werden. Bestimmte Vorsichtsmaßnahmen und Richtlinien zu befolgen, während Sie die Workflow vorgestellt werden. Angesichts der außerordentlichen Komplexität und Heterogenität des Gehirns und da-Methylierung und Expression kann in einem Zell-und Gewebe-spezifische Weise zu variieren ist es von größterwichtig, dass micropunching in einer standardisierten Art und Weise durchgeführt. Als Beispiel hierfür wird epigenetische Programmierung von AVP in der paravaventriuclar nachgewiesen, aber nicht im Nucleus supraopticus (4b-d), Expression zweier Avp Regionen des Hypothalamus 4. In dieser Hinsicht ist die Verfügbarkeit von DNA und RNA aus der gleichen Gewebestanze vorteilhaft, da RNA Expression bestimmter Gewebe-spezifischen Markergene kann in einigen Fällen verwendet werden, zu bestätigen, dass der richtige Bereich gestanzt wurde. Obwohl micropunching zellulären Heterogenität reduzieren kann, ist zu bedenken, dass dieser Ansatz nicht auf die Isolierung einzelner Zelltypen oder Populationen führen kann. Zusätzliche Reinigung Schritte könnten erwogen werden, um dieses Thema anzugehen. Für eine optimale Bisulfit-Sequenzierung Primer-Design für die PCR-Amplifikation folgenden Bisulfit-Behandlung ist unerlässlich. PCR-Produkte von mehr als 400 bp Länge kann problematisch sein, infolge des Abbaus von DNA durch bisulfite Behandlung. Es sollte auch beachtet werden, dass nested PCR kann verzerrten Ergebnissen führen, wenn nur noch wenige intakte Vorlagen zur Verstärkung beitragen. Primerpaare, die spezifisch für das modifizierte Amplikon sind gestaltet werden sollte, ihre Sequenzen sollten keine CpG-Dinukleotide, um Methylierung vorgespannte Verstärkung zu vermeiden. Darüber hinaus sollte Primer enthalten nicht-CpG Cytosine um die Amplifikation von nicht modifizierten oder nicht vollständig umgesetzte DNA zu verhindern. Verstärkung von einigen Vorlagen kann von der Durchführung von Hot-Start PCR profitieren. In jedem Fall sollte die Eignung von Primerpaaren in Pilot-Experimente verifiziert werden, so Verderb von wertvollen experimentellen Proben zu verhindern. Bisulfit-Sequenzierung stellt eine Standardmethode für die ortsspezifische Methylierungsanalyse, wie es in der Lage, zuverlässig und präzise erkennen die Methylierung von CpG einzigen Rückstände in einer Allel-spezifischen Art und Weise 8 ist. Direkte Sequenzierung des PCR-Produkt wird nicht als gemischte Methylierung o empfohlenfa CpG Rest wird als C / T Doppel-Peak im Elektropherogramm, die Quantifizierung der Methylierung am betreffenden Standort kann verhindern, erscheinen. Aus diesem Grund eine Zwischenschicht Klonierung durchgeführt wird, und mehrere Klone sequenziert (~ 20-30), um das Ausmaß der Methylierung zu bestimmen. Pyrosequenzierung stellt eine alternative Methode zur Quantifizierung von DNA-Methylierung. Außerdem verwendet Bisulfitumwandlung und Bisulfit PCR sondern der Klonierung und Sequenzierung das Amplifikat, um eine direkte Reaktion, bei der Pyrosequenzierung der Methylierungsstatus einer CpG-Rest als C / T Einzel-Nukleotid-Polymorphismus, der leicht quantifiziert werden kann gelesen werden, unterzogen wird. Beide Methoden ermitteln ähnliches Ausmaß an Methylierung 9, aber da das Klonen-Schritt kann übersprungen werden Pyrosequenzierung ist zeiteffizienter. In Abhängigkeit von der Vorlage nur 40 bis 100 Nukleotide auf einmal sequenziert werden, so dass mehrere Runden der Pyrosequenzierung mit unterschiedlichen Sequenzierprimer erforderlich sind. Dies ist eine kritische Begrenzung, da that höhere Mengen an DNA (ca. 1 pg pro Reaktion) benötigt, was absehbar über die Beträge zur Verfügung, von winzigen Hirngewebe Schläge. So anfängliche Abtasten der Regionen im Bereich von mehreren Kilobasen von Pyrosequenzierung scheint weniger geeignet als einzigen Klon Lesen. Dennoch sollte nach der Identifizierung von einem kleinen Bereich von Interesse Pyrosequenzierung betrachtet werden. Insgesamt bietet der oben beschriebenen Protokoll eine genaue, effiziente und optimierte Ansatz für die schnelle und kostengünstige Analyse von Gehirn micropunches für epigenetische Veränderungen. Mehrere Proben können in einem einzigen Durchlauf verarbeitet werden und die Verfahren sind geeignet, wenn der Analyse von Proben von mittlerer Größe Experimenten.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> DNeasy Blood &amp; Tissue Kit </td><td> Qiagen </td><td> 69506 </td></tr><tr><td> NucleoSpin RNA II </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740.955,50 </td></tr><tr><td> EpiTect Bisulfite Kit </td><td> Qiagen </td><td> 59104 </td></tr><tr><td> NucleoSpin Extract </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740.609,50 </td></tr><tr><td> pGEM-T Vector Cloning Kit </td><td> Promega </td><td> A3600 </td></tr><tr><td> Nucleofast 96 </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 743.100,50 </td></tr><tr><td> Montage 96 Sequencing Clean-Up </td><td> Millipore </td><td> LSK09624 </td></tr><tr><td> HotStar Taq-Polymerase </td><td> Qiagen </td><td> 203203 </td></tr><tr><td> Taq-Polymerase </td><td> Fermentas </td><td> EP0401 </td></tr></tbody></table>

optimized analysis of dna methylation and gene expression from small, anatomically-defined areas of the brain

Die Exposition gegenüber Diät, können Medikamente und frühes Leben Widrigkeiten während der sensiblen Fenstern des Lebens 1,2 zu nachhaltigen Veränderungen in der Genexpression, die zur Darstellung von physiologischen und Verhaltens-Phänotypen beitragen führen. Solche Umwelt-Programmierung geeignet ist, die Anfälligkeit für Stoffwechsel-, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und psychische 3,4 zu erhöhen. DNA-Methylierung und Histon-Modifikationen sind wichtige Prozesse in der Vermittlung der Gen-Umwelt-Dialog berücksichtigt und erscheinen auch auf Umwelt-Programmierung zu unterlegen 5. Bei Säugetieren, DNA-Methylierung in der Regel umfasst die kovalente Addition einer Methylgruppe an der 5-Position von Cytosin im Kontext der CpG Dinukleotide. CpG methyliert in einem hoch-Gewebe und Zell-spezifischen Weise so dass es eine Herausforderung, um diskrete, kleine Regionen des Gehirns, wo zellulären Heterogenität ist hoch und Gewebe Menge beschränkt zu studieren. Darüber hinaus beil Genexpression und Methylierung eng miteinander verknüpft Ereignisse, können erhöhte Wert durch den Vergleich beider Parameter in der gleichen Probe gewonnen werden. Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll (Abbildung 1) für die Untersuchung der epigenetischen Programmierung im Gehirn präsentiert mit der &quot;mütterlichen Trennung &#39;Paradigma der frühen Leben Widrigkeiten zu illustrativen Zwecken. Das Protokoll beschreibt die Herstellung von micropunches von differentiell Alters Mäusehirnen, aus denen DNA und RNA gleichzeitig isoliert werden können, so dass DNA-Methylierung und Genexpressionsanalysen in der gleichen Probe.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain at JoVE.com

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Ein optimierter Workflow, um DNA-Methylierung und Veränderungen der Genexpression auf Early-Stress Leben zu studieren gezeigt wird. Ausgehend von mütterlicher Trennung von neugeborenen Mäusen und Isolierung von diskreten Hirngewebe, vertreten wir ein Protokoll, um gleichzeitig zu isolieren DNA und RNA aus Hirngewebe Schläge für nachfolgende Bisulfit-Sequenzierung und RT-PCR-Analyse.

Optimierte Analyse von DNA-Methylierung und Genexpression von Klein, Anatomisch-definierte Bereiche des Gehirns

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

optimized-analysis-dna-methylation-gene-expression-from-small

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.6K Aufrufe.  Max Planck Institute of Psychiatry. Ein optimierter Workflow, um DNA-Methylierung und Veränderungen der Genexpression auf Early-Stress Leben zu studieren gezeigt wird. Ausgehend von mütterlicher Trennung von neugeborenen Mäusen und Isolierung von diskreten Hirngewebe, vertreten wir ein Protokoll, um gleichzeitig zu isolieren DNA und RNA aus Hirngewebe Schläge für nachfolgende Bisulfit-Sequenzierung und RT-PCR-Analyse.

Serie: Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Spinal Cord Elektrophysiologie II: Extrazelluläre Saugelektrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

Isolating Nasal Olfaktorische Stammzellen von Nagetieren oder Menschen

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

Hochauflösende Live-Bildgebung von Zell-Verhalten in der Entwicklung von Neuroepithel

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the function of various brain regions for behavior or other experimental outcomes is to implement a localized ablation of function. In humans, patient populations with localized brain lesions are often studied for deficits, in hopes of revealing the underlying function of the damaged area. In rodents, one can experimentally induce lesions of specific brain regions.
Lesion can be accomplished in several ways. Electrolytic lesions can cause localized damage but will damage a variety of cell types as well as traversing fibers from other brain regions that happen to be near the lesion site. Inducible genetic techniques using cell-type specific promoters may also enable site-specific targeting. These techniques are complex and not always practical depending on the target brain area. Excitotoxic lesion using stereotaxic surgery, by contrast, is one of the most reliable and practical methods of lesioning excitatory neurons without damaging local glial cells or traversing fibers.
Here, we present a protocol for stereotaxic infusion of the excitotoxin, N-methyl-D-aspartate (NMDA), into the basolateral amygdala complex. Using anatomical indications, we apply stereotaxic coordinates to determine the location of our target brain region and lower an injection needle in place just above the target. We then infuse our excitotoxin into the brain, resulting in excitotoxic death of nearby neurons. While our experimental subject of choice is a rat, the same methods can be applied to other mammals, with the appropriate adjustments in equipment and coordinates.
This method can be used on a variety of brain regions, including the basolateral amygdala1-6, other amygdala nuclei6, 7, hippocampus8, entorhinal cortex9 and prefrontal cortex10. It can also be used to infuse biological compounds such as viral vectors1, 11. The basic stereotaxic technique could also be adapted for implantation of more permanent osmotic pumps, allowing more prolonged exposure to a compound of interest.

Targeted ablation of specific brain region(s) by infusion of an excitotoxin using stereotaxic coordinates is described. This technique could also be adapted for infusion of other chemicals into the rat brain.

Stereotaktischen Chirurgie für Exzitotoxische Läsion Spezifische Hirnareale in der erwachsenen Ratte

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Laser Capture Mikrodissektion von Angereichert Populationen von Neuronen oder Single Neurons zur Genexpressionsanalyse Nach Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Mikromanipulation der Genexpression in der Erotik-Zebrafischgehirn Mit cerebroventricular Mikroinjektion von Morpholino Oligonukleotiden

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

RNA-Seq Analyse der differentiellen Genexpression in elektroporiertem Küken Embryonale Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective treatment for several movement disorders that have failed to respond to medication. Recent progress in the field of DBS surgery has begun to extend the application of this surgical technique to other conditions as diverse as morbid obesity, depression and obsessive compulsive disorder. Despite these expanding indications, little is known about the underlying physiological mechanisms that facilitate the beneficial effects of DBS surgery. One approach to this question is to perform gene expression analysis in neurons that receive the electrical stimulation. Previous studies have shown that neurogenesis in the rat dentate gyrus is elicited in DBS targeting of the anterior nucleus of the thalamus1. DBS surgery targeting the ATN is used widely for treatment refractory epilepsy. It is thus of much interest for us to explore the transcriptional changes induced by electrically stimulating the ATN. In this manuscript, we describe our methodologies for stereotactically-guided DBS surgery targeting the ATN in adult male Wistar rats. We also discuss the subsequent steps for tissue dissection, RNA isolation, cDNA preparation and quantitative RT-PCR for measuring gene expression changes. This method could be applied and modified for stimulating the basal ganglia and other regions of the brain commonly clinically targeted. The gene expression study described here assumes a candidate target gene approach for discovering molecular players that could be directing the mechanism for DBS.

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Die Analyse der Genexpression Veränderungen im Hippocampus Ratte nach Tiefenhirnstimulation des Anterior Thalamuskern

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Vorbereitung der akuten Gehirnscheiben mit einem optimierten N-Methyl-D-Glucamine-schützende Recovery-Methode

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...