1. Dish Vorbereitung <ol><li> Geschirr für Stück Kultur verwendet werden, sind mit Glasboden (mit einem Deckglas als Basis) (Willco Gerichte). Diese basieren auf Linsengewebe in einer 6 cm Gewebekulturschale zu halten Glasboden sauber platziert. </li><li> Am Tag vor dem Experiment, 2 ml 0,1% Poly-L-Lysin-Lösung für den Glasboden Schüssel und Inkubation für 5min bei Raumtemperatur, damit das Poly-L-Lysin zur Beschichtung der Glasboden. </li><li> Entfernen Poly-L-Lysin-Lösung und spülen Sie drei Mal in vollentsalztem Wasser, und dann noch einmal in 70% Ethanol. </li><li> Lassen Sie über Nacht trocknen. Geschirr kann auch durch leichtes Erwärmen in der Mikrowelle bei niedriger Leistung für 30-45 Sekunden getrocknet werden. </li></ol> 2. Embryo Elektroporation <ol><li> Eier inkubieren bei 37 ° C zu Hamburger-Hamilton (HH) Stufe 10 (~ 36 Stunden) (oder einem anderen gewünschten Stufe). </li><li> Vor Beginn der Vorbereitung Glasnadeln (wir verwenden eine Flaming / Brown-Modell p87 Mikrokapillare Abzieher) und brechen Sie die Spitze des needle mit einer feinen Pinzette unter einem Binokular. Das Ende der Nadel sollte scharf genug zu durchbohren der Embryo zwar nicht so eng, dass es der Injektion des DNA-Lösung behindert. </li><li> Fenster Eier und Ort Elektroden (5mm Abstand) auf beiden Seiten des Embryos </li><li> Inject DNA (~ 0,025 bis 0,5 ug / ul in VE-Wasser mit einer geringen Menge schnell grün eingefärbt) in das Neuralrohr. </li><li> Tragen Sie aktuelle - 12-17 V dreimal, 50ms Pulslänge mit 950 ms zwischen den Impulsen. </li><li> Wir verwenden niedrigen Konzentrationen von DNA und niedrigen Spannungen an Elektroporation Mosaik Expression zu erreichen, so dass wir einzelnen Zellen zu folgen. </li><li> Cover Fenster in der Eierschale mit Klebeband und sicherzustellen, dass es dicht ist. </li><li> Erlauben Embryonen für 3-4 Stunden oder über Nacht bei 37 ° C erholen </li></ol> 3. Collagen und Slice-Kulturmedium Vorbereitung <ol><li> Bereiten Collagen-Mix und in Scheiben schneiden Kulturmedium etwa eine Stunde vor dem Schneiden. </li><li> Zu 300 ul typ 1-Kollagen mit 100 ul 0,1% Essigsäure-Lösung und 100 ul 5 x L15 Medium. Vortex gründlich nach jeder Zugabe. Die Lösung sollte gelb werden. </li><li> Fügen Sie nun 15-20 ul 7,5% Natriumbicarbonat und gründlich vortexen. Die Lösung sollte leicht rosa geworden, und das Volumen von Natriumbicarbonat dafür benötigten können abweichen. Halten Sie auf dem Eis und machen jedes Mal frisch. </li><li> Zu 10 ml Neurobasalmedium hinzufügen B-27 Ergänzung und Glutamax, zu einem 1 x Endkonzentration und 10 ul Gentamicin-Lösung. </li><li> Ort Medium in einem 37 ° C Inkubator gepuffert mit 5% CO 2. Lassen Sie die Oberseite des Behälters locker, damit es mit dem CO 2 ausgleichen. </li></ol> 4. Slice-Kultur <ol><li> Entfernen Embryonen aus Ei und waschen in L15 Medium. </li><li> In eine Gewebekulturschale mit einer Schicht aus Sylgard an der Unterseite und stecken Sie sie durch die umliegenden extra-embryonalen Membranen, so dass sie straff gespannt sind. </li><li> Mit einem Mikrofonroknife, Slice Embryo so gerade wie möglich durch Region von Interesse. Für die Wirbelsäule, sollte Scheiben zwischen 1-2 Somiten dick sein. Lassen Sie Scheiben, die an Embryo, während Sie andere Embryonen, so dass Sie nicht verlieren, sie zu schneiden. </li><li> Bereiten Sie eine 200 pl Mikropipettenspitze durch Abschneiden ~ 1 mm von der Spitze und Anbringen dieser auf eine P2-oder P10. Dieser Tipp wird verwendet, um die Wirbelsäule Scheiben an den Glasboden Gericht übertragen werden. Ein 10 ul Spitze ist nicht breit genug, um abholen Scheiben schneiden. </li><li> Bestreichen Sie die Innenseite der Spitze mit Kollagen durch Pipettieren 1 ul Collagen-Mix vorbereitet früher. Verlassen Sie für 1-2 Minuten und dann spülen mit L15 Medium. Dies wird das Gewebe Kleben an der Innenseite der Spitze zu verhindern. </li><li> Nehmen Scheibe von Embryo mit Hilfe eines microknife und entfernen aus der Schale mit einem P2 oder P10 mit einer 200 ul Spitze versehen und auf 1 pl. Versuchen Sie, mit möglichst wenig Medium wie möglich. </li><li> Vortex das Kollagen Mischung Drop 5-8 ul diese an das Poly-L-Lysin beschichtete Schale. </li><li> ImmediaTely setzen Embryo Scheibe in Kollagen und Position in Stelle mit einer feinen Pinzette. Scheiben sollten so positioniert, dass die Seite, die abgebildet werden bündig mit dem Deckglas ist. Das Gewebe sollte der Poly-L-Lysin-Beschichtung auf dem Deckglas haften. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis Sie einige Scheiben auf dem Deckglas zu haben. Wir können in der Regel 6-9 legen Scheiben auf einem Teller. </li><li> Nachdem alle Scheiben vorhanden sind, decken Sie die Schüssel und lassen Sie das Kollagen zu 20 Minuten eingestellt. Einige der frühesten angeordnet Kollagen kann bereits begonnen haben zu trocknen. Um dies zu verhindern eine kleine Menge von L15, diese vor abdeckt. </li><li> Einmal eingestellt, vorsichtig 2ml Scheibe Kulturmedium, das äquilibriert wurde in 5% CO 2 bei 37 ° C für mindestens eine Stunde. Es ist darauf zu verdrängen nicht das Kollagen aus dem Deckglas werden. </li><li> Platz in einem 37 ° / 5% CO 2-Inkubator und erlauben Scheiben für mindestens 3 Stunden vor der Bildgebung zu erholen. Wenn es keine Feuchtigkeit, statt Schüssel in einer Plexiglas-Box Witzha bisschen feuchten Papiertüchern in einer Ecke. </li></ol> 5. Imaging Embryo Scheiben <ol><li> Wir verwenden eine DeltaVision Core-wide-field-Mikroskop mit einem WeatherStation Klimakammer zu Bildschnitten ausgestattet. Die Kammer wird konstant auf 37 ° C, mit einem CO 2-Perfusion Vorrichtung gehalten, um die Mikroskoptisch bei 5% CO 2/95% Luft zu halten. </li><li> Imaging wird in der Regel mit einem 40-x / 1,30 NA Ölimmersionslinse und Bilder sind mit einem CoolSnap HQ2 eingefangen gekühlte CCD-Kamera durchgeführt. </li><li> Z-Profile werden alle 1,5 um bis 45 um Gewebe eingefangen. Belichtungszeit sollte so niedrig wie möglich gehalten werden. Wir in der Regel für 5 bis 50 ms aussetzen für jeden Z-Abschnitt. Die Bilder werden alle 7 Minuten gefangen genommen und bis zu 9 Scheiben können besichtigt Verwendung des Systems DeltaVision genauen Punkt zu besuchen Funktion sein. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel Zeitraffer-Sequenz des Rückenmarks Progenitorzellen istgezeigt in. 2a und entsprechenden Movie 1. Imaging wurde auf einer Rückenmark Slice aus einer zwei Tage alten (HH Stadium 12) Embryo begonnen. Diese Zelle wurde mit einem Konstrukt, die GFP-αTubulin transfiziert. Während dieser frühen Phase durchlaufen neuronale Vorläuferzellen überwiegend Vorläuferzellen-Vorläuferzellen Modus Divisionen, während der die Zellen sich teilen, um zwei weitere Rad-Vorläuferzellen zu erzeugen. Abb. 2b und entsprechende Film 2 zeigt eine Zelle mit GFP-GPI (GPI-verankerten GFP) transfiziert, Kennzeichnung der Zellmembran. Diese Zelle erfährt eine Spaltung, während der die basalen Prozess spaltet sich in zwei und sind zu gleichen Teilen an die Tochterzellen vererbt. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig1.jpg" /> Abbildung 1. Slice-Kultur-Protokoll für Zeitraffer-Bildgebung. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig2.jpg" /> Abbildung 2. Zelle behavior während der normalen Entwicklung des Rückenmarks. (a) ausgewählte Bilder aus Film 1. Zelle, die GFP-Tubulin unterteilt mit einer Schnittstelle Ebene, die senkrecht zu der apikalen Oberfläche (2 h 20 min), Erzeugen von zwei Tochterzellen, die wieder (24 h 23 min und 25 h 54 min) zu unterteilen. (B) ausgewählte Bilder aus Movie 2. Zelle mit GFP-GPI transfiziert erfährt die Zellteilung, während der die basalen Prozess aufgeteilt (weiße Pfeile) und wird zu gleichen Teilen von den Tochterzellen vererbt. Movie 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">Hier klicken, um Film anzusehen</a> . Movie 2. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">Hier klicken, um Film anzusehen</a> .

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	<li>Ulloa, F., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogens+and+the+Control+of+Cell+Proliferation+and+Patterning+in+the+Spinal+Cord.">Morphogens and the Control of Cell Proliferation and Patterning in the Spinal Cord.</a> Cell Cycle. 6, 2640-2649 (2007).</li><li>Briscoe, J., Novitch, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+pathways+linking+progenitor+patterning,+cell+fates+and+neurogenesis+in+the+ventral+neural+tube.">Regulatory pathways linking progenitor patterning, cell fates and neurogenesis in the ventral neural tube.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363, 57-70 (2008).</li><li>Shiau, C., Das, R., Storey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+effective+assay+for+high+cellular+resolution+time-lapse+imaging+of+sensory+placode+formation+and+morphogenesis.">An effective assay for high cellular resolution time-lapse imaging of sensory placode formation and morphogenesis.</a> BMC Neuroscience. 12, 37 (2011).</li><li>Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+orientation+distinguishes+stem+cell+and+terminal+modes+of+neuron+production+in+the+early+spinal+cord.">Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord.</a> Development. 134, 1943-1954 (2007).</li><li>Vilas-Boas, F., Fior, R., Swedlow, J. R., Storey, K. G., Henrique, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+reporter+of+notch+signalling+indicates+regulated+and+random+notch+activation+during+Vertebrate+neurogenesis.">A novel reporter of notch signalling indicates regulated and random notch activation during Vertebrate neurogenesis.</a> BMC Biology. 9, 58 (2011).</li><li>Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Bios Scientific Publishers. , (1998).</li><li>Conchello, J. -. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+microscopy.">Optical sectioning microscopy.</a> Nat. Meth. 2, 920-931 (2005).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental Limits in Confocal Microscopy Handbook Of Biological Confocal. , (2006).</li><li>Swedlow, J. R., Hu, K., Andrews, P. D., Roos, D. S., Murray, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+tubulin+content+in+Toxoplasma+gondii:+A+comparison+of+laser-scanning+confocal+and+wide-field+fluorescence+microscopy.">Measuring tubulin content in Toxoplasma gondii: A comparison of laser-scanning confocal and wide-field fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 2014-2019 (2002).</li><li>Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. 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U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging:+Opportunities,+limitations,+and+challenges.">Fluorescent proteins for live cell imaging: Opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir stellen Ihnen hier eine neue Zeitraffer-Imaging-Test des Verhaltens von Zellen in Hühner-Embryonen Hirnschnittmodell überwachen. Dieser Assay ermöglicht die hochauflösende Bildgebung von lebendem Gewebe für bis zu 70 Stunden, obwohl Zeitrahmen zwischen 24-48 Stunden leichter zu erfassen sind. Die Verwendung eines hohen NA Öl-Objektiv und relativ kurzen Abständen zwischen Zeit-Punkte ermöglicht Bildaufnahme mit hoher Auflösung, sowie es uns ermöglicht, das Verhalten der Zelle, die oft auftreten rasch zu überwachen, und kann einfach während herkömmliche Zeitraffer-Bildgebung mit Hilfe der konfokalen entgehen lassen Mikroskopie. Der große Vorteil dieses Tests ist die Fähigkeit, Bildzellen über lange Zeiträume. Die Verwendung von Weitwinkel-6 statt konfokalen Laser Scanning Mikroskopie 7 ist von entscheidender Bedeutung für diese. Die konfokale Mikroskopie ist traditionell mehrere Vorteile gegenüber Weitfeld-Mikroskopie angeboten, einschließlich der Möglichkeit, optische Schnitte zu nehmen und zu beseitigen unscharf Informationen direkt <sup&gt; 7, aber die Verwendung einer Lochblende führt zu einem Verlust von Licht zu dem Detektor 8, ohne eine signifikante Menge an Information, und es muss längere Belichtungszeiten. Weitwinkel-Mikroskopie, auf der anderen Seite, verwendet volle Hellfeldbeleuchtung und alle das Licht, das durch das Objektiv mit dem Detektor gesandt. Dies gepaart mit einer hohen Quanteneffizienz gekühlt Coupled Device (CCD)-Kamera sorgt für Bildgebung mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zu konfokalen Mikroskopie 9, mit sehr schnellen Belichtungszeiten. In unserer Anwendung müssen wir die Grafik für eine längere Zeit, Rekord 3D-Stacks und letztlich zu lösen kleine Beinahe-beugungsbegrenzte Strukturen. Obwohl der konfokalen Mikroskopie wird verhindert, out-of-focus Licht aus immer den Detektor erreicht und damit deutlich reduziert Hintergrundgeräusche in dicken, dicht-markierten Proben 7, 8, es werde nur ein brauchbares Signal-Rausch-Verhältnis mit viel größeren Licht-Eingang als breit- Mikroskopie 10. Für sehr lichtempfindlich sparsely-markierten Proben wie unsere elektroporierte Rückenmark Scheiben, deshalb führt Weitfeldmikroskopie besser als der konfokalen Mikroskopie. Wenn es mit Image-Wiederherstellung durch Entfaltung kombiniert, entfernt die Informationen aus dem Fokus und verbessert den Kontrast, wide-field ist dann besonders gut für die Erfassung von kleinen, dunklen Objekten 11. Während nicht für jede Tissue Imaging Experiment wurde dieser Ansatz als sehr wirksam für unsere Live Cell Imaging Anwendung. Die Wahl der fluoreszierende Protein ist ein wichtiger Faktor, der das Überleben der Zelle zu beeinflussen kann. Wir finden, dass die besten Ergebnisse, Konstrukte, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) 12 zu verwenden als Marker erhalten. Wir prüfen derzeit eine Reihe von rot fluoreszierende Proteine, die effektiv in Kombination mit GFP für Dual-Channel-Zeit erlischt, kann verwendet werden. Es gibt eine Vielzahl solcher Proteine ​​verfügbar 13. Obwohl viele Proteine ​​sind als Fusionen mit einem fluoreszierenden Protein stabilKönnen einige Proteine ​​unstabil gemacht werden durch Schmelzen, was zu einer verringerten Lebensfähigkeit der Zellen. In solchen Fällen ist die Verwendung von Konstrukten, die eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) nützlich, um das Protein von Interesse aus dem fluoreszierenden Protein zu trennen. Bei der Darstellung des Rückenmarks Scheiben, muss darauf geachtet werden, um die Exposition gegenüber Fluoreszenzlicht zu minimieren. Die Mikroskop-Okulare dürfen nur mit Durchlicht (Hellfeld) verwendet werden, zu lokalisieren und zu Position Scheiben schneiden. Fluoreszierende Bilder sollten immer aufgenommen mit der Mikroskop-Software mit minimalen Belichtungszeiten werden. Diese sollten in dem Bereich von 5-50 ms gehalten werden und die Verwendung von Neutralfilter sollte experimentiert werden. Obwohl längere Belichtungszeiten produzieren kann zunächst klarere Bilder, so können die phototoxische Effekte von Fluoreszenzlicht Exposition zum Zelltod führen. Die ersten 5-10 um Gewebe, das auf das Deckglas am nächsten ist nicht abgebildet, wie diese Region enthält Gewebe, das während geschädigt worden sein werdenSlicing. Obwohl die hier vorgestellten Beispiele von Embryonen bei HH Stadium 10 und abgebildeten 6-7 Stunden später elektroporiert sind, kann diese Methode für Embryonen verwendet werden, bis zu Stufe 18 HH. In späteren Stadien ist das Gewebe des Rückenmarks viel größer und so schwierig ist, von Hand zu schneiden. In diesen Fällen kann das Einbetten der Embryonen in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt und Schneiden mit einem Vibratom zu besseren Ergebnissen. Obwohl wir diesen Test zu präsentieren als Verfahren zur Abbildung von Zellen im sich entwickelnden Rückenmark, hat dieser Ansatz auch auf andere Bild embryonalen Geweben, einschließlich der sensorischen Plakoden 3 geändert worden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Willco Dish </td><td> Willco Wells </td><td> GWst-3522 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-Lysin </td><td> Sigma </td><td> P8970 </td><td> 0,1% Tris </td></tr><tr><td> Borosilikatglas Kapillaren </td><td> Harvard Instruments </td><td> GC100-10 </td><td> 1,0 mm Außendurchmesser, 0,58 mm Innendurchmesser </td></tr><tr><td> Elektroden (Genetrodes in ovo, L-förmigen </td><td> BTX </td><td> 10-001850-01 </td><td> 5mm vergoldet </td></tr><tr><td> ECM 830 Quadratmeter Impulsgeber </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td> für die in ovo electroopration </td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> Sigma </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> Typ I-Kollagen-Ratte </td><td> Sigma </td><td> C3857 </td><td></td></tr><tr><td> L-15-Medium (Pulver) </td><td> Sigma </td><td></td><td> 2,76 g / L in destilliertem Wasser für 5-fach-Lösung </td></tr><tr><td> Natriumbicarbonat </td><td> Sigma </td><td> S8761 </td><td> 7,5% ige Lösung </td></tr><tr><td> Neurobasalmedium </td><td> Invitrogen </td><td> 12348-017 </td><td> ohne Phenolrot </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> A1286001 </td><td> 100x-Lösung </td></tr><tr><td> B-27 Ergänzung </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> Invitrogen </td><td> 15710049 </td><td> 10 mg / ml </td></tr><tr><td> L15 Medium (Flüssigkeit 1x) </td><td> Invitrogen </td><td> 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Microknife </td><td> Altomed </td><td> A10102 </td&gt; <td> 15 Grad Neigung </td></tr><tr><td> Edelstahl-Gewindestifte </td><td> Watkins und Doncaster </td><td> E6871 </td><td> Format DIN A1 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Elastomer </td><td> VWR </td><td> 634165S </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision Core-Mikroskop-System </td><td> Applied Precision </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coolsnap HQ2 CCD-Kamera </td><td> Photometrics </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

high-resolution live imaging of cell behavior in the developing neuroepithelium

Die embryonale Rückenmark besteht aus Radfahren neuronale Vorläuferzellen, die Anlass zu einem großen Prozentsatz der neuronalen und glialen Zellen des zentralen Nervensystems (ZNS). Obwohl viel über die molekularen Mechanismen, die Muster des Rückenmarks bekannt ist und entlocken neuronalen Differenzierung 1, 2, fehlt uns ein tiefes Verständnis dieser frühen Ereignisse auf der Ebene des Verhaltens von Zellen. Es ist daher wichtig, das Verhalten der neuralen Vorläuferzellen in Echtzeit zu untersuchen, wie sie Neurogenese unterzogen. In der Vergangenheit Echtzeit-Bildgebung von frühen embryonalen Gewebe durch Zellen / Gewebe Lebensfähigkeit in Kultur als auch die phototoxische Effekte von Fluoreszenz-Bildgebung beschränkt. Hier präsentieren wir eine neuartige Assays für die Bildgebung solche Gewebe für längere Zeit, die Verwendung eines neuartigen Ex-vivo-Kokultur-Protokoll und Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie (Abb. 1). Dieser Ansatz erzielt langfristige Zeitraffer-Überwachung von Kükenembryonen sPinal Schnur Progenitorzellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Dieser Assay modifiziert werden, um Bild eine Reihe von embryonalem Gewebe 3, 4 Neben der Beobachtung von zellulären und subzellulären Verhaltensweisen, die Entwicklung von neuartigen und hochsensiblen Reporter-Gen-Aktivität werden (z. B. Notch 5) macht diesen Test ein leistungsstarkes Tool, mit dem zu verstehen, wie Signalweg reguliert das Verhalten der Zelle während der embryonalen Entwicklung.

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High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Imaging embryonalem Gewebe in Echtzeit wird über längere Zeit eine Herausforderung. Hier präsentieren wir Ihnen einen Test zur Überwachung der zellulären und subzellulären Veränderungen im Rückenmark Küken für längere Zeit mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Diese Technik kann für andere Regionen des Nervensystems und sich entwickelnden Embryo angepasst werden.

Hochauflösende Live-Bildgebung von Zell-Verhalten in der Entwicklung von Neuroepithel

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

high-resolution-live-imaging-cell-behavior-developing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.2K Aufrufe.  University of Dundee, Dundee, UK. Imaging embryonalem Gewebe in Echtzeit wird über längere Zeit eine Herausforderung. Hier präsentieren wir Ihnen einen Test zur Überwachung der zellulären und subzellulären Veränderungen im Rückenmark Küken für längere Zeit mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Diese Technik kann für andere Regionen des Nervensystems und sich entwickelnden Embryo angepasst werden.

Serie: High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Zeitraffer-Live-Imaging von klonal verbundenen neuronalen Vorläuferzellen in der Entwicklung von Zebrafisch Vorderhirnneuronen

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Forschung

Neurowissenschaften

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

Hochauflösende Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Mittelhirn

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo Live-Imaging von Single Cell Divisionen in Maus Neuroepithel

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

Hohe Auflösung<em&gt; In-vivo-</em&gt; Manuelle Segmentierung Protokoll für Menschen Hippocampus Teilfelder Verwenden von 3T Kernspintomographie

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Ein Verfahren für die Implantation eines Spinal Kammer für Längs<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging der Maus Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Live-Imaging von Nikotin induzierte Calcium Signaling und Neurotransmitterausschüttung Zusammen Ventral Hippocampus Axone

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

Hochauflösende Strukturkernspintomographie des menschlichen Subcortex<I&gt; In-vivo-</I&gt; Und Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

Hochaufgelöste Quantifizierung der Geruchsgelenkten Verhalten in<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Verwenden der<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Hochauflösende Quantitative Immungold-Analyse von Membranrezeptoren auf der Netzhaut Ribbon Synapsen

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...