Autoren danken Herrn Dr. Andre Walder und Nicolas Perrin für die Herstellung von Titan-Implantaten, K. Benmlih für den Aufbau der Teflonformen und Dr. G. Prevost danken für seine Hilfe bei Tierversuchen. Wir erkennen auch die Region Elsass und PMNA (Pole Materiaux et Nanowissenschaften d&#39;Alsace) für eine finanzielle Beteiligung.

1. Herstellung von Micropore Farbverläufe in Makroporöse metallischen Implantaten <ol><li> Reinigen der Implantate (z. B. Implantaten aus medizinischem Titan Perlen mit einem Größenbereich von 400-500 um, Neyco SAS, Frankreich hergestellt) mit Ethanol und dann beschallt in Aceton für 15 min. </li><li> Entwurf und Herstellung Teflonformen nach dem Implantat Größe und Form (Standardfunktionen Experimente, zylindrische Formen von 1,5 cm Durchmesser mit einer Höhe von 2 cm verwendet werden). Formen sollte modular, so dass die bestimmten Teile während der Extraktion entfernt werden. Eine solche Form Design sorgt für die Steuerung der Extraktion durch Erzwingen der Bewegung der Extraktionsflüssigkeit in einer gerichteten Art und Weise. </li><li> I) einen unteren Teil, um die Größe des Implantats zu bestimmen ii) ein Dorn und iii) einen äußeren Kern, der abnehmbar ist: für röhrenförmige Implantate zur Luftröhre zu ersetzen, sollte die Struktur aus drei Teilen zusammengesetzt sein. Auf diese Weise kann die Porengröße Gradienten von außen nach innen gebildet werden. </li> &lt;li&gt; Vorbereiten des synthetischen Polymer (PLLA)-Lösung: Für die Gefrier / Extraktion PLLA Lösung in einer binären Mischung aus Dioxan und Wasser (: v 87:13%, v) hergestellt werden muss. </li><li> Das Gemisch wird auf 60 ° C, um eine homogene Lösung zu erhalten. 60 ° C ausgewählt, da es die obere Grenze der Temperatur Widerstand für die KPG-Spritzen, die für die Einführung der Lösung in die Implantate verwendet werden muss, ist. </li><li> Wenn eine hohe Konzentration (≥ 6%), mit hohem Molekulargewicht PLLA-Lösungen verwendet werden, stellen die Lösung in das Implantat sofort nach dem Erhitzen. Ansonsten Gelierung der Lösung erfolgt ohne vollständige Eintauchen. </li><li> Berechnen des Volumens des erforderlichen Polymerlösung in Bezug auf die Porosität des Implantats kann die Genauigkeit Änderung in dem Volumen des gefrorenen Lösung in Betracht gezogen werden. </li><li> Führen Sie die Lösung in die Implantate mit KPG-Spritzen mit 0,1 ul Genauigkeit. Die untere Grenze für die Polymerkonzentration3% für reproduzierbare Porengradient Bildung Erwägung, dass es hart wird, um eine homogene Verteilung in den dicken Proben über 6% zu erhalten. Für bestimmte Anwendungen andere Konzentrationen verwendet werden. </li><li> Einfrieren der Proben entweder direkt bei -80 ° C oder mit einem vor Inkubationszeit von 30 min bei Raumtemperatur. Einfrieren zu bestimmen teilweise die Bildung von Poren, so dass die Frost kann entsprechend der Porosität soll eingestellt werden. Halten Sie die Proben über Nacht bei -80 ° C </li><li> Extraction: Tauchen Sie die Implantate in 80% EtOH vorgekühlt. Führen Sie die Extraktion bei -20 ° C über Nacht. Um Porositätsgradienten zu erhalten, entfernen Sie alle Formteile mit Ausnahme des Dorns für die röhrenförmigen Implantate und alle Teile mit Ausnahme der untere Teil für scheibenförmige Implantate. Verwenden Sie einen vorgekühlten Skalpell zum leichteren Abtrennen der Form. </li><li> Nach der Extraktion bei -20 ° C über Nacht 19, entfernen Sie die restlichen Formteile und Luft trocknen die Implantate. Zur Charakterisierungdie Gesamtporosität der Struktur Quecksilberporosimeters Analyse notwendig. Quecksilberporosimeters Messungen zeigten deutliche Spitzen, die die Poren an den beiden Seiten des Implantats und die kleineren Poren interdispergierte entsprechen. Doch die wichtigere Daten ist der Unterschied zwischen den Porositäten intraluminale extraluminalen und Oberflächen, die durch Bild-J für die Porengrößenverteilung mit einem Rasterelektronenmikroskop (SEM) 20 analysiert werden kann. Zur Überprüfung der Porengradient, Gefrierbruch die Proben und beobachten Sie den Querschnitt mit SEM. </li><li> Durch die offene poröse Natur der Implantate verwendet, und der Licht reflektierenden Kapazität von Titan, ist es möglich, z-Stapel von markierten Zellen in den porösen Implantate. Beschriften Sie die Zellen mit PKH26 oder Calcein-AM und visualisieren die Implantate mit der konfokalen Laser-Mikroskopie. </li></ol> 2. Oberflächenbeschichtung poröse metallische Implantate mit Kollagen / Alginat Multilayers <ol><li> Für Aufbauvon Multilayer wird höchste Reproduzierbarkeit mit Dip Roboter erhalten. Wenn jedoch ein Eintauchen Roboter nicht in diesen Schritten kann manuell erfolgen. </li><li> Verwenden medical grade Kollagen Typ I und Natriumalginat. Die optimierten Konzentrationen liegen bei 0,5 g / L für jede in 150 mM NaCl in Citratpuffer bei pH 3,8. </li><li> Man löst das Kollagen Lösung über Nacht, um die Homogenität der Lösung zu gewährleisten. Sauren pH-Wert von 3,8 ist für einen stabilen Aufbau der Schichten die Struktur instabil vor der Vernetzung in neutralen pH ist. </li><li> Zahlen Sie die Schichten durch ein Eintauchen Robotersystem durch Eintauchen der Implantate in Kollagen und Alginatlösungen alternativ. Deposition beträgt 15 min für jede nachfolgende Schicht. Spülen Sie die Struktur zwischen Abscheidungsschritte mit 150 mM NaCl bei pH 3,8 für 5 min. </li><li> Design-spezifischen Halter für den Einsatz der Implantate mit dem Eintauchen in Roboter Polyelektrolytmultischicht Produktion verwendet. Zahlen Sie die Schichten auf der Oberfläche entweder Titan nur IMPLAngen oder Implantate modifiziert, wie in Abschnitt 1 beschrieben. </li><li> Die Stabilisierung der Basalmembran imitieren mit Genipin: Vorbereiten der vernetzenden Lösung in einem Dimethylsulfoxid (DMSO) / Citrat-Puffer (150 mM NaCl, pH 3.8) bei 01.04 v: v-Verhältnis. Ein breiter Bereich von Konzentrationen verwendet werden kann und 100 mM ist ausreichend für die Vernetzung. Auflösen Genipin erste in der DMSO Komponente und fügt die Komponente Wasser später zu vermeiden verklumpen. </li><li> Vernetzung der Proben durch das Eintauchen in die Vernetzung Lösung zwischen 12-24 Stunden. Anschließend mit reichlich Citratpuffer (pH 3,8) zu spülen. </li><li> Nach dem Waschen Schritte, sterilisieren die Proben entweder mit UV-Behandlung (30 min) oder einem Antibiotikum / Antimykotikum Bad (Penicillin / Streptomycin, Fungizone). </li><li> Die wichtigsten Parameter, die die Qualität der Basalmembran imitieren bestimmen die Dicke und der Durchmesser der Fasern. Berechnen Sie die Faserdurchmessern mit Atomic Force Microscopy (AFM)-Bilder in Kontakt-Modus erhalten. Trocknen Sie die Proben mit einemStickstoff-Flow vor Bildgebung. Quantifizierung der Dicke von mindestens 10 Fasern pro Bild, um die durchschnittliche Dicke Fibrillen mit Bild J Software zu bestimmen. </li><li> Die Dicke der Folien kann durch Kratzversuche mit AFM bestimmt werden. Dry (COL / ALG) 24 / COL mehrschichtigen Folien. Verwenden Sie eine Spritze und Nadel, um den Film zu kratzen. Nach Lokalisierung der Kratzer mit einem Lichtmikroskop, erhalten Bilder mit AFM auf 10 x 10 um 2 Flächen an der Grenze von der Pike auf. Berechnen der Höhe der Profile mit dem AFM-Software, die die Dicke der Filmschicht erhalten wird. </li></ol> 3. Indirekte Überwachung von Implant Integration von In-vivo-Analyse von Blut-Plasma <ol><li> Alle notwendigen Genehmigungen sollten Ausschuss für Tierversuche nach den Regeln über für jedes Land 21 entnommen werden. In unserem Fall ist der Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Research Council, 2010) folgt und the-Zulassung von der Universität Straßburg Ethikkommission erhalten. </li><li> Führen Sie die Implantation am Zielort. Das Blut Überwachung Protokoll gegeben wurde hier für Tracheal Ersatz in weißen Neuseeland-Kaninchen aus einem 15 mm Trachea Resektion eingesetzt. </li><li> Nach Implantation eine tägliche Follow-up ist notwendig, wie montioring das allgemeine Wohlbefinden der Tiere (Heilung um die OP-Websites, Atemfrequenz) und die Aufnahme ihres Gewichts. </li><li> Um den Bluttest prüfen, kann ein gut etabliertes Verfahren, wie ELISA Tests für Blut CRP-Werte. CRP Tests für viele Tiere zur Verfügung stehen und die speziellen für Kaninchen ist in Tabelle 1 aufgeführt. In ähnlicher Weise verwenden Western Blot zur Bestimmung der CGA Ebenen. Monoklonale Antikörper anti-CGA (anti-CGA 47-68) wurden in diesem Protokoll verwendet. </li><li> Für Plasma-Charakterisierung, erhalten Blutproben der Ohrmuschel Venen der Kaninchen. Zentrifugieren bei 5000 rpm für 20 min bei 4 °; C. Verwenden Sie den Überstand zur Analyse erhalten. In unserem Verfahren werden diese Tests auf einer wöchentlichen Basis getan, aber häufigere Tests sind ebenfalls möglich. </li><li> Reverse-Phase HPLC-Reinigung des Plasma-Protein-Gehalt: Entpacken Sie die Kaninchen Plasma mit 0,1% Trifluoressigsäure (1:1, v: v). Reinigen des Extrakts mit einem Dionex HPLC-System (Ultimate 3000; Sunnyvale, CA USA) auf einem Reverse-Phase Nucleosil 300-5C18-Säule (4 x 250 mm; Partikelgröße 5 um; Porosität 300 Å). </li><li> Notieren Sie sich die Absorption bei 214 und 280 nm. Als Lösemittelsystem ist i) Lösungsmittel A: 0,1% (v / v) Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser und ii) Lösungsmittel B: 0,09% (v / v) TFA in 70% (v / v) Acetonitril-Wasser. </li><li> Verwenden Sie einen Volumenstrom von 700 ml / min mit Gradienten für Elutionen. Sammeln Sie die Peak-Fraktionen. Konzentrieren sich die Fraktionen durch Verdampfen von speed-Vakuum-Anwendung. Es ist wichtig, um die Geschwindigkeit zu-Vakuum vor der vollständigen Trockne stoppen. </li><li> Korrelieren die Peaks bei verschiedenen Zeitpunkten über die Zusammenarbeit erhaltenUrse der Implantation Zeitraum. Verwenden der gereinigten Peptide, die sich konsequent Trends im Verlauf der Implantation für die Identifizierung durch automatische Edman-Sequenzierung. </li><li> Automatische Edman-Sequenzierung der Peptide: Bestimmen der N-terminale Sequenz der gereinigten Peptide automatischen Edman-Abbau unter Verwendung eines Procise Mikrosequenzers. Legen Sie die Probe auf Polybrene behandelten Glasfaser-Filter. Der nächste Schritt ist die Ermittlung der Phenylthiohydantoin-Aminosäuren (Pth-Xaa) durch Chromatographie an einer C18-Säule (PTH C-18, 2,1 x 200 mm) 22. Nach der Sequenz erhalten wird, kann es von Blast-Software mit der Swiss-Prot-Datenbank identifiziert werden. </li></ol>

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NE Vrana ist Mitarbeiter von Protip SAS.

Pore ​​Steigungen sind wichtige Werkzeuge in der Schnittstelle des Tissue Engineering und der hier beschriebene System kann allein oder in Verbindung mit metallischen Implantaten verwendet werden, um Porengradient bilden Zellwanderung studieren. Das System erfordert keine zusätzliche Einstellung oder zusätzliche Ausrüstung mit Ausnahme einer chemischen Abzugshaube gegen organische Lösungsmittel behandeln, so kann es in der Biologie Labors angewendet werden. Ähnliche Polymere wie Poly (Glykolsäure) (PGA), Poly ...

Derzeit verfügbare metallische Implantate eignen sich für tragende Anwendungen, aber ihre nicht Abbaubarkeit erforderlich Designs, die eine starke Grenzfläche mit dem Gewebe um sie 1 sicherzustellen. Durch die Bereitstellung von Strukturen, die in zelluläre Wachstum und Kolonisierung in vivo zu erleichtern, kann die Lebensdauer der metallischen Implantaten 2 verlängert werden. Offen poröse metallische Implantate sind vielversprechende Materialien für Tissue Engineering und Schnittstelle auch für eine gute Besiedlung der Implantate. Sie wurden aktiv als orthopädische Implantate und auch als Luftröhre Implantate 3-5 verwendet. Jedoch gibt es immer noch Probleme, die wie die genaue Kontrolle über die Bewegung der Zellen in den Poren Bereiche gelöst werden müssen. Die Nichtbeachtung dieser Prozess steuern könnte zu einer unvollständigen Kolonisation in einem Ende und Restenose in der anderen führen. Auch weitere Funktionalisierung dieser Implantate ist notwendig für die Erreichung höherer Funktionen, wie die Lieferung von Wachstumsfaktoren,gerichtet Vaskularisierung und gleichzeitige Bewegung der verschiedenen Zelltypen 6-8. Für trachealen Implantate ist dies wichtig, da die Besiedlung des Implantats durch einen vaskularisierten Gewebe erwünscht ist. Jedoch ist das unkontrollierte Wachstum eines Gewebes, um das Lumen der Luftröhre unerwünscht, da sie Implantat Durchgängigkeit abnimmt. Eine Möglichkeit zur Bewegung der Zellen steuern Größe Ausgrenzung. Durch die Kenntnis der Größe der Zielzellen und ihre Fähigkeit, mit einem bestimmten synthetischen Polymer wechselwirken kann man Gradienten von Poren, die effektiv bestimmen die Tiefe der Zelle Bewegung zu entwickeln. Zum Beispiel, indem ein Porenarchitektur, die groß genug für die Eingabe von Bindegewebszellen, wie Fibroblasten extraluminally, aber klein genug ist (weniger als 10 um), um ihre Bewegung zu verhindern intraluminally eine wirksame Kontrolle über Besiedlung einer röhrenförmigen Implantats erreicht wird. Von Verfügung Porenerzeugung Methoden wie Gefrier-Trockenmaschng, Partikel Auslaugung, Gas Schäumen 9,10; die einfachste Methode für die schnelle Bildung von Poren Gradienten anzupassen mit minimalen notwendigen Ausrüstungen ist Gefrier-Extraktion 11. In diesem Verfahren wird ein Polymer-Lösung in einer binären Mischung eines organischen Lösungsmittels und Wasser eingefroren. Anschließend wird das Lösungsmittel durch Extraktion mit einem mischbaren vorgekühlten Flüssigkeit, wie Ethanol ausgetauscht. Einfrieren und Extraktion bestimmen die Form und Größe der Poren und wenn die Extraktion in einer Weise, wo die Bewegung der Extraktionslösung gesteuert werden kann erfolgt, Porengröße und Form kann direktional moduliert. Zweiter Schritt für mehrzellige Gewebe ist die Bildung von porösen Schranken zwischen verschiedenen Zelltypen, um ihre Wechselwirkung zu steuern. Dies ist auch notwendig für die Verfügbarkeit der verschiedenen Mikroumgebungen für verschiedene Zelltypen je nach Bedarf 12,13. Trachea ein röhrenförmiges Organ, Kehlkopf verbindet mit Bronchi. Es verfügt über einen inneren pseudostratified Ciliarepithel Futter mit interdispergierte Becherzellen, die Schleim produzieren. Die 3D-Struktur und Stabilität der Luftröhre von Knorpel in der Form von C-Ring gehalten wird. Somit wird in einer künstlichen Luftröhre sollte eine definierte Verbindung zwischen dem Bindegewebe und dem ciliary Epithelschicht sein. Während eine 3D-Struktur ist für den Bindegewebeteil notwendig, erfordert die Migration von Epithelzellen aus Basalmembran-ähnlichen Oberfläche gerichtete Bewegung und Verschließen der Wunde zu erreichen. Polyelektrolytmultischicht Filme (PEM) sind eine mögliche Option, um Basalmembran Mimik erhalten. Schicht-für-Schicht-Verfahren (LBL) ist ein vielseitiges Verfahren zu dünn und der Beschichtung von Oberflächen zu erhalten. Es ist auf elektrostatischen Wechselwirkungen von zwei entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten und deren Aufbau in einer sequentiellen Weise basierend auf nanoskaligen Oberflächenbeschichtungen, deren Eigenschaften durch einfaches Ändern Variablen wie Polyelektrolytspezies, pH variiert werden erhalten,Schicht Nummer Zugabe einer Deckschicht, Vernetzung usw. Einer der wichtigsten Vorteile der LbL-Methode ist die Möglichkeit, an die Topographie des darunterliegenden Substrats entsprechen. Somit wird unter kontrollierten Bedingungen kann dieses Verfahren auch zur Gewinnung von Oberflächenbedeckung von porösen Strukturen verwendet werden. Wenn Kollagen als einer der Polyelektrolyte ist es möglich, Nanofibrill Strukturen, die die Oberfläche der Basalmembran erhalten nachahmen kann. Die Hydrophobie von Titan ermöglicht die Entwicklung solcher Strukturen und fibrillarity können in dicken Schichten 14 beibehalten werden. Auf diese Weise Befestigung und Bewegung der Zelle auf der Oberfläche gesteuert werden. Durch die Verwendung von Gefrier-Extraktion und LbL Filmbeschichtung sequentiell kann eine Struktur, bei der Zellbewegung seitlich gesteuert werden kann, in Längsrichtung und in Umfangsrichtung 15 erhalten werden. Hier beschreiben wir zwei neue Methoden zur Modifikation Titan-Implantate mit ihrer hydrophoben Verhalten, das kannerweitert Modifikation verschiedene poröse Implantate: i) Bildung von Gradienten von Mikroporen in den makroporösen Titan-Implantate mit hydrophoben, synthetischen Polymeren, ii) Bildung einer dicken polymeren Filmschicht auf der Implantatoberfläche, die Zellwachstum und Futter Bildung von Polyelektrolyt unterstützt. Diese Verfahren können sequentiell oder separat verwendet werden. Sie bieten Strukturen, die kontrollierte Migration und räumliche Organisation der verschiedenen Zelltypen in vielzelligen Geweben 16,17 gewährleisten. Für den speziellen Fall der Luftröhre, würde das gewünschte Ergebnis für das Implantat die Kolonisation durch fibrovascular Gewebe innerhalb der Mikroporen Gradienten ohne Restenose und der Bildung der inneren Auskleidung Flimmerepithelzellen auf den Polyelektrolyt. Eine Möglichkeit zur Kontrolle Integration der Implantate ist es, kleine chirurgische Eingriffe während der die Integration mit dem Host in situ zu tun. Um in der Lage t werdeno entscheiden über den Zeitpunkt der Interventionen, ist es wichtig, Informationen über die systemischen Wirkungen des Implantats haben. C-reaktives Protein (CRP) ist für die Überwachung von Infektionen und entzündlichen Reaktion in klinischen Umgebungen verwendet. Chromogranin A (CGA) können in ähnlicher Weise verwendet werden könnten und genauere Ergebnisse zu liefern, um das Niveau der Entzündung 18 zu beobachten. Als einen möglichen Weg der Beobachtung metallischen Implantat Integration in vivo, präsentieren wir ein kontinuierliches Monitoring-Verfahren des Implantats systemische Effekte durch Charakterisierung von tierischen Blutproben mit Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) und anschließender Protein-Sequenzierung. Ausarbeitung dieser Methode kann verwendet werden, um regelmäßige Endpunkt histologische Analyse entziehen werden. Histologische Schneiden von metallischen Implantaten ist ein langer, umständlich und teuer und kann nur zu bestimmten Zeitpunkten durchgeführt werden. Aus diesem Grund, Bluttests Bereitstellung robuster Informationen über das Implantat Gesundheit gut gestaltete würdemöglich sein, Wege zu Tierversuchen zu verringern, wie durch die jüngsten EU-Vorschriften über Tierversuche vorgeschrieben. Die hier vorgestellten Methoden können verwendet werden, um die Leistung von metallischen Implantaten durch Funktionalisierung zu verbessern oder um einen alternativen Weg zum Überwachen der vorhandenen Implantate werden.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dioxane</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>360481</td>
 <td>Toxic material, Strictly under chemical hood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PLLA 
 i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g 
 ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g 
 </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>94829, 81273</td>
 <td>The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate)</td>
 <td>Novamatrix</td>
 <td>4200006</td>
 <td>Low viscosity(20-200 mPa.s)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagen type I (Bovine)</td>
 <td>Symatese</td>
 <td>CBPE2US100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pen/Strep, Fungizone </td>
 <td>Promocell</td>
 <td>C42020</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Genipin</td>
 <td>Wako</td>
 <td>0703021</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. </td>
 <td>Bruker </td>
 <td>MSCT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trifluoroacetic acid for HPLC ,&ge;99.0% </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>302031</td>
 <td>Hazardous Material, Please follow MSDS carefully</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetonitrile, for HPLC ,&ge;99.9% </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>34998</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calcein-AM</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C3100MP </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>PKH26GL</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit</td>
 <td>Genway Bio</td>
 <td>GWB-9BF960 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO, Bioreagent, &ge;99.7% </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D2650</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope</td>
 <td>Bruker</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Procise microsequencer </td>
 <td>Applied Biosystems </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultima 3000 HPLC system </td>
 <td>Dionex</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100</td>
 <td>Hitachi </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 </td>
 <td>Zeiss </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Table 1. List of Materials and Reagents.

multi-scale modification of metallic implants with pore gradients, polyelectrolytes and their indirect monitoring in vivo

Metallic Implantaten, insbesondere Titan-Implantate, sind weit verbreitet in klinischen Anwendungen eingesetzt. Tissue in-Wachstum und Integration dieser Implantate im Gewebe sind wichtige Parameter für eine erfolgreiche klinische Ergebnisse. Um Gewebe Integration zu verbessern, haben poröse metallische Implantate entwickelt. Offene Porosität von metallischen Schäumen ist sehr vorteilhaft, da die Poren Bereiche, ohne die mechanischen Eigenschaften der ganzen Struktur funktionalisiert werden können. Hier beschreiben wir solche Modifikationen mit porösem Titan-Implantate auf Titan Mikrokügelchen basiert. Durch die Verwendung von inhärenten physikalischen Eigenschaften wie Hydrophobie von Titan, ist es möglich, hydrophoben Poren Gradienten innerhalb Mikrokügelchen auf metallischen Implantaten und zur gleichen Zeit zu erhalten, müssen eine Basalmembran an hydrophilen, natürlichen Polymeren imitieren basiert. 3D Poren Gradienten werden durch synthetische Polymere, wie Poly-L-Milchsäure (PLLA) durch Gefriertrocknen Extraktionsverfahren gebildet wird. 2D Nanofibrill surFlächen mit Kollagen / Alginat durch einen Vernetzungsschritt mit einem natürlichen Vernetzer (genipin) gefolgt ist. Diese Nanofasern Folie wurde um Schicht (LbL)-Abscheidungsverfahren der beiden entgegengesetzt geladenen Molekülen, Kollagen und Alginat aufgebaut. Schließlich ein Implantat, wo verschiedene Bereiche verschiedene Zelltypen aufnehmen kann, als dies erforderlich ist für viele vielzelligen Geweben, erhalten werden. Durch kann auf diese Weise zelluläre Bewegung in verschiedenen Richtungen von unterschiedlichen Zelltypen gesteuert werden. Ein solches System ist für den speziellen Fall der Luftröhre Regeneration beschrieben, aber es kann auch für andere Zielorgane modifiziert werden. Analyse der Zellwanderung und die möglichen Methoden für die Erstellung von verschiedenen Pore Gradienten werden erarbeitet. Der nächste Schritt in der Analyse solcher Implantate ist die Charakterisierung nach der Implantation. Allerdings ist die histologische Analyse von metallischen Implantaten ein langer und mühsamer Prozess, also für Überwachungs-Host Reaktion auf metallische Implantate in vivo eine einerlternative Verfahren zur Überwachung und CGA verschiedenen Blut-Proteinen wird ebenfalls beschrieben. Diese Methoden können für die Entwicklung von in vitro maßgeschneiderte Migration und Kolonisation Tests verwendet werden und auch für die Analyse von funktionalisierten metallischen Implantaten in vivo ohne Histologie verwendet werden.

Bildung von Poren Gradienten Durch die Änderung der Konzentration des PLLA Lösung ist es möglich, die Größe der Poren auf der extraluminalen Seite der Implantate zu steuern. Porengröße und Form wurde durch die Anwesenheit von Titan-Implantaten (Abbildungen 1a und 1b) betroffen. Porengrößen reichten von 40 bis 100 um und Nutzung von niedrigeren Konzentrationen führten zu kleineren Poren. Während in der intraluminalen Seite Porengröße wurde durch die...

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Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

In diesem Video zeigen wir Ihnen, Modifikation Techniken für poröse metallische Implantate, um ihre Funktionalität zu verbessern und die Zellwanderung steuern. Techniken umfassen die Entwicklung von Poren Gradienten zu Zelle Bewegung in 3D und Produktion von Basalmembran imitiert zu Zelle Bewegung in 2-D zu steuern. Auch ist eine HPLC-Methode zur Überwachung Implantatintegration in-vivo durch eine Analyse von Blut Proteine ​​beschrieben.

Multi-Skala Modifikation von metallischen Implantaten mit Pore Farbverläufe, Polyelektrolyte und ihre indirekte Überwachung<em&gt; In vivo</em

Metallic implants, especially titanium implants, are widely used in  clinical applications. Tissue in-growth and integration to these implants in  the ...

multi-scale-modification-metallic-implants-with-pore-gradients

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

10.8K Aufrufe.  INSERM. In diesem Video zeigen wir Ihnen, Modifikation Techniken für poröse metallische Implantate, um ihre Funktionalität zu verbessern und die Zellwanderung steuern. Techniken umfassen die Entwicklung von Poren Gradienten zu Zelle Bewegung in 3D und Produktion von Basalmembran imitiert zu Zelle Bewegung in 2-D zu steuern. Auch ist eine HPLC-Methode zur Überwachung Implantatintegration in-vivo durch eine Analyse von Blut Proteine ​​beschrieben.

Serie: Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids 1-6, the unfolding of proteins 7, and binding affinity of different ligands 8. By coupling these nanopores to the resistive-pulse technique 9-12, such measurements can be done under a wide variety of conditions and without the need for labeling 3. In the resistive-pulse technique, an ionic salt solution is introduced on both sides of the nanopore. Therefore, ions are driven from one side of the chamber to the other by an applied transmembrane potential, resulting in a steady current. The partitioning of an analyte into the nanopore causes a well-defined deflection in this current, which can be analyzed to extract single-molecule information. Using this technique, the adsorption of single proteins to the nanopore walls can be monitored under a wide range of conditions 13. Protein adsorption is growing in importance, because as microfluidic devices shrink in size, the interaction of these systems with single proteins becomes a concern. This protocol describes a rapid assay for protein binding to nitride films, which can readily be extended to other thin films amenable to nanopore drilling, or to functionalized nitride surfaces. A variety of proteins may be explored under a wide range of solutions and denaturing conditions. Additionally, this protocol may be used to explore more basic problems using nanopore spectroscopy.

A method of using solid-state nanopores to monitor the non-specific adsorption of proteins onto an inorganic surface is described. The method employs the resistive-pulse principle, allowing for the adsorption to be probed in real-time and at the single-molecule level. Because the process of single protein adsorption is far from equilibrium, we propose the employment of parallel arrays of synthetic nanopores, enabling for the quantitative determination of the apparent first-order reaction rate constant of protein adsorption as well as and the Langmuir adsorption constant.

Überwachung Proteinadsorption mit Solid-State-Nanoporen

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids ...

Forschung

Biotechnik

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Messe Cytometry: Protokoll für die tägliche Tuning und Ausführen von Zellproben auf einem CyTOF Messe Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Graphene Coatings for Biomedical Implants

Atomically smooth graphene as a surface coating has potential to improve implant properties. This demonstrates a method for coating nitinol alloys with nanometer thick layers of graphene for applications as a stent material. Graphene was grown on copper substrates via chemical vapor deposition and then transferred onto nitinol substrates. In order to understand how the graphene coating could change biological response, cell viability of rat aortic endothelial cells and rat aortic smooth muscle cells was investigated. Moreover, the effect of graphene-coatings on cell adhesion and morphology was examined with fluorescent confocal microscopy. Cells were stained for actin and nuclei, and there were noticeable differences between pristine nitinol samples compared to graphene-coated samples. Total actin expression from rat aortic smooth muscle cells was found using western blot. Protein adsorption characteristics, an indicator for potential thrombogenicity, were determined for serum albumin and fibrinogen with gel electrophoresis. Moreover, the transfer of charge from fibrinogen to substrate was deduced using Raman spectroscopy. It was found that graphene coating on nitinol substrates met the functional requirements for a stent material and improved the biological response compared to uncoated nitinol. Thus, graphene-coated nitinol is a viable candidate for a stent material.

Graphene offers potential as a coating material for biomedical implants. In this study we demonstrate a method for coating nitinol alloys with nanometer thick layers of graphene and determine how graphene may influence implant response.

Atomically smooth graphene as a surface coating has potential to improve implant properties. This demonstrates a method for coating nitinol alloys with ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

Operationstechnik zur Implantation von Tissue Engineered Gefäßprothesen und Folge<em&gt; In-vivo-</em&gt; Überwachung

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper and cystine, with either copper nanoparticles (CNPs) or copper sulfate contributing the metallic component. Synthesis is carried out in liquid under biological conditions (37 &#176;C) and the self-assembled composites form after 24 hr. Once formed, these composites are highly stable in both liquid media and in a dried form. The composites scale from the nano- to micro- range in length, and from a few microns to 25 nm in diameter. Field emission scanning electron microscopy with energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) demonstrated that sulfur was present in the NP-derived linear structures, while it was absent from the starting CNP material, thus confirming cystine as the source of sulfur in the final nanocomposites. During synthesis of these linear nano- and micro-composites, a diverse range of lengths of structures is formed in the synthesis vessel. Sonication of the liquid mixture after synthesis was demonstrated to assist in controlling average size of the structures by diminishing the average length with increased time of sonication. Since the formed structures are highly stable, do not agglomerate, and are formed in liquid phase, centrifugation may also be used to assist in concentrating and segregating formed composites.

Here we present a protocol to synthesize novel, high-aspect ratio biocomposites under biological conditions and in liquid media. The biocomposites scale from nanometers to micrometers in diameter and length, respectively. Copper nanoparticles (CNPs) and copper sulfate combined with cystine are the key components for the synthesis.

Generation skalierbar, Metallic Hochseitenverhältnis Nanokomposite in einer biologischen Flüssigmedium

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of these porous nanofibers is of great interest due to their unique physiochemical properties. Here we elaborate on the fabrication of keratin containing poly (&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibers (i.e., PCL/keratin composite fiber). Water soluble keratin was first extracted from human hair and mixed with PCL in different ratios. The blended solution of PCL/keratin was transformed into nanofibrous membranes using a laboratory designed electrospinning set up. Fiber morphology and mechanical properties of the obtained nanofiber were observed and measured using scanning electron microscopy and tensile tester. Furthermore, degradability and chemical properties of the nanofiber were studied by FTIR. SEM images showed uniform surface morphology for PCL/keratin fibers of different compositions. These PCL/keratin fibers also showed excellent mechanical properties such as Young&#39;s modulus and failure point. Fibroblast cells were able to attach and proliferate thus proving good cell viability. Based on the characteristics discussed above, we can strongly argue that the blended nanofibers of natural and synthetic polymers can represent an excellent development of composite materials that can be used for different biomedical applications.

Electrospun nanofibers have a high surface area to weight ratio, excellent mechanical integrity, and support cell growth and proliferation. These nanofibers have a wide range of biomedical applications. Here we fabricate keratin/ PCL nanofibers, using the electrospinning technique, and characterize the fibers for possible applications in tissue engineering.

Synthese von Keratin-basierten Nanofaser für Biomedizinische Technik

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate Poly(Lactic Acid) Scaffolds with Graded Pore Size

Over the recent years, functionally graded scaffolds (FGS) gaineda crucial role for manufacturing of devices for tissue engineering. The importance of this new field of biomaterials research is due to the necessity to develop implants capable of mimicking the complex functionality of the various tissues, including a continuous change from one structure or composition to another. In this latter context, one topic of main interest concerns the design of appropriate scaffolds for bone-cartilage interface tissue. In this study, three-layered scaffolds with graded pore size were achieved by melt mixing poly(lactic acid) (PLA), sodium chloride (NaCl) and polyethylene glycol (PEG). Pore size distributions were controlled by NaCl granulometry and PEG solvation. Scaffolds were characterized from a morphological and mechanical point of view. A correlation between the preparation method, the pore architecture and compressive mechanical behavior was found. The interface adhesion strength was quantitatively evaluated by using a custom-designed interfacial strength test. Furthermore, in order to imitate the human physiology, mechanical tests were also performed in phosphate buffered saline (PBS) solution at 37 &#176;C. The method herein presented provides a high control of porosity, pore size distribution and mechanical performance, thus offering the possibility to fabricate three-layered scaffolds with tailored properties by following a simple and eco-friendly route.

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate PolyLactic Acid Scaffolds with Graded Pore Size

In this work, poly(lactic acid)/polyethylene glycol (PLA/PEG) scaffolds were prepared by using a combination of melt mixing and selective leaching. The method herein discussed permitted to develop three-layer scaffolds by highly controlling both porosity and pore size. The mechanical properties were also evaluated in a physiological environment.

Ein Facile und umweltfreundliche Weg zu fabrizieren Poly (Milchsäure) Scaffolds mit Graded Porengröße

Over the recent years, functionally graded scaffolds (FGS) gaineda crucial role for manufacturing of devices for tissue engineering. The importance of ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

Synthese von Multi-walled Carbonnanotubes mit Silber-Nanopartikeln und Bewertung ihrer antibakteriellen Aktivitäten und zytotoxische Eigenschaften modifiziert

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Starre Einbettung von fixiert und gefärbt, im großen und ganzen Millimeter-Skala Exemplare für Abschnitt-free 3D Histologie durch Mikro-Computertomographie

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...