Diese Arbeit wurde zum Teil durch die BBSRC (BB/1006478/1) finanziert. PRR ist der Empfänger einer Universität Royal Society Research Fellowship.

1. Strategische Überlegungen <ol><li> Die Wahl der Samenkristalle für microseeding Versuchen verwendet werden, je nach dem Ziel des Experiments variieren. Zu Beginn eines Projektes ist es hilfreich, mehrere Kristallisations Hits, die alternative Startpunkte für Kristall-Optimierung bieten kann. RMM reduziert die Notwendigkeit für kristall Optimierung weil gute Qualität Kristalle sind eher in der metastabilen Zone des Phasendiagramms, also in dem Bereich, wo folgende Störung oder Keimbildung kehrt das System ins Gleichgewicht zu wachsen. Wir schlagen daher vor, mit RMM routinemäßig, sobald die ersten Kristalle erhalten (oder, genauer gesagt, sobald die ersten Kristalle aufhören zu wachsen). </li><li> Für die erste Runde der RMM sollte ein Saatgut mit so viel kristallines Material wie möglich gemacht werden. Ist nur ein gut verfügbar ist, enthält Kristalle, oder wenn die Kristalle klein sind, kann es hilfreich sein, mehrere Wiederholungen der EinrichtungOriginal-Hit (ohne Aussaat), um die Versorgung von Kristallen zu erhöhen. Wenn jedoch mehrere Zugriffe erhalten werden, können Impfkristalle von mehreren Bedingungen geerntet und miteinander vermischt werden. </li><li> Um eine Phasentrennung zu vermeiden, sollte Kristalle in Hochsalzbedingungen gezüchtet getrennt von Kristallen in hoher PEG Bedingungen gezüchtet geerntet werden. Wenn Kristalle aus mehreren Brunnen gemischt werden, sollte ein Reservoir-Lösung, die weniger wahrscheinlich, dass Salzkristalle geben, ist für die Keimsuspension ausgewählt werden. Zum Beispiel sollten hohe Konzentrationen von Phosphat, Sulfat, Calcium und Magnesium vermieden werden. </li><li> Später in einem Projekt kann es wichtig sein, für Kristalle mit unterschiedlichen Einheitszellen, um die Beugung zu verbessern, vermeiden Zwillingskristallen und Kristalle, die für die Bindung Liganden zu erhalten suchen. In dieser Phase nur die am besten geeigneten Kristalle (z. B. solche, die am besten zu beugen) verwendet, um den Samen Lager zu machen. Manchmal wiederholt Runden microseeding erforderlich sind, in denen nur die &quot;beste&quot;Kristalle werden verwendet, um das Saatgut für die nachfolgende Runde zu machen. Wenn möglich, ein&quot; neutral &quot;Fällmittel wie PEG 3000 verwendet, um die Keimkristallen im Suspend werden, um neue Kristall Kontakte zu fördern und Komplexe, die in instabilen hoch sein kann kristallisieren 12-Salzlösungen. </li><li> Klassische microseeding Experimente, in denen eine einzige Kristallisationsbedingung verwendet wird, sind oft hilfreich, nach der Identifizierung von einem vielversprechenden Zustand und bei der anschließenden Optimierung. Oft ist es notwendig, das Saatgut, um die gewünschte Anzahl der Kristalle pro Tropfen zu verdünnen. A &quot;kombinatorischen&quot; microseeding Versuch (wo eine Reihe von Saatgut von zunehmender Verdünnung zu einer Kristallisationsbedingung hinzugefügt) ist eine schnelle Methode für die Suche nach der optimalen Verdünnung des Saatguts. Diese Vorgehensweise wird nachfolgend beschrieben. </li></ol> 2. Vorbereitung der Seed Lizenz <ol><li> Stellen Sie eine abgerundete Glassonde von einer Glaspasteurpipette mit einer Bunsenflamme. <ol><li> Erhitzen Sie die Pipette in der Mitte, bis es weich wird, dann schnell entfernen Sie sie aus der Flamme und ziehen Sie es durch Auseinanderziehen der Enden. Ziel ist es, das Glas bis zu einem Durchmesser unter 0,25 mm zu ziehen. </li><li> Zerstöre die Glasscheibe an der Stelle, wo es um 0,25 mm und kurz eintauchen, die zerbrochenen Ende in die Flamme. Wiederholen, bis eine Halbkugel aus Glas mit einem Durchmesser von ca. 0,75 mm ist an dem Ende ausgebildet ist. Diese Sonde ist nützlich für die Zerkleinerung von kristallinem Material, wie es geeigneter Größe für markante feste Objekte auf dem 0,01-1,0 mm-Skala und es nicht die Kunststoffoberfläche eines Kristallisationsschale oder auch Unterdeckglas beschädigen. Größere Sonden (~ 1,0 mm) können kleine Kristalle effektiver zu vernichten, weil die Kristalle werden zwischen Glas und Kunststoff gefangen. </li></ol></li><li> Legen Sie eine 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Rocaille auf Eis. </li><li> Prüfen Sie einen vorher festgelegten Kristallisationsschale mit einem Binokular oder Kristall-Imaging-System, und wählen Sie eine oder mehrere apsprech Brunnen aus dem Fach, aus dem kristallinen Material für Saatgut Generation ernten. Jedes Material kann verwendet werden, einschließlich feinen Nadeln, Sphärolite, Mikrokristalle und unregelmäßig, schlecht gebildeten Kristalle werden. Das Saatgut sollte so bald wie möglich, nachdem die Kristalle aufhören zu wachsen gemacht werden, da ältere Material ist wahrscheinlich teilweise vernetzt, damit ihre Eignung für den Einsatz in Experimenten Aussaat verringert. Wenn irgendein Zweifel, ob das kristalline Material geerntet werden Salz oder das Protein kann auch unter Verwendung einer UV-Fluoreszenzmikroskop oder Abbildungssystems vor der Öffnung sichtbar gemacht werden, oder das kristalline Material kann in-situ Röntgenbeugungsanalyse unterzogen werden, besteht in das Fach. Bei der Nutzung der ehemaligen Ansatz Proteinkristallen wird unter UV-Bestrahlung fluoreszieren, werden Salzkristalle farblos erscheinen. </li><li> Und Öffnen des ausgewählten Kristallisationsschale. Für 96-Well-Schalen sitzen Abfall durch die obere Kunststoffdichtungsbahn herum schneiden die gut ausgewählten using eine Skalpellklinge. Für 24-Well-Schalen entfernen hängenden Tropfen das Deckglas mit einer Pinzette. Kehren Sie die Deckglas und legen Sie es auf eine stabile saubere Oberfläche. Entfernen Sie 50 ul der Reservoirlösung und übertragen diese Flüssigkeit in die Mikrozentrifugenröhrchen, das die Seed Bead sicherzustellen, dass das Rohr bleibt auf Eis ganz. </li><li> Die Kristalle gründlich zerschlagen in der subwell (96-Well-Fach) oder Deckglas (24-Well-Fach) fällt, mit der Glassonde in Abschnitt 2.1 vorbereitet, Anzeige der Ergebnisse unter dem Mikroskop. Kleine Kristalle kann mehrere Minuten dauern, um gründlich zu vernichten. Dieser Schritt ermöglicht es dem Experimentator, um zu überprüfen, dass die Kristalle sind einfach zu zerquetschen und werden daher nicht vernetzt ist, und auch, dass sie nicht Salzkristalle. Salzkristalle erzeugen eine unverwechselbare Klick, gehört und gefühlt, wenn sie zerkleinert werden kann. Wenn die Kristalle sind hart und schwer zu zerschlagen versuchen zu frischer Material zu erhalten und zu nutzen. </li><li> Entfernen 5 ul der Reservoirlösung aus dem Seed Bead Rohr und transfer in die entsprechende Unter gut (sitzend Tropfenexperiment) oder Deckglas (hängenden Tropfen-Experiment) mit dem kristallinen Material, geerntet werden. Pipettieren dieser Flüssigkeit nach oben und unten 5-6 mal so viel von den Unter gut oder Deck Inhalt wie möglich zu resuspendieren. Bringen Sie die Suspension auf die Seed Bead Rohr und noch zweimal wiederholen Sie diesen Schritt, um sicherzustellen, dass so viel kristallines Material wie möglich geerntet. </li><li> Mischen Sie den Seed Bead für zwei Minuten stoppen alle 30 Sekunden, um das Rohr auf Eis kühlen. </li><li> Machen Sie eine Verdünnungsreihe, Verdünnen der Saatgut in Reservoirlösung um den Faktor 4 bis 10 in jeder Phase. Typischerweise werden zu viele Kristalle bei Verwendung eines unverdünnten Saatgut erhalten werden, so verwenden Sie die verdünnt Saatgut, um die Anzahl der Kristalle pro gut steuern. In der ersten Runde der RMM, ist es wichtig, nicht die Saatgut Lösung zu verdünnen, denn je größer die Konzentration der Samen die Kristallisation mehr Treffer erhalten wird. </li><li> Wenn sie nicht sofort verwendet werden, umLICH, übertragen Sie die Samen Stoffsuspension und die verdünnte Saatgut zu einer -20 ° C oder -80 ° C-Gefrierschrank für die Lagerung. Um wiederholte Frost-Tau-Zyklen zu verhindern, die die Wirksamkeit des Saatguts reduzieren kann, dieses Material lagern in kleinen Volumen Aliquots, dh 10-20 ul. Einmal gefroren, kann Saatgut auf unbestimmte Zeit, bis sie benötigt gehalten werden. </li></ol> 3. Gründung der Kristallisation Trays <ol><li> Je nach Verfügbarkeit von Kristallisationsanlagen und den Präferenzen des Experimentators kann RMM Kristallisation Screening durchgeführt, entweder mit 24-Loch-Schalen Verwendung des hängenden Tropfen Dampfdiffusionsverfahren, oder 96-Well-Platten mit den sitzenden Tropfen Dampfdiffusionsverfahren werden. Kristallisationsschalen für RMM kann entweder von Hand hergestellt werden, unter Verwendung eines Roboter-Flüssigkeitshandhabungsautomat, oder eine Kombination der beiden. </li><li> Ein typisches Experiment Rmms von Hand eingestellt werden umfassen 1,0 ul Proteinlösung, 1,0 ul Kristallisationszustand und0,5 ul Saatguts. Ein typisches Experiment unter Verwendung eines Kristallisationsroboter gesetzt wird umfassen 0,3 ul Proteinlösung, 0,2 ul Kristallisationszustand und 0,1 ul Saatguts. </li><li> Um RMM-Screening in 24-Well-Schalen hängenden Tropfen durchzuführen, zum einen mit einem manuellen Pipette 300 ul jeder Zustand von einem 96-Loch-Zustand Kristallisation Bildschirm in 10 ml Einzelrohr-Format in jede Vertiefung der 4 x 24-Loch-vorbefettet Kristallisation Tabletts. <ol><li> Übertragung 1 ul jeder Kristallisationszustand von jedem 300 ul Behälter auf der Oberfläche einer entsprechenden Kunststoffdeckglas von der beide vorderen und hinteren Schutzverstärkungsstreifen wurden entfernt. </li><li> Zu den 1 ul jeder Kristallisationsbedingung hinzufügen 1 ul der Proteinlösung, gefolgt von 0,5 ul von Kristall Saatguts. Invertieren jedes Deckglas, so daß die Tropfen der Flüssigkeit nach unten ausgerichtet und Position über die entsprechende Vertiefung. </li><li> Drücken Sie unten auf dem Deckglas, Komprimieren der sealing Fett und eine sichere Abdichtung zu bilden. Sobald alle 96 Tropfen geschaffen werden, sollten das Fach in einen Inkubator oder Raum mit konstanter Temperatur üblicherweise im Bereich von 4 bis 18 ° C zur Lagerung überführt werden. </li></ol></li><li> Um RMM-Screening in 96-Well-Schalen sitzen Tropfen zunächst über 20-50 ul jeder Zustand von einem 96-Loch-Zustand Kristallisation Bildschirm in Deep-Well-Block-Format in jede Vertiefung entsprechend der Kristallisationsschale durchzuführen. Dieser Übertragungsschritt kann entweder unter Verwendung eines Kristallisations Roboter oder durch manuelle Übertragung unter Verwendung eines 8-Kanal-Pipette werden. <ol><li> Über Reservoir, Protein-und Saatgut-Lösungen für den Tropfen mit der Hand oder mit einem Roboter unter Verwendung der in 3.1 aufgeführten Bände. Einige im Handel erhältliche Kristallisationsroboter kontaktieren Sie nicht verzichten und leistungs Saatgut Transfer mit einem solchen System kann in Blockade der Abgabespitzen oder zugehörigen Schläuche führen. Die Reihenfolge der Ausgabe ist unterschiedlich: einige Roboter verzichten alle Lösungen gleichzeitig. Wenndies nicht möglich ist, verzichten Protein, dann Reservoir, dann säen Lager. </li><li> Wenn ein Kontakt Abgabe Roboter nicht verfügbaren Übertragungs die Samen mit einer niedrigen Lautstärke Glasspritze mit einer stumpfen Nadel ausgestattet. Spülen Sie die Nadel, indem es durch die Reservoirlösung dann verzichten die Saatgut in jedem Tropfen. </li><li> Verschließen Sie das Fach mit einem transparenten Dichtungsbahn und Transfer zu einem Inkubator oder Raum mit konstanter Temperatur für die Lagerung. </li></ol></li></ol> 4. Inspektion der Kristallisation Trays <ol><li> Visualisieren Sie alle Kristallisationsversuche entweder mit einem Binokular oder ein Kristall-Imaging-System. Sie im allgemeinen hat der Benutzer eine größere Kontrolle über Ansicht Tiefe und der Grad der Vergrößerung als die letztere, ist aber zeitaufwendig. </li><li> Überprüfen Sie jeden sub-well/coverslip in Folge und aufzeichnen Anzeichen von Kristallbildung. Experimente sollten einmal alle 24 Stunden für 5 Tage nach der Gründung und inspiziert werden dien anschließend einmal alle 7 Tage für bis zu 4 Wochen. </li><li> Mehrere Zyklen von Risikomanagementmaßnahmen sind oft erforderlich, bis die optimale Beugungs Qualität Kristalle hergestellt werden. </li></ol>

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	<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Crystallization.">Protein Crystallization.</a> IUL Biotechnology Series. , (2009).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Babnigg, G., Joachimiak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+protein+crystallization+propensity+from+protein+sequence.">Predicting protein crystallization propensity from protein sequence.</a> J. Struct. Funct. 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Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).</li><li>D'Arcy, A., Villard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microseed+matrix-screening+method+for+protein+crystallization.">An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).</li><li>Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+Microseeding:+A+Theoretical+and+Practical+Exploration+of+Seed+Stability+and+Seeding+Techniques+for+Successful+Protein+Crystallization.">Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization.</a> Crystal Growth &amp; Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).</li><li>Obmolova, G., Malia, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+crystallization+of+antibody-antigen+complexes+via+microseed+matrix+screening.">Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).</li><li>Villasenor, A. G., Wong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+matrix+microseeding:+improving+protein+crystal+growth+with+minimal+chemical+bias.">Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).</li><li>Strynadka, N. C., James, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme:+a+model+enzyme+in+protein+crystallography.">Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography.</a> EXS. 75, 185-222 (1996).</li><li>Diaz, A., Loewen, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+heme+catalases+structural+biology.">Thirty years of heme catalases structural biology.</a> Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

In diesem Papier haben wir eine allgemeine Methode zur Proteinkristallisation Rmms Screening beschrieben. Wir haben mit zwei Testproteine ​​eine signifikante Verbesserung bei der Kristallisation Erfolgsrate dieser Methode demonstriert. Beugungsanalyse mit Synchrotronstrahlung einer Teilmenge der Kristalle, die unter Verwendung RMM und nicht-Rmms Methoden zeigte wenig Veränderung in der Qualität zwischen Beugungs Kristalle gewachsen mit beiden Methoden, obwohl früheren Autoren haben berichtet, dass gute Qualität ...

Aus der erstmaligen Anwendung von Perutz, Kendrew und Mitarbeiter bei der Bestimmung der Strukturen von Hämoglobin und Myoglobin, zu den modernen automatisierten Hochdurchsatz-Rohrleitungen der strukturelle Genomik Konsortien hat makromolekularen Röntgenkristallographie uns einen beispiellosen Einblick in die strukturelle Protein-Welt gewährt . Diese Technik bleibt die weithin für experimentelle Methode, die die direkte Visualisierung von Proteinstrukturen auf atomarer erlaubt oder in der Nähe atomarer Auflösung (dh in der 3.1 Å-Bereich). Eine Voraussetzung für die Röntgenbeugung an ein Protein angewendet werden, ist, dass es zunächst kristallisiert werden, und es ist diese Stufe des Verfahrens, die die größte einzelne geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Strukturaufklärung von Beugungsmethoden 1, 2 bleibt. Trotz erheblicher Fortschritte in unserem Verständnis des Prozesses der Proteinkristallisation, und die wichtigsten Verbesserungen in der Qualität und Verfügbarkeit der Kristallisation Bildschirme,Tabletts, und verwandte Technologien bleibt es unmöglich, die Wahrscheinlichkeit des Erfolgs Kristallisations 3 zuverlässig vorhersagen. Biochemische und biophysikalische Methoden angewendet werden, um zu beurteilen, ob ein Protein von Interesse zeigt günstige Eigenschaften für die Kristallkeimbildung und Wachstum, ist also gut gefaltet, homogen, monodisperse etc. werden jedoch diese Erkenntnisse in keiner Weise eine definitive Prädiktor Kristallisations Neigung. Seeding ist schon lange behauptet worden, um eine praktikable Methode zur Verbesserung der Anzahl, Größe und Qualität der vorhandenen Kristalle oder kristallines Material 4-7 sein. Dieser Ansatz basiert auf der Prämisse, dass ein Zustand, der Kristallkeimbildung unterstützt möglicherweise nicht optimal für die anschließende Kristallwachstum und umgekehrt basiert. Durch die Übertragung von kernhaltigen Material von einem Zustand zum anderen, kann man versuchen, diese Prozesse effektiv zu entkoppeln und damit den Zugang zu neuen, noch unerforschten Raum Kristallisation,und als Ergebnis eine Erhöhung der Gesamterfolgsrate eines Screening-Experiment. Etablierte Methoden (i) macroseeding, die Übertragung eines Einkristalls in ihrer Gesamtheit von einem Zustand zu einem anderen 8, (ii) Animpfen Streifen, die Übertragung von kernhaltigen Material, in der Regel durch die Anwendung von gerichteten Druck unter Verwendung beispielsweise erhalten dokumentiert ein Whisker auf der Oberfläche eines vorhandenen Kristall, gefolgt von der anschließenden Passage des Whiskers mit einem neuen Kristallisationstropfen 9, und (iii) &quot;klassische&quot; microseeding die Übertragung von Kristall &quot;Keime&quot; von Ernte erzeugten zerkleinerten Kristalle (oder kristallinen Material), in die Bedingungen, ähnlich denen, die den Samen 10 ergab. Insbesondere alle drei dieser Methoden sind zeitaufwendig und schlecht skalierbar, sicher im Vergleich zu dem, was erreichbar ist mit modernen Liquid Handling Kristallisation Robotik. Diese Faktoren haben dazu beigetragen, auf einer bestimmten Ebene zumindest auf die Wahrnehmung, dass die Saatguting ist eine Methode, um nur besucht, wenn andere Ansätze haben es versäumt, Früchte tragen werden. Zufallsmatrix microseeding (RMM) ist eine neue methodische Innovation, die die Vorteile der traditionellen microseeding mit denen von Hochdurchsatz-Screening und Skalierbarkeit 11-13 verbindet. Dieser Ansatz beruht auf der Erzeugung eines Saatgut, aus kernhaltigen kristallinen Materials, die in / auf jeden sub-well/coverslip innerhalb eines Standard-96-Zustand Kristallisation Bildschirm aliquotiert werden können, hergestellt. Dieses Verfahren ist sowohl im Sitzen oder hängenden Tropfen Dampfdiffusionsexperimente, entweder von Hand oder mit Liquid-Handling-Robotik, in 24-Well-oder 96-Well-Format Fach etabliert. RMM wurde experimentell nachgewiesen, dass die Kristallisation Erfolgsquote deutlich zu erhöhen, und produzieren Kristalle von mehr Beugungs Qualität und Quantität 11, 13, 14, und stellt ein innovatives Instrument in der Kristallographen &quot;Arsenal der Ansätze in der oLaufende Anstrengungen zur Kristallisation Erfolg. Hier beschreiben wir ein allgemeines Verfahren zur RMM und Probendaten bereitzustellen, die die Wirksamkeit dieser Technik.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC 96 well crystallization trays</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD11-00-100</td>
			<td>Non-UV compatible, for screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearView sealing sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD6-01S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg white lyzozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>~95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver catylase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td>&gt;95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylanase</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR7-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-40</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-36</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-47</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Phoenix liquid handling system</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2646-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 0.1-2.5 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 2-20 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 100-1000 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-37</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-29</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrystalClene coverslips 18 mm</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD4-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well XRL crystallization tray</td>
			<td>Molecular Dimensions Limited</td>
			<td>MD3-11</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening

Zufalls microseed Matrix-Screening (RMM) ist ein Protein, in dem Kristallisationstechnik Impfkristalle zufällige Bildschirme aufgenommen. Durch die Erhöhung der Wahrscheinlichkeit, dass die Kristalle in der metastabilen Zone Phasendiagramm eines Proteins wachsen, werden zusätzliche Kristallisation führt oft erhalten, die Qualität der Kristalle hergestellt werden, können erhöht werden, und eine gute Versorgung der Kristalle für die Datensammlung und Einweichen Experimente ist. Hier beschreiben wir eine allgemeine Methode zur Risikomanagementmaßnahmen, die entweder im Sitzen Drop oder hängenden Tropfen Dampfdiffusionsexperimente, entweder von Hand oder mit Liquid-Handling-Robotik, in 96-Well-oder 24-Well-Format etabliert Fach angewandt werden können.

(A) Beispiel für ein Experiment Rmms Um die Wirksamkeit der RMM-Screening zeigen wir diese Methode angewandt, um die Kristallisation von Hühnereiweiß-Lysozym (HEWL) und Rinderleber-Katalase (BLC). Beide Enzyme sind hervorragend kristallisierbarem und strukturell gut charakterisiert Ziele 15, 16. Als solche bieten beide ausgezeichnete Testpersonen, mit denen die Erfolgsquote verbesserte Kristallisations erreichbar mit RMM illustrieren. Es wurden Experimente in 96-Well-Sitting Drop ...

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Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Hier beschreiben wir ein allgemeines Verfahren für zufällige microseed Matrix-Screening. Diese Technik wird gezeigt, dass die Erfolgsrate der Proteinkristallisation Screening-Experimenten deutlich erhöhen, reduzieren die Notwendigkeit für Optimierung, und bieten eine zuverlässige Versorgung von Kristallen für die Datenerhebung und-Ligand-Einweichen Experimenten.

Verbesserung der Erfolgsrate der Proteinkristallisation nach Zufall Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

improving-success-rate-protein-crystallization-random-microseed

Research

JoVE Journal

Biology

17.7K Aufrufe.  University of Bristol.  Hier beschreiben wir ein allgemeines Verfahren für zufällige microseed Matrix-Screening. Diese Technik wird gezeigt, dass die Erfolgsrate der Proteinkristallisation Screening-Experimenten deutlich erhöhen, reduzieren die Notwendigkeit für Optimierung, und bieten eine zuverlässige Versorgung von Kristallen für die Datenerhebung und-Ligand-Einweichen Experimenten. 

Serie: Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Forschung

Biologie

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

Die Beurteilung Zweidimensionale Kristallisation Trials of Small Membranproteinen für Strukturbiologie Studien Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

Proteinkristallisation für X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been identified and are separated into six groups based on their structure and substrate specificity (collagenases, gelatinases, membrane type [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, and others). MMPs play a critical role in cell invasion, cartilage degradation, tissue remodeling, wound healing, and embryogenesis. They therefore participate in both normal processes and in the pathogenesis of many diseases, such as rheumatoid arthritis, cancer, or chronic obstructive pulmonary disease1-6. Here, we will focus on MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), a widely expressed MMP. We will demonstrate how to detect MMP-2 in cell culture supernatants by zymography, a commonly used, simple, and yet very sensitive technique first described in 1980 by C. Heussen and E.B. Dowdle7-10. This technique is semi-quantitative, it can therefore be used to determine MMP levels in test samples when known concentrations of recombinant MMP are loaded on the same gel11.
Solutions containing MMPs (e.g. cell culture supernatants, urine, or serum) are loaded onto a polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS; to linearize the proteins) and gelatin (substrate for MMP-2). The sample buffer is designed to increase sample viscosity (to facilitate gel loading), provide a tracking dye (bromophenol blue; to monitor sample migration), provide denaturing molecules (to linearize proteins), and control the pH of the sample. Proteins are then allowed to migrate under an electric current in a running buffer designed to provide a constant migration rate. The distance of migration is inversely correlated with the molecular weight of the protein (small proteins move faster through the gel than large proteins do and therefore migrate further down the gel). After migration, the gel is placed in a renaturing buffer to allow proteins to regain their tertiary structure, necessary for enzymatic activity. The gel is then placed in a developing buffer designed to allow the protease to digest its substrate. The developing buffer also contains p-aminophenylmercuric acetate (APMA) to activate the non-proteolytic pro-MMPs into active MMPs. The next step consists of staining the substrate (gelatin in our example). After washing the excess dye off the gel, areas of protease digestion appear as clear bands. The clearer the band, the more concentrated the protease it contains. Band staining intensity can then be determined by densitometry, using a software such as ImageJ, allowing for sample comparison.

This protocol describes an activity-based assay for detecting matrix metalloproteinases in culture supernatants or body fluids.

Erkennung von Functional Matrix-Metalloproteinasen durch Zymographie

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Die Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

Single Particle Electron Microscopy Rekonstruktion der Exosom Complex Mit der Random-konische Tilt-Methode

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the Mgm101 protein is involved in the recombinational repair of mitochondrial DNA. Recent investigations have indicated that Mgm101 is related to the Rad52-type recombination protein family. These proteins form large oligomeric rings and promote the annealing of homologous single stranded DNA molecules. However, the characterization of Mgm101 has been hindered by the difficulty in producing the recombinant protein. Here, a reliable procedure for the preparation of recombinant Mgm101 is described. Maltose Binding Protein (MBP)-tagged Mgm101 is first expressed in Escherichia coli. The fusion protein is initially purified by amylose affinity chromatography. After being released by proteolytic cleavage, Mgm101 is separated from MBP by cationic exchange chromatography. Monodispersed Mgm101 is then obtained by size exclusion chromatography. A yield of ~0.87 mg of Mgm101 per liter of bacterial culture can be routinely obtained. The recombinant Mgm101 has minimal contamination of DNA. The prepared samples are successfully used for biochemical, structural and single particle image analyses of Mgm101. This protocol may also be used for the preparation of other large oligomeric DNA-binding proteins that may be misfolded and toxic to bacterial cells.

The yeast mitochondrial nucleoid protein, Mgm101, is a Rad52-type recombination protein that forms large oligomeric rings. A protocol is described to prepare soluble recombinant Mgm101 using the Maltose Binding Protein (MBP)-tagging strategy coupled with cation exchange and size exclusion chromatography.

Vorbereitung des Mgm101 Rekombinationsprotein von MBP-based Tagging-Strategie

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA Screening zu Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen System Regler der biologischen Stoffwechselwege in kultivierten Säugerzellen identifizieren

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

Genomweite Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Screening Protein-Fragment Komplementierungsassay (PKA) in lebenden Zellen

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...