Wir danken Herrn Dr. S. Ressler (Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine) für die Annahme, die Verwendung von Protein-Konzentratoren, um die Konzentration von MMPs in Zellkulturüberständen erhöhen danken. Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse der Mrs. Clifford Elder Weiß Graham Stiftungsprofessur Research Fund und die NIH / NIAMS (AR059838) zu CB unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des NIH.

1. Laden und Ausführen der Gel <ol><li> Alle Proben sind entsprechend vorbereitet werden, um die Funktion der Enzyme erhalten und sofort nach der Entnahme verwendet oder gelagert bei -80 ° C. Die Proben dürfen keine Reduktionsmittel (eine solche β-Mercaptoethanol) oder vor Gelbeladung abgekocht werden. </li><li> Öffnen Sie den Beutel mit einem Gel in einer Kassette, spülen Sie die Kassette mit entionisiertem Wasser. <ul><li> Entfernen Sie die Schutzfolie von der Unterseite der Kassette und der Kamm von der Spitze des Gels. </li><li> Spülen Sie die Vertiefungen dreimal mit Laufpuffer (verdünnt auf 1X in VE-Wasser). </li><li> Legen Sie das Gel in den Mini-Cell, sicherzustellen, dass die kleinere Seite der Kassette nach innen Gesichter. Einrasten mit dem Gel Tension Wedge. Die Mini-Cell erlaubt es, ein oder zwei Gele parallel laufen. </li><li> Füllen Sie den oben (innen) Kammer mit 1X-Laufpuffer über Brunnen Ebene, auf Lecks überprüfen. Im Falle eines Lecks, entfernen Sie die Puffer und die Position des Gels. </li><li> Füllen Sie die untere Kammer mit 1X-Laufpuffer. </li></ul></li><li> Legen Sie 10 ul Protein molekularer Marker in einem gut. <ul><li> Mix eine gleiche Menge an Gel-Ladepuffer und der Probe und der Last in die Vertiefungen des Gels mit Gel-loading Tipps (geänderte zwischen jeder Probe). Diese Vertiefungen können mit geladen werden bis zu 20 ul total. </li></ul></li><li> Setzen Sie den Deckel auf dem Mini-Cell und die Elektrode Kabel an die Stromversorgung. Schalten Sie die Stromversorgung an und stellen es auf 125 V konstant für 90 Minuten laufen. Überprüfen Sie die Bildung von kleinen Bläschen auf den Draht der unteren Kammer, zur Anzeige der aktuellen Auflage. </li><li> Bei der Ausführung Ihrer ersten Gel, Monitor Fortschritt der Migration alle 15 Minuten, mit dem Bromphenolblau im Ladepuffer als Indikator enthalten. Lassen Sie das Gel laufen, bis der Indikator-Farbstoff erreicht den Boden des Gels. </li></ol> 2. Renaturierung und Entwicklung der Gel <ol><li> Für jedes Gel, Herstellung von 100 ml 1X Renaturierungspuffer und 200 ml denaturierenden Puffer, sowohl in deionisiertem Wasser. </li><li> Wenn die Bromphenolblau Markerfarbstoff der Unterseite des Gels erreicht hat, schalten Sie die Stromversorgung aus, öffnen Sie den Mini-Cell, und entfernen Sie das Gel. Trennen Sie die beiden Seiten der Kassette mit der Gel-Messer (oder einer Waage Spatel). Schneiden Sie eine Ecke, um das Gel die Richtung zu markieren. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Gel aus der Kassette und in einen Behälter mit 100 ml Renaturierungspuffer. Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. </li><li> Entfernen Sie die Renaturierungspuffer und 100 mL der Entwicklung Puffer, um das Gel. Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. </li><li> Entfernen Sie die Entwicklung von Puffer und 100 ml mehr entwickeln Puffer, um das Gel. Inkubieren über Nacht (16-18 Stunden) bei 37 ° C. </li><li> Entfernen Sie die Entwicklung von Puffer und spülen dreimal (5 Minuten) mit destilliertem Wasser unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur. </li><li> Scannen Sie das Gel auf die exakte Positionierung des Proteins Standard Bands sparen werden, da sie weniger oder gar nicht sichtbar, nachdem Gelfärbung. </li><li> Stain das Gel durch Zugabe von 20 ml SimplyBlue Safestain auf das Gel. Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. </li><li> Entfernen Sie die SimplyBlue SafeStain und de-Fleck das Gel in 100 ml oder mehr VE-Wasser für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. </li><li> Für bessere Ergebnisse mit frischem deionisiertem Wasser und inkubieren ersetzen noch eine Stunde oder mehr bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. </li></ol> 3. Data Analysis <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig das Gel aus dem Wasser und in einer Plastikplane Schutz. </li><li> Scannen Sie das Gel mit einer Auflösung von 300 dpi oder höher. Speichern Sie das Bild im TIFF-Format (Abbildung 1A). </li><li> Messen Bandenintensitäten mit ImageJ (oder eine andere ähnliche Software). <ul><li> Öffnen Sie die TIFF-Datei in ImageJ (Abbildung 1A). </li><li> Visualisieren Sie in Schwarz und Weiß, indem Sie &quot;Bild&gt; Typ&gt; 8-bit&quot; (Abbildung 1B). </li><li> Verwenden Sie die rechteckige Auswahl Werkzeug, um die erste Band, skizzieren, zeichnen Sie ein Rechteck mindestens zweimal höher als breit ist (dies ist ein Software-Anforderung). </li><li> Drücken Sie die &quot;1&quot; oder wählen Sie &quot;&gt; Gels Analyze&gt; Wählen erste Gasse&quot; und die Band skizziert werden soll. </li><li> Ein neues Rechteck erscheint, verschieben Sie es auf die nächste Band, und wählen Sie &quot;Analysieren&gt; Gele&gt; Wählen nächsten lane&quot;. Wiederholen, bis alle Bands ausgewählt werden (Abbildung 1B). </li><li> &quot;3&quot; drücken, oder wählen Sie &quot;Analysieren&gt; Gele&gt; Plot Gassen&quot;, um das Profil Grundstück für jedes Band (Abbildung 1C) zu generieren. </li><li> Verwenden Sie die gerade Linie Auswahl (sollte bereits automatisch ausgewählt werden), um Grundlinien zu ziehen, so dass die Spitze von Interesse ist eine komplett geschlossene Fläche. </li><li> Wählen Sie den Zauberstab-Werkzeug und klicken Sie in jeder Spitze um es auszuwählen. </li><li> Wählen Sie &quot;Analysieren&gt; Gele&gt; Label Spitzen&quot;, um eine Tabelle mit dem Bereich für jede ausgewählte Gipfel zu erreichen. Diese Daten können als solche dargestellt werden (FBBILDUNG 1D) oder auf den Wert einer ausgewählten Band normalisiert werden. Diese Normalisierung ist besonders wichtig, wenn die Bündelung Werte von mehreren replizieren Gele, um statistische Signifikanz der Ergebnisse zu bestimmen. </li></ul></li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Wir zeigen ein Gel mit 11 Bohrungen mit unterschiedlichen Zellkulturüberständen mit unterschiedlichen Mengen an MMP-2 (Abbildung 1A) geladen. Die direkte Beobachtung dieses Gel zeigt deutliche Unterschiede in MMP-2-Konzentrationen zwischen einigen der Brunnen. Zum Beispiel ist es klar, dass Brunnen Nr. 4 und 5 viel MMP-2 als auch Nr. 11 oder sogar auch Nr. 10 enthalten. Für objektive Quantifizierung der Bands, die wir haben Densitometrie mit dem ImageJ-Software (Abbildung 1B-D) verwendet wird, bestätigt eine ca. 4-fache Differenz in MMP-2 Beträge zwischen gut # 11 und # Brunnen 4 und 5 sowie einer ca. 2-fache Differenz in MMP-2 Beträge zwischen gut # 10 und # Brunnen 4 und 5. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Erkennung von MMP-2 durch Gelatine Zymographie. A, gescannte Bild einer Gelatine-Gel. Nun Zahlen sind am oberen Rand des Gels angegeben. B, Same-Gel wie in A gezeigt in schwarz und weiß für Densitometrie. Jeder Band wurde mit einem Rechteck in ImageJ ausgewählt. C, Zwei Beispiele für Densitometrie-Profile für das Gel gezeigt in A und B (Bänder # 4 und # 11). Eine gerade Linie war an der Basis jeder Spitze gezogen, um einen geschlossenen Raum zu schaffen. D, Plot der Peakflächen für das Gel in A und B vor (links) und nach (rechts) Normalisierung der Dichte der Band Nr. 1 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Diese Zahl zeigt, wie Zymographie als semi-quantitative Verfahren eingesetzt werden kann. Wir haben serielle Verdünnungen (Schritte von 1:1 Verdünnungen) in 7 aufeinander folgenden Bohrungen geladen und gemessen die Band Dichten sowohl für pro-MMP-2 und MMP-2.

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	<li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+matrix+metalloproteinases+in+the+morphogenesis+of+the+cerebellar+cortex.">The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex.</a> Cerebellum. 4, 239-245 (2005).</li><li>Pasternak, B., Aspenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteinases+and+their+inhibitors+-+diagnostic+and+therapeutic+opportunities+in+orthopedics.">Metalloproteinases and their inhibitors - diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics.</a> Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).</li><li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases:+regulators+of+the+tumor+microenvironment.">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li><li>Lagente, V., Boichot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+matrix+metallopreoteinases+in+the+inflammatory+process+of+respiratory+diseases.">Role of matrix metallopreoteinases in the inflammatory process of respiratory diseases.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 48, 440-444 (2010).</li><li>Rodr&#237;guez, D., Morrison, C. J., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metallopreoteinases:+what+do+they+not+do?+New+substrates+and+biological+roles+identified+by+murine+models+and+proteomics.">Matrix metallopreoteinases: what do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1803, 39-54 (2010).</li><li>Bourboulia, D., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+(MMPs)+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+(TIMPs):+positive+and+negative+regulators+in+tumor+cell+adhesion.">Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): positive and negative regulators in tumor cell adhesion.</a> Semin. Cancer Biol. , (2010).</li><li>Heussen, C., Dowdle, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+analysis+of+plasminogen+activators+in+polyacrylamide+gels+containing+sodium+dodecyl+sulfate+and+copolymerized+substrates.">Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates.</a> Analytical Biochem. , 102-196 (1980).</li><li>Lombard, C., Saulnier, J., Wallach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+of+matrix+metalloproteinases+(MMPs)+activities:+a+review.">Assays of matrix metalloproteinases (MMPs) activities: a review.</a> Biochimie. 87, 265-272 (2005).</li><li>Snoek-van Beurden, P. A., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymographic+techniques+for+the+analysis+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors.">Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> Biotechniques. 38, 73-83 (2005).</li><li>Kupai, K., Szucs, G., Cseh, S., Hajdu, I., Csonka, C., Csont, T., Ferdinandy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+activity+assays:+importance+of+zymography.">Matrix metalloproteinase activity assays: importance of zymography.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 205-209 (2010).</li><li>Kleiner, D. E., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+zymography:+detection+of+pictogram+quantities+of+gelatinases.">Quantitative zymography: detection of pictogram quantities of gelatinases.</a> Anal. Biochem. 218, 325-329 (1994).</li><li>Yu, W. H., Woessner, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-enhanced+zymographic+detection+of+matrilysin+and+collagenases.">Heparin-enhanced zymographic detection of matrilysin and collagenases.</a> Anal. Biochem. 293, 38-42 (2001).</li></ol>

Wir haben gezeigt, wie man zymographische Analyse der MMP-2 in Zellkulturüberständen durchzuführen. Die Höhe der Probe auf ein Gel Last muss empirisch ermittelt je nach Herkunft und MMP von Interesse sein. Lädt zu wenig wird Erkennung verhindern beim Laden zu viel kann bis zur Sättigung führen, da es nur so viel Substrat einer Protease im Bereich der Band verdauen können. Falls erforderlich, kann die Probe in deionisiertem Wasser vor dem Mischen mit Ladepuffer oder die Entwicklungszeit verdünnt werden kann de reduziert von über Nacht bis 4 Stunden. Es ist auch möglich, Proteine ​​in einer Lösung mit Konzentratoren (zB Millipore Katalog # UFC803024) konzentrieren. Wenn Bands kaum sichtbar bleiben, kann es notwendig sein, um die Gele für einen längeren Zeitraum zu entwickeln, auch bis zu 48 Stunden. Bei der Vorbereitung Proben aus Zellkultur-Überstände, darauf hinzuweisen, dass fötales Rinderserum (und andere Seren) MMPs, dass die Ergebnisse beeinflussen können, enthält. Aus diesem Grund erheben wir alle unsere Überstände nach der Kultur in serum-freiem Medium. Die Waschungen in den Absätzen 2.9 und 2.10 des Protokolls beschrieben sind notwendig, um die Hintergrundfärbung der verdauten Bands entfernen. Längere Waschzeiten löscht mehr Hintergrund, sondern auch dim die Färbung des Substrates durch das Gel. Wenn mehr Waschzeiten notwendig sind, empfehlen wir das Scannen des Gels alle paar Stunden, um den Scan mit dem besten Kontrast zu wählen. Diese Technik kann verwendet werden, um andere MMPs zu erkennen. Zum Beispiel kann MMP-9 auf Gelatine-Gelen nachgewiesen werden, und auch in geringerem Umfang MMP-1, MMP-8 und MMP-13 wie Gelatine ist nicht ihr bevorzugtes Substrat. MMP-1 und MMP-13 sind am besten auf Kollagen Zymographie erkannt, während Kasein ist das bevorzugte Substrat für die MMP-11 und ermöglicht auch den Nachweis von MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12 und MMP-13 9. MMP-7 (Matrilysin) und Kollagenasen (MMP-1 und MMP-13) sind schwer zu erkennen, wenn in geringen Mengen in Kasein oder Gelatine-Gelen. Die Zugabe von Heparin auf die Probe zum Zeitpunkt der Gel-loading verbessert die Nachweisgrenze für MMP-7. Für MMP-1 und MMP-13, muss das Heparin zu dem Gel nach der elektrophoretischen Lauf ist bereits im Gange 12. Da Zymographie Maßnahmen enzymatische Aktivität nach Denaturierung und Renaturierung der Enzyme, wird es messen die Aktivität aller MMPs in der Probe vorhanden. Dies sind Enzyme, Pro-Enzyme und Enzyme gebunden endogenen Inhibitoren (zB TIMP-2). Es ist jedoch möglich, das Niveau der MMP Aktivierung in der Probe durch den Vergleich der Band Dichte des aktiven Enzyms und dass der Pro-Enzym, das einen etwas höheren Molekulargewicht bestimmen. Zymographie ist oft nicht ausreichend, um eine MMP zu identifizieren. Vergleich der Höhe der Migration eines MMP mit bekanntem Molekulargewicht-Standards ist bei der Identifizierung helfen, aber es sei darauf hingewiesen, dass einige dieser Standards ein Reduktionsmittel enthalten, und dass, wenn sie unter nicht-reduzierenden Bedingungen verwendet sie unterschiedliche Molekulargewichte 9 geben werden. Eine Option ist, um eine lösliche rekombinante MMP auf dem gleichen Gel als die Prüflinge zu laden. MMPs kann jedoch mit anderen Proteinen assoziiert sein, Induktion einer Änderung der scheinbaren Molekulargewicht. Selektive MMP-Inhibitoren kann das Gel (oder ein Teil eines Gels halbiert) während der Inkubation in der Entwicklung Puffer als pharmakologische Werkzeuge, um die Identität hinzugefügt werden die MMP von interest.A zweite Technik (Western Blot, Immunzytochemie, oder ELISA) zu empfehlen Hilfe bei der Identifizierung der MMP von Interesse. Anzumerken ist, dass Nachweisgrenzen für Western Blots oft viel niedriger als die der zymographische Gele, was möglicherweise zu falsch-negative Ergebnisse bei der Verwendung dieser Technik werden.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EI0001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Power supply (model 302)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>93000-744</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EC61752BOX</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blue Juice gel loading buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10816015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel loading tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>53509-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein molecular weight standard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC5800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex Tris-Glycine-SDS running buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2675</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex zymogram renaturing buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2670</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex zymogram developing buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SimplyBlue SafeStain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC6060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Epson Perfection 4490 Photo Scanner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amazon</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageJ software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://rsbweb.nih.gov/ij/ </td>
<td>n/a</td>
<td>Authored by W. Rasband, NIH/NIMH</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

detection of functional matrix metalloproteinases by zymography

Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) sind Zink-haltigen Endopeptidasen. Sie bauen Proteine ​​durch Spaltung von Peptidbindungen. Mehr als zwanzig MMPs wurden identifiziert und sind in sechs Gruppen auf ihre Struktur und Substratspezifität (Kollagenasen, Gelatinasen Membran Typ [MT-MMP], Stromelysine, matrilysins, und andere) basieren getrennt. MMPs spielen eine entscheidende Rolle bei der zellulären Invasion Knorpelabbau, Gewebe-Remodeling, Wundheilung, und Embryogenese. Sie daher in normalen Prozessen und in der Pathogenese vieler Erkrankungen, wie rheumatoide Arthritis, Krebs oder chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung 1-6 teilnehmen. Hier werden wir uns auf MMP-2 (Gelatinase A, Typ IV Kollagenase), eine weit verbreitete Ausdruck MMP konzentrieren. Wir werden zeigen, wie MMP-2 in Zellkulturüberständen erkennen zymographisch, eine häufig verwendete, einfache und doch sehr sensible Technik zuerst 1980 von C. Heussen und EB Dowdle 7-10 beschrieben. Diese Technik ist semi-quantitative, kann es daher zur MMP Ebenen in Testproben zu bestimmen, wenn bekannte Konzentrationen von rekombinanten MMP auf dem gleichen Gel 11 sind geladen werden. Und Gelatine (Substrat für MMP-2); Lösungen, die MMPs (zB Zellkulturüberstände, Urin oder Serum) werden auf ein Polyacrylamidgel mit Natriumdodecylsulfat (um die Proteine ​​zu linearisieren SDS) geladen. Der Probenpuffer wurde entwickelt, um Proben Viskositätsanstieg (bis Gelbeladung zu erleichtern), eine Tracking-Farbstoff (Bromphenolblau; zum Beispiel die Migration-Monitor), bieten denaturierenden Moleküle (Proteine ​​linearisieren) und Kontrolle der pH-Wert der Probe. Proteine ​​sind dann unter einen elektrischen Strom in einem Laufpuffer entworfen, um eine konstante Wanderungsgeschwindigkeit bieten zu migrieren. Der Abstand der Migration ist umgekehrt mit dem Molekulargewicht des Proteins (kleine Proteine ​​schneller bewegen durch das Gel als große Proteine ​​und damit die Migration weiter unten in der Gel) korreliert. Nach der Migration wird das Gel in einer Renaturierungspuffer gelegt, damit Proteine ​​ihre Tertiärstruktur, die für enzymatische Aktivität wiederzugewinnen. Das Gel wird dann in einem Entwicklungsland Puffer so konzipiert, dass die Protease seine Substratverdau platziert. Die Entwicklung Puffer enthält auch p-aminophenylmercuric (APMA), um den nicht-proteolytische Pro-MMPs in den aktiven MMPs aktivieren. Der nächste Schritt besteht in der Färbung des Substrats (Gelatine in unserem Beispiel). Nach dem Waschen der überschüssigen Farbstoff aus dem Gel Bereichen Proteaseverdau als klare Streifen erscheinen. Je klarer die Band, je konzentrierter die Protease enthält. Band Färbeintensität kann dann durch Densitometrie ermittelt werden, mit einer Software wie ImageJ, so dass für die Probenvorbereitung Vergleich.

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Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Dieses Protokoll beschreibt eine activity-based-Assay zum Nachweis Matrixmetalloproteinasen in Kulturüberständen oder Körperflüssigkeiten.

Erkennung von Functional Matrix-Metalloproteinasen durch Zymographie

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

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Research

JoVE Journal

Biology

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Serie: Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Forschung

Biologie

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

Erkennung von Post-translationale Modifikationen auf Native Intact Nukleosomen mittels ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen zur Strukturaufklärung von Makromolekulare Kristallographie Grown

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

Verbesserung der Erfolgsrate der Proteinkristallisation nach Zufall Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Erkennung von Live-<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7-Zellen durch PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal Glucocorticoid-Analyse: Nicht-invasive Monitoring-Adrenal in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

Nachweis von RNA-bindenden Proteinen durch<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down in Adipocyte Kultur

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.