Diese Arbeit wurde durch ein Burroughs Wellcome Investigator Award für YM und durch eine Brown-Coxe Postdoktoranden-Stipendium an der Yale University zu MD unterstützt.

Materialien: <ul><li> Protein Probe - Lysozym (50 mg / mL) </li><li> Hanging drop 24-Well-Schale </li><li> Sitting Drop 24-Well-Schale </li><li> Microbatch Kristallisation 96-Well-Schale </li><li> Kristallisation Lösungen (entweder kommerziell verfügbar oder hausgemacht) </li><li> Silikonfett </li><li> 5 ml Spritze ohne Luer-Lock </li><li> Silikonisierten Deckgläschen </li><li> Optische Dichtband </li><li> Paraffin </li><li> 0,1-2 ul Mikropipette mit Low-Retention-Tipps </li><li> Pinzette </li><li> Professionelle Reinigungstücher </li></ul> 1. Hanging / Sitting Drop Vorgehen: <ol><li> Für eine erste Bildschirm kann man verwenden Sie handelsübliche Bildschirme, der Sparse-Matrix unvollständigen faktoriellen Methode von Versuch Bedingungen zu nutzen. Die Sparse Matrix unvollständige faktorielle Methode wird von voreingenommen sind und aus bekannten Kristallisationsbedingungen für Makromoleküle (Carter and Carter, 1979; Cudney et al, 1994;. Jancarik und Kim, 1991;. Jancarik et al, 1991). Wenn die Kristallisation Zustand bereits bekannt ist, kann eine schmale Bildschirm montiert werden, die Variation der Fällungsmittel-Konzentration und pH-Wert um den Original-Hit. Die am häufigsten erfolgreich Fällungsmittel ist Polyethylenglykol (PEG), gefolgt von Ammoniumsulfat gefolgt. Zusammen sind diese beiden Fällungsmittel machen etwa 60% aller erfassten makromolekularen Fällungsmittel für die Kristallisation (Gilliland et al, 1994.; Kimber et al, 2003;.. Page et al, 2003) verwendet. </li><li> Bereiten Sie Ihre Kristallisation Lösungen. In der Regel sind diese Bedingungen von einem Fällungsmittel, Salz irgendeiner Art und einen Puffer, um den pH-Wert kombiniert. In einigen Fällen Zusatzstoffe können die speziell für das Protein von Interesse hinzugefügt werden. Alle Stammlösung sollte gefiltert werden mit 0,22 um Filter sein. Einige der Stammlösung kann sehr zähflüssig (50% PEG, Glycerin, PEG-MME, etc). <ul><li> Bereiten Sie 1,5 ml 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6 M NaCl jeweils in 0,1 M NaOAc pH 4,0, 4,3, 4,6 und 4,9 (insgesamt 24 Lösungen) </li></ul></li><li> Thaw Ihre Proteinprobe und halten auf dem Eis. Protein Aktien sollten bei -80 ° C gelagert werden, wenn das Protein von Interesse ist empfindlich gegen Frost / Tau-Zyklen (wenn ja, lagern bei 4 ° C). Typische Protein-Konzentrationen im Bereich von 5-50 mg / mL, mit höheren Konzentrationen in der Regel gibt bessere Ergebnisse. </li><li> Spin der Probe 15min/18, 000xg / 4 ° C - einige Proteine ​​neigen dazu, teilweise zu aggregieren und Niederschlag nach einem Tauwetter Schritt. Diese Aggregate fördern können amorphe Fällung von dem Rest der Proteinmoleküle daher gründliche Spin-Down garantiert Ihnen nur lösliche Moleküle in Ihrer Probe. Keep Protein auf Eis, bis die Einrichtung des Fachs. </li><li> Bestimmen Sie die Protein-Konzentration von seiner Absorption bei 280 nm mit einem UV-Spektrophotometer. Die Proteinkonzentration kann aus der Extinktion und des Proteins Extinktionskoeffizienten berechnet werden. : Der Extinktionskoeffizient kann mit dem ProtParam Tool auf der Website ExPASy berechnet werden <a href="http://ca.expasy.org/tools/protparam.html">http://ca.expasy.org/tools/protparam.html</a> </li><li> Füllen Vertiefungen der 24-Well-hängenden / Sitting Drop-Fach mit 500 ul Fällungslösung nach dem Fachkonfiguration Schema (Abbildung 2B). Erstellen Sie ein Silikonfett Ring um den Rand des Brunnens. Der Ring sollte eine kleine Lücke, um Luft Druckaufbau zu verhindern, wie die gut verschlossen ist. Im Sitzen fällt, gibt es keine Notwendigkeit für Fett, da die gut mit Klebeband versiegelt ist (Abbildung 2A). </li><li> Nehmen Sie einem Deckglas und reinigen Sie sie mit verdichteter Luft sprühen, oder eine professionelle wischen - Vermeidung von Staub wird die Interpretation der Kristallisation Drop und beseitigen Verunreinigungen. Zum Sitzen fällt, sind Deckglas nicht verwendet. Stattdessen enthält die gut ein Regal, auf dem die Protein-und Fällungsmittel vermischt werden. </li><li> Setzen Sie gleiche Volumina der Proteinprobe und Reservoir-Lösung auf dem Deckglas. Unterschiedliche Mengen an Protein und Fällungsmittel kann als Teil des Optimierungsprozesses ausprobiert werden. Mit mehr Protein als Fällmittel ergibt sich ein Netto-Konzentration des Proteins in der Dropdown nach Erreichen des Gleichgewichts, was wünschenswert sein kann für verdünnte Protein-Proben und zur Keimbildung oder das Wachstum zu verlangsamen. Alle anderen nicht-flüchtigen Substanz in der Dropdown-Lösung wird auch durch den gleichen Faktor zu konzentrieren. Beim Pipettieren der Protein-und Reservoir-Lösungen auf den Deckel schieben, äußerst vorsichtig sein, um eine Blasenbildung zu vermeiden. Dies geschieht häufig, wenn Luft aus der Pipette ausgeblasen. <ul><li> Hanging drop: Load 2 ul 50 mg / ml Lysozym in 0,02 M NaOAc pH 4,9 bis der Mitte des Deckels schieben und fügen Sie 2 ul des Reservoirs Lösung. </li><li> Sitting Drop: Load 2 ul 50 mg / mL Lysozym-Lösung in die Mitte des Regals und fügen Sie 2 ul der Reservoir-Lösung. </li></ul></li><li> Klappen Sie den Deckel gleiten sanft und legte sie auf den Fett-Ring an der Oberseite des Brunnens. Drücken Sie vorsichtig, so dass Luft aus dem Brunnen durch die Kerbe Flucht in das Fett zu prVeranstaltung Luft Druckaufbau in der gut und halten Sie die gut verschlossen. Air Druckaufbau in den Brunnen kann heben Sie den Deckel schieben, dabei die gut abdichten. In der Sitzung Drop-Methode ist optisch klar durchsichtige Klebeband verwendet werden, um die Brunnen zu decken. Daher wird in dieser Methode Abdichtung findet alle Zeilen / Spalten. </li><li> Fahren Sie mit dem nächsten Brunnen, bis Fach ist abgeschlossen. </li><li> Überprüfen Sie das Tablett auf Setup - Beseitigung von Staub und anderen Verunreinigungen können die falsch positiven Identifikation von Protein-Kristalle zu reduzieren. </li><li> Verwenden Sie ein Scoring, um Ihr Experiment zu dokumentieren. </li><li> Setzen Sie das Fach an der gewünschten Inkubationstemperatur, in der Regel zwischen 4 ° C und Raumtemperatur. 20 ° C wird am häufigsten erfolgreich. Achten Sie darauf, um das Fach vorsichtig umgehen und vermeiden Sie zu zittern. Seien Sie vorsichtig beim Öffnen und Schließen des Inkubators Tür. Vibrationen oder Temperaturschwankungen während des Transports oder der Inkubation kann verhindern das Kristallwachstum oder negativ beeinflussen Kristallqualität. Ein Schock absorbierendem Material (zB Verpackung Schaum) kann als Polsterung unter dem Kristall Schalen verwendet werden. </li><li> Überprüfen Sie das Fach für die Kristalle des folgenden Tages, und dann alle paar Tage, immer Umgang mit den Tabletts mit Sorgfalt. Dokumentieren Sie alle Befunde und Drop Morphologien in einem Fach spezifische Auswertungsbogen. Kristalle in der Regel dauern 2-5 Tage zu erscheinen, obwohl Kristalle gelegentlich viel früher (fast sofort) oder später (bis zu mehreren Monaten!) Erscheinen. Sobald Kristallisationsbedingungen identifiziert wurden und die Wachstumsrate der Kristalle bekannt ist, ist es am besten, lassen Sie die Schalen ungestört, bis sich Kristalle erschienen sind und wuchs auf mindestens die Hälfte ihrer endgültigen Größe. Verlassen des Tabletts ungestört können die Anzahl der Kristallkeimbildung Ereignisse, es kommt zu einer kleineren Anzahl von größeren Kristallen. </li></ol> 2. Microbatch Vorgehen: <ol><li> Protein Probe und Fällungsmittel Vorbereitung sind, wie oben beschrieben. </li><li> Luftspritzen eine neue Microbatch Tablett, um keinen Staub und andere große Partikel. </li><li> In der Microbatch Tablett, füllen Paraffinöl bis zu 3 mm hoch (gerade genug, um den Brunnen abdecken). Entfernen Sie den Zugriff von Öl. </li><li> Load 1 ul der Protein-Lösung (50 mg / ml Lysozym) in das Öl befüllt und - achten Sie darauf, die Lösung direkt Pipette auf den Grund des Brunnens (Abbildung 2A). </li><li> Laden 1 ul Fällungslösung in den Brunnen nach dem Fachkonfiguration Schema (Abbildung 2B) - sicherstellen, dass die Tropfen sinkt auf den Grund des Brunnens und Sicherungen mit dem Protein Tröpfchen. </li><li> Gehen Sie zum nächsten gut, bis Fach ist abgeschlossen. </li><li> Befolgen Sie die Schritte 11-14 der hängenden / Sitting Drop Verfahren. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: Die Kristallisation ist in der Regel als der Flaschenhals Röntgenkristallographie bezeichnet. Ein Sparse Matrix unvollständigen faktoriellen Bildschirm des ausfallenden Bedingungen produziert typischerweise viele verschiedene Arten von Protein-Aggregation und Präzipitation, darunter große Einkristalle. Wenn das Protein oder Fällungsmittel zu hohen Konzentrationen kann man braunen Masse ohne bestimmte Form und Größe (amorphe Niederschlag) zu sehen. Wenn die Lösung untersättigt ist, werden die Tropfen oft völlig klar und frei von jeder Art von Niederschlag. Abbildung 3 zeigt einige Beispiele für die Fällung Phänomene und Kristalle (Dessau et al., 2006). Mehr Niederschläge Phänomene mit detaillierteren Interpretation finden Sie unter <a href="http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html">http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html</a> . <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Das Prinzip der Kristallisation von Proteinen. Das Prinzip der Kristallisation von Proteinen. In einer Dampfdiffusion Experiment (A) gleiche Volumina von Fällungsmittel und Protein sind in der Drop. Das Wasser wird heraus diffundieren und sowohl die Fällungs-und Protein-Konzentration verdoppelt, bis das Gleichgewicht zwischen dem Tropfen und dem Reservoir-Lösung erreicht wird. Im Batch-Kristallisation (B) das Fällungsmittel und Protein-Konzentration nicht während des Experiments zu ändern. Punkt A - Protein bleibt untersättigt keine Kristalle gebildet werden können, Point B - Protein Keimbildung auftreten, begannen die ersten Kristalle bilden und die Konzentration des Proteins in Lösung Tropfen bis zur Sättigung. Punkt C - Protein ausfällt, aber Kristalle können noch wachsen. (C) Dialyse Kristallisation mit einem Gel-plugged Kapillare. Kristalle erscheinen als Salz diffundiert aus der Proteinprobe (und / oder Fällungsmittel diffundiert in die Proteinprobe) über das Gel-Stecker. <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Outline of typisches Protein Kristallisation Experimente. (A) Verfahren für die hängenden Tropfen Dampfdiffusion, Sitting Drop Dampfdiffusion und Microbatch Proteinkristallisation. In jedem Fall wird ein kleines Volumen konzentriert Proteinprobe mit einer gleichen oder kleineren Volumen von precipitan gemischtt-Lösung und erlaubt Gleichgewicht zu bringen. (B) Für die Kristallisation von Huhn Lysozym, ein 24-Loch-Tray ist mit verschiedenen Konzentrationen von Natriumchlorid (Fällungsmittel) und mit 0,1 M Natriumacetat als Puffer bei verschiedenen pH-Werten (- 4,9 4,0) eingestellt. <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Typische Ergebnisse einer Proteinkristallisation Experiment. (A) amorphe Niederschläge. Wenn Protein oder Fällungsmittel (oder beides) in hoher Konzentration. (B) Phasentrennung. Protein-oder Reinigungsmittel können zu einer anderen Phase zu trennen, wenn sie mit bestimmten Fällungsmittel in hoher Konzentration gemischt. (C) stabförmige Proteinkristallen von AtCSN7 in Polyethylenglykol 8000 und Magnesium-Acetat (Dessau et al., 2006) erhalten. (D) Lysozymkristalle in 1,0 M NaCl und Natriumacetat pH 4,9 erhalten. (E) Unter gesättigten Tropfen bleiben in der Regel klar. Fotografien von Moshe Dessau.

<ol>
	<li>Bergfors, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual. , (1999).</li><li>Carter, C. W., Carter, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization+using+incomplete+factorial+experiments.">Protein crystallization using incomplete factorial experiments.</a> J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).</li><li>Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+optimization+strategies+for+macromolecular+crystal+growth.">Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).</li><li>Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification+and+crystallization+of+a+PCI+domain+from+the+COP9+signalosome+subunit+7+(CSN7).">Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7).</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).</li><li>Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Macromolecule+Crystallization+Database,+Version+3.0:+new+features,+data+and+the+NASA+archive+for+protein+crystal+growth+data.">Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).</li><li>Jancarik, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+matrix+sampling:+a+screening+method+for+crystallization+of+proteins.">Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins.</a> J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).</li><li>Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+study+of+the+ligand-binding+domain+of+the+bacterial+chemotaxis-mediating+aspartate+receptor+of+Salmonella+typhimurium.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium.</a> J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).</li><li>Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+mining+crystallization+databases:+knowledge-based+approaches+to+optimize+protein+crystal+screens.">Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens.</a> Proteins. 51, 562-568 (2003).</li><li>Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+growth+of+proteins,+nucleic+acids,+and+viruses+in+gels.">Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels.</a> Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Crystallization of biological macromolecules. , (1999).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34, 254-265 (2004).</li><li>Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+crystallization+strategy+for+structural+genomics:+an+optimized+two-tiered+crystallization+screen+against+the+Thermotoga+maritima+proteome.">Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).</li></ol>

In diesem Artikel beschreiben wir und zeigen allgemein gängigen Protokolle für die Proteinkristallisation. Da es ein mehrstufiges Verfahren gibt es einige Überlegungen muss man sich bewusst sein. Bei der Arbeit mit sehr kleinen Volumina (0.5-2 mL), Trocknung des Tropfens durch Verdunstung ist ein wichtiges Anliegen. Daher empfiehlt es sich, in einer gut kontrollierten Umgebung arbeiten (mit geringen Luftstrom, hohe Luftfeuchtigkeit und genaue Temperatursteuerung) und eine Technik, die Exposition des Tropfens auf die ...

<table border="1">
		<tbody>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Lysozyme</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>L6876-1G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well VDX Plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-142</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well Cryschem Plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-158</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dow Corning Vacuum Grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-510</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Siliconized glass circle coverslides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-231</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>100% paraffin oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-411</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-511</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-098</td>
<td>&nbsp;</td>	</tr>	</tbody>
		</table>

protein crystallization for x-ray crystallography

Mit der dreidimensionalen Struktur von biologischen Makromolekülen zu folgern, wie sie funktionieren ist eine der wichtigsten Felder der modernen Biologie. Die Verfügbarkeit von atomarer Auflösung Strukturen bietet einen tiefen und einzigartigen Verständnis der Funktion von Proteinen und hilft, das Innenleben der lebenden Zelle zu entschlüsseln. Bis heute sind 86% der Protein Data Bank (RCSB-PDB) Einträge makromolekularen Strukturen, die mit Hilfe der Röntgenkristallographie waren. Um geeignete Kristalle für kristallographische Untersuchungen, das Makromolekül (zB Protein, Nukleinsäure-, Protein-Protein-Komplex oder Protein-Nukleinsäure-Komplex) muss bis zur Homogenität gereinigt werden, oder so nah wie möglich an Homogenität. Die Homogenität der Zubereitung ist ein wesentlicher Faktor bei der Beschaffung von Kristallen, die eine hohe Auflösung beugen (Bergfors, 1999; McPherson, 1999). Die Kristallisation erfordert bringen das Makromolekül zu Übersättigung. Die Probe sollte daher auf eine möglichst hohe Konzentration, ohne dass die Aggregation oder Fällung des Makromoleküls (in der Regel 2-50 mg / mL) konzentriert werden. Die Einführung der Probe zu Fällungsmittel kann die Keimbildung von Protein-Kristalle in der Lösung, die in großen dreidimensionalen Kristallen wachsen aus der Lösung führen kann fördern. Es gibt zwei Techniken, um Kristalle zu erhalten: Dampfdiffusion und Batch-Kristallisation. In Dampfdiffusion, ein Tropfen mit einer Mischung von Fällungsmittel und Protein-Lösungen ist in einer Kammer mit reinem Fällungsmittel versiegelt. Wasserdampf diffundiert dann aus der Drop bis die Osmolarität des Tropfens und das Fällungsmittel gleich (Abbildung 1A). Die Dehydratisierung des Tropfens bewirkt eine langsame Konzentration von sowohl Protein und Fällungsmittel, bis das Gleichgewicht erreicht ist, idealerweise in der Kristallkeimbildung Zone des Phasendiagramms. Die Batch-Verfahren beruht auf der bringt das Protein direkt in das Keimbildungszone durch Mischen Protein mit der entsprechenden Menge an Fällungsmittel (Abbildung 1B). Diese Methode ist in der Regel unter einem Paraffin / Mineralöl Mischung auf die Diffusion von Wasser aus dem Tropfen zu verhindern durchgeführt. Hier zeigen wir Ihnen zwei Arten von experimentellen Aufbaus für die Dampfdiffusion, hängenden Tropfen und Sitzen fallen, zusätzlich zu Batch-Kristallisation unter Öl.

Crystallization is usually referred to as the bottleneck of X-ray crystallography. A sparse matrix incomplete factorial screen of precipitating conditions typically produces many different types of protein aggregation and precipitation, among them large single crystals. If the protein or precipitant concentrations are too high one can see brown matter with no distinct shape and size (amorphous precipitation). When the solution is undersaturated, the drop will often be completely clear and devoid of any kind of precipitat...

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Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Die 3-D-Struktur eines Moleküls liefert ein einzigartiges Verständnis dafür, wie das Molekül Funktionen. Die wichtigste Methode zur Strukturaufklärung in nahezu atomarer Auflösung ist Röntgenstrukturanalyse. Hier zeigen wir die aktuellen Methoden zur Gewinnung von dreidimensionalen Kristallen von jedem Makromolekül, die sich für die Strukturbestimmung mittels Röntgen-Kristallographie.

Proteinkristallisation für X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

protein-crystallization-for-x-ray-crystallography

Research

JoVE Journal

Biology

63.0K Aufrufe.  Yale University. Die 3-D-Struktur eines Moleküls liefert ein einzigartiges Verständnis dafür, wie das Molekül Funktionen. Die wichtigste Methode zur Strukturaufklärung in nahezu atomarer Auflösung ist Röntgenstrukturanalyse. Hier zeigen wir die aktuellen Methoden zur Gewinnung von dreidimensionalen Kristallen von jedem Makromolekül, die sich für die Strukturbestimmung mittels Röntgen-Kristallographie.

Serie: Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard cuticle which makes it difficult to use protocols of classical histology. In addition, histological sectioning destroys the sample and can therefore not be used for unique material. Hence, a non-destructive method is desirable which allows to view inside small samples without the need of sectioning.
We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble (France) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows us to reconstruct the internal organization in its natural state without the artefacts produced by histological sectioning. These date can be used for quantitative morphology, landmarks, or for the visualization of animated movies to understand the structure of hidden body parts and to follow complete organ systems or tissues through the samples.

We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows the reconstruction of internal structures in their natural state without the artefacts produced by histological sectioning.

Nicht-invasive 3D-Visualisierung mit Sub-Mikron-Auflösung mit Synchrotron-Röntgen-Tomographie

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Forschung

Biologie

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

Die Beurteilung Zweidimensionale Kristallisation Trials of Small Membranproteinen für Strukturbiologie Studien Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Die Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

3D Printing of Preclinical X-ray Computed Tomographic Data Sets

Three-dimensional printing allows for the production of highly detailed objects through a process known as additive manufacturing. Traditional, mold-injection methods to create models or parts have several limitations, the most important of which is a difficulty in making highly complex products in a timely, cost-effective manner.1 However, gradual improvements in three-dimensional printing technology have resulted in both high-end and economy instruments that are now available for the facile production of customized models.2 These printers have the ability to extrude high-resolution objects with enough detail to accurately represent in vivo images generated from a preclinical X-ray CT scanner. With proper data collection, surface rendering, and stereolithographic editing, it is now possible and inexpensive to rapidly produce detailed skeletal and soft tissue structures from X-ray CT data. Even in the early stages of development, the anatomical models produced by three-dimensional printing appeal to both educators and researchers who can utilize the technology to improve visualization proficiency. 3, 4 The real benefits of this method result from the tangible experience a researcher can have with data that cannot be adequately conveyed through a computer screen. The translation of pre-clinical 3D data to a physical object that is an exact copy of the test subject is a powerful tool for visualization and communication, especially for relating imaging research to students, or those in other fields. Here, we provide a detailed method for printing plastic models of bone and organ structures derived from X-ray CT scans utilizing an Albira X-ray CT system in conjunction with PMOD, ImageJ, Meshlab, Netfabb, and ReplicatorG software packages.

Using modern plastic extrusion and printing technologies, it is now possible to quickly and inexpensively produce physical models of X-ray CT data taken in a laboratory. The three -dimensional printing of tomographic data is a powerful visualization, research, and educational tool that may now be accessed by the preclinical imaging community.

3D Printing der präklinischen X-ray computertomographische Datensätze

Three-dimensional printing allows for the production of highly detailed objects through a process known as additive manufacturing.  Traditional, ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

Verbesserung der Erfolgsrate der Proteinkristallisation nach Zufall Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

Effiziente Mammalian Cell Expression und Single-step Reinigung der extrazellulären Glykoproteinen für die Kristallisation

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...