Die Transformation von Bakterien ist eine häufig angewandte Methode, mit welcher man Fremd-DNA in ein Bakterium einfügen kann. Das Bakterium vervielfältigt dann (oder produziert Klone) dieser DNA. Zellen, die diese DNA aufnehmen können, nennt man auch kompetente Zellen. Transformationen passieren auch von Natur her in vielen Bakterien. Wissenschaftler haben allerdings Wege und Mittel gefunden die Kompetenz von bakteriellen Zellen zu erzeugen und zu verbessern. In diesem Video sprechen wir über eine dieser Methoden, nämlich die Hitzeschock-Transformation.
Bevor wir über die Hitzeschock-Methode sprechen, behandeln wir zuerst die Art von DNA, die meistens für bakterielle Transformationen verwendet wird: das Plasmid. Ein Plasmid ist ein kleines, ringförmiges, doppelsträngiges DNA Molekül, das seine Größe durch das sogenannte supercoiling reduzieren kann, so dass es einfach durch die Poren in der Zellmembran durchpasst.
Ein Plasmid enthält ein paar erwähnenswerte Regionen. Käuflich erhältliche Plasmide haben eine multiple Klonierungsstelle (auch MCS genannt). In dieser Region sind spezifische Erkennungssequenzen, die von Restriktionsendonukleasen, oder Restriktionsenzymen, erkannt und geschnitten werden. DNA Stücke können dann, nachdem das Plasmid und das DNA Fragment mit den Endonukleasen geschnitten worden sind, in die multiple Klonierungsstelle eingefügt werden.
Plasmide enthalten auch einen Replikationsursprung (auch ORI genannt), der festlegt, wo die Replikation des Plasmids beginnen soll.
Zusätzlich zu dem Replikationsursprung und der multiplen Klonierungsstelle enthalten die meisten Plasmide ein Antibiotikum-Resistenzgen. Dieses Gen erzeugt Resistenz gegen ein Antibiotikum in den Bakterien, die das Plasmid enthalten und dadurch in den Antibiotikom enthaltenden Medien überleben.
Nun das wir Plasmide behandelt haben, sprechen wir über die Zellen, in welche die Plasmide eingefügt werden: also über kompetente Bakterien. Die am häufigsten verwendeten Bakterien für Transformationen in der molekularbiologischen Forschung sind E. coli, die auch in eurem Darm wohnhaft sind. Die Kompetenz kann normalerweise durch eine kalziumreiche Umgebung ausgelöst werden.
Die positive Ladung der Kalzium-Ionen neutralisiert die negative Ladung des Plasmids und der bakteriellen Zellwand und zerstört damit die elektrostatische Abstoßung und führt zu einer Schwächung der Zellwand.
Wenn die Bakterien nun plötzlich höheren Temperaturen, oder einem Hitzeschock, ausgesetzt sind, entsteht ein Druckunterschied zwischen der äußeren und inneren Seite der Zellwand. Dadurch entstehen Poren, durch welche das Plasmid in Supercoil-Form in die Zelle eindringen kann. Nachdem die Zellen wieder auf normalere Temperaturen abgekühlt sind, kann die Zellwand sich wieder selbst reparieren.
Nachdem die Zellen das Plasmid aufgenommen haben, können sie auf Agarplatten, die mit dem entsprechenden Antibiotikum bedeckt sind, wachsen.
Bevor man mit der Hitzeschock- Transformation beginnt, müssen die Arbeitsfläche gesäubert und alle verwendeten Materialien sterilisiert werden.
Man sollte sicherstellen, dass man genug Agar und Medium vorbereitet hat, da diese die Nahrung der Zellen darstellen, die man kompetent machen möchte. Außerdem sollte man alle Lösungen durch Autoklavieren sterilisieren. Das flüssige Medium muss vor der Benutzung
auf Zimmertemperatur abgekühlt sein. Auch der Agar sollte auf 50-55˚C abgekühlt werden, so dass man das Antibiotikum hinzufügen kann bevor die Agarplatten hergestellt werden. Die Platten müssen dann auf Zimmertemperatur abgekühlt werden, damit sie fest werden.
Bei Bakterien sollte man immer aseptisch arbeiten, um Sterilität zu gewährleisten. Aseptisches Arbeiten beinhaltet die Verwendung eines Bunsenbrenners, um die Instrumente und Reagenzien zu sterilisieren. Durch den Bunsenbrenner entsteht ein Konvektionsstrom, der Schwebstoffe von der Arbeitsfläche fern hält.
Direkt vor dem Hitzeschock erwärmt man das Medium auf Zimmertemperatur und die Agarplatten mit Antibiotikum auf 37°C. Ein 42°C warmes Wasserbad sollte außerdem bereit stehen.
Nun taut man die chemisch kompetenten Bakterien auf Eis auf.
Dann gibt man 1-5μl von einem Plasmid mit einer Konzentration von 1 ng/μl zu den bakteriellen Zellen hinzu, mischt sie leicht, und inkubiert das Gemisch für 30 Minuten auf Eis.
Danach werden die Zellen für 30s in einem 42˚C warmen Wasserbad hitzegeschockt.
Nachdem man das Reaktionsgefäß aus dem Wasserbad genommen hat, stellt man es sofort auf Eis zurück und gibt 450 μl Medium hinzu. Danach stellt man es bei 37°C für 1 Stunde auf einen Schüttler, bei einer Geschwindigkeit von über 225 rpm, damit sich die Zellen erholen können.
Mit aspetischer Vorgehensweise gibt man nun 20-200 μl der Bakterien auf eine LB Agarplatte und verteilt diese mit einem Schaber. Die Platten werden dann über Nacht bei 37˚C umgedreht inkubiert, damit die Bakterien nicht der Kondensation ausgesetzt sind.
Am nächsten Tag haben die Bakterien, die das Plasmid aufgenommen haben, Kolonien erzeugt.
Nun zählt man die Kolonien, um die Transformationseffizienz zu berechnen. Dafür teilt man die Zahl der erfolgreich transformierten Zellen durch die Zahl aller Bakterien, die man aufgetragen hat.
Nun können die Kolonien für andere Experimente ausgesucht werden.
Bevor die Bakterien kompetent gemacht worden sind, wurden sie in einem Gefrierschrank gelagert. Sie werden auf Eis aufgetaut, auf eine Agarplatte ohne Antibiotikum aufgetragen, und über Nacht bei 37˚C gewachsen.
Mit aseptischer Vorgehensweise sucht man eine bakterielle Kolonie aus und setzt diese über Nacht in einer 500 ml Kultur bei 37˚C in einem schüttelnden Inkubator an, also einem Instrument das verhindert, das sich die Bakterien absetzen und das gleichzeitig sicherstellt, dass das Nährmedium gleichmäßig verteilt ist.
Während die Zellen sich über Nacht vervielfältigen, stellt man eine 0.1 M Kalziumchloridlösung und eine 0.1 M Kalziumchloridlösung mit 15% Glycerin her, autoklaviert sie, und last sie abkühlen.
Messungen der Absorbanz werden benutzt um zu bestimmen wann die Bakterien in der logarithmischen Phase der Wachstumskurve sind, in welcher sie einfach DNA aufnehmen können. Wenn die Zellen in dieser Phase sind, werden sie für den restlichen Teil dieser Methode auf Eis gestellt.
Danach werden die bakteriellen Zellen in zwei große Zentrifugenröhren gefüllt und bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert und das Pellet wird in 100ml einer kalten 0.1M Kalziumchloridlösung resuspendiert. Nun werden die Zellen für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Dieser Schritt wird wiederholt. Diese Abfolge von Zentrifugieren und Resuspendieren wird oft als Waschen der Zellen bezeichnet.
Nach dem letzten Waschschritt werden die Zellen in 50 ml kalter 0.1M Kalziumchlordlösung plus 15% Glycerin respuspendiert. Die Zellen sind nun chemisch kompetent.
Nun verteilt man 50 μl der Bakterien in verschiedene Eppendorf-Gefäße und lagert diese bei -80˚C bis zum Hitzeschock.
Es gibt viele Anwendungen und Varianten der bakteriellen Transformation.
Neben dem Hitzeschock kann auch die Elektroporation für die Transformation verwendet werden. Wie der Name schon sagt, wird bei dieser Technik Elektrizität genutzt, um Poren in die bakterielle Zellwand einzufügen, durch welche die DNA dann passieren kann.
Bei der Selektion der transformierten Bakterien ist zu beachten, das Plasmide oft auch ein Gen das beta-Galactosidase heißt, enthalten. Dieses Gen hilft bei der Selektion wenn das Substrat dieses Enzyms im Agar enthalten ist. Bakterien, die mit Plasmiden transformiert worden sind, welche das Gen enthalten, sind weiß, wohingegen die, welche es nicht enthalten blau sind. Diese Methode wird als Blau-Weiß-Selektion bezeichnet.
Das Ziel der meisten Transformationsexperimente ist es sich schnell teilende Bakterien zu erhalten, die große Mengen des Plasmids mit dem Zielgen herstellen. Nach der bakeriellen Transformation stellt man große Mengen der Bakterien in antibiotikum-haltigen Medium her und isoliert die Plasmide mit Hilfe einer Plasmidpräparation von den Bakterien. Es gibt viele käuflich erhältliche Kits dafür.
Manchmal ist es das Ziel der Transformation große Mengen an Proteinen herzustellen, die von dem Plasmid kodert werden. Hier sieht man wie Bakterien homogenisiert und lysiert werden, bevor Zielproteine durch ein Verfahren das man Affinitätsaufreinigung nennt, isoliert werden. Die purifizierten Proteine können dann kristallisiert werden, um ihre Struktur zu bestimmen.
Das war die Einführung in die Hitzeschock-Transformation von JoVE. In diesem Video haben wir behandelt was die Hitzeschock Transformation ist und wie sie funktioniert. Wir haben auch die grundlegenden Prinzipien besprochen wie man Bakterien erfolgreich transformiert. Vielen Dank für eure Aufmerksamkeit.
