Die Autoren bedanken sich bei Dr. Kathleen Mathers, Dr. Jean-Philippe Mocho und Dr. Yolanda Saavedra Torres für ihre Hilfe danken, die in utero Elektroporation unter aseptischen Verfahren ausführen können, und Hayley Wood für ihre Hilfe, um die Zeichnungen vorbereiten. EP wurde durch eine langfristige Federation of European Biochemical Societies (FEBS) und einem Stipendium Medical Research Council (MRC) berufliche Entwicklung der Gemeinschaft, MAH durch eine Wellcome Trust Zuschuss an Elizabeth Fisher und Victor Tybulewicz (080174/B/06/Z) unterstützt , HW durch ein EMBO-Langzeit-Stipendiums und RA durch ein Stipendium MRC. Diese Arbeit wurde von einem Projekt Beihilfe des Wellcome Trust (086947/Z/08/Z) und durch ein Grant-in-Aid aus dem Medical Research Council (U117570528) bis FG unterstützt

Im Vereinigten Königreich werden die Mäuse untergebracht, gezüchtet und behandelt nach den Richtlinien vom Innenministerium unter dem Tier (Scientific Procedures) Act 1986 genehmigt. 1. Zubereitung: DNA-Lösung und Nadeln <ol><li> Entschlacken Plasmid-DNA mit einem Endotoxin frei Maxi-Prep-Kit. Planen Plasmid-DNA-Lösung zur Injektion gewünschten Konzentrationen in Wasser gelöst und mit Fast Green (Endkonzentration von 0,05%), um Injektionen zu visualisieren. Die Effizienz der Elektroporation ist stark abhängig von der DNA-Konzentration. Eine Konzentration von 1 ug / ul wird im Allgemeinen verwendet. Diese Konzentration reicht aus, um elektroporierte Neuronen ohne Auswirkungen auf ihre Entwicklung zu visualisieren. Jedoch, gemäß der Promotor im Plasmid-Vektor (niedrige Expression mit Cytomegalovirus-Promotor / Enhancer, starke Expression mit dem Cytomegalovirus immediate early enhancer und Huhn β-Actin-Promotor-Fusion (CAG)-Promotor) sowie der Größe und der verwendeten<html> Stabilität des Proteins exprimiert, kann diese Konzentration eingestellt (0,25 ug / ul bis 5 ug / ul) werden. </li><li> Ziehen Sie mit einem Glas Nadeln Feinpipettenziehvorrichtung. </li></ol> 2. Vorbereitung der Chirurgie <ol><li> Autoklav chirurgische Instrumente und Phosphat-gepufferter Saline (PBS). </li><li> Bereiten analgetische Lösung in PBS (Buprenorphin, Vetergesic, Endkonzentration von 30 ug / ml). Wiegen Sie die schwangere Maus subkutan injizieren und 0,1 mg / kg von Vetergesic mindestens 30 Minuten vor der Operation. Während dieser Zeit bereiten den OP-Bereich. Schalten Sie die Heiz-Pads und der Erholung Kammer. Platzieren Sie sterilem PBS in warmen Wasserbad und alle sterilen Instrumente und Materialien auf sterilen Tüchern. Legen Sie die Platin-Elektroden in eine PBS gefüllten Becher und eine Verbindung zum Elektroporator. Füllen Sie die Nadel mit der DNA-Lösung mit einem Microloader Spitze, verbinden Sie die Nadel auf die Kapillarhalter und kneifen Sie die Spitze der Nadel mit einer Pinzette. </li></ol>e_title &quot;&gt; 3. Operation vor DNA-Injektion und Elektroporation <ol><li> Betäuben eine schwangere Maus (E14.5-E15.5) mit Isofluran in Sauerstoff-Träger (Sauerstoff 2 l / min) unter Verwendung einer Narkoseeinleitung Kammer. Warten Sie, bis das Tier verliert Stellreflexes. </li><li> Übertragen Sie das Tier zu einer &quot;pre-Chirurgie&quot; Maske. Geben Sie einen Tropfen Augengel auf jedem Auge zu Hornhautulzeration der Augen zu verhindern, während die Mutter ist unter Vollnarkose. Verwenden Sie einen elektrischen Rasierer, um die Haare des Bauches zu rasieren. Reinigen Sie den rasierten Bereich einmal mit Chlorhexidin, um fliegende Haare zu sammeln. </li><li> Übertragen Sie das Tier auf eine zweite Maske im OP-Bereich. Platzieren Sie die Maus mit dem Rücken auf dem Heizkissen. Starten Sie die Operation, wenn das Pedal Reflex verloren gegangen ist. </li><li> Setzen Sie auf Maske und sterile Handschuhe. Decken Sie das Tier mit einem sterilen Tuch (mit einem kleinen Loch in den Bauch) zu den Geweben und Instrumenten aus, die von den Hautpartien, die noch nicht rasiert und desinfiziert verschmutzt wird. Reinigen Sie den rasierten Bereich eint mindestens 3 mal mit Chlorhexidin. Verwenden Sie eine andere sterile Wattestäbchen jeder Zeit. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen vertikalen Schnitt entlang der Mittellinie (~ 1 cm lang) durch die Haut zu machen. Mit Schere, einen ähnlichen Einschnitt des Muskels des Bauches entlang der Linea alba (weiße Linie hauptsächlich aus Kollagen Bindegewebe). </li><li> Wählen Sie die am besten zugängliche Embryonen und legen Sie den Ring Zange zwischen zwei Embryonen und embryonalen ziehen Sie vorsichtig die Kette aus der Bauchhöhle. Von diesem Punkt an, halten die Embryonen hydratisiert mit steriler vorgewärmten PBS. </li></ol> Kein Mikroskop zur Visualisierung erforderlich. 4. Die Injektion von DNA und Elektroporation <ol><li> Beginnen Sie mit einer der seitlichen Embryonen, wodurch es leichter zu verfolgen, welche Embryonen wurden elektroporiert zu halten. Sie nicht zu viel Zug auf der Embryonen, da dies das Risiko von Blutungen erhöhen. Manipulieren Sie die Position des Embryos innerhalb der Fruchtblase mit der Ring-Zange undStabilisierung der Kopf der Embryonen zwischen den Ringen. Leicht zusammendrücken, bis der Embryo nach oben treiben näher an der Gebärmutterwand. </li><li> Mit der anderen Hand, nehmen Sie die Kapillarhalter und führen Sie die Nadel vorsichtig in der Mitte der Halbkugel, um die lateralen Ventrikel zielen. Drücken Sie das Pedal auf etwa 1 ul DNA-Lösung mit Fast Green (weniger als 1 ul zu studieren Dendriten) gemischt injizieren. Sie sollten beobachten den grünen Farbstoff Befüllen der lateralen Ventrikel. Kritische Schritte: - Die Schärfe der Nadel ist kritisch zu durchdringen richtig die Gebärmutterwand. Es ist wichtig, um die Bewegung der Nadel an der Oberfläche der Gebärmutterwand und nach dem Einsetzen in die Ventrikel zu minimieren, da eine Vergrößerung der Bohrung in das Austreten von Fruchtwasser und Embryo zum Tod führen. Vermeiden Sie Piercing Blutgefäße in der Gebärmutterwand, da dies zu Blutungen und Embryo zum Tod führen. - Es ist wichtig, dass eine zu große Menge der DNA in den lateralen Ventrikel injiziert wird, weil es zu induzierenHydrocephalus (nicht mehr als 2 mu l bei E14.5). Das Volumen der DNA gemäß dem Zweck des Experiments eingestellt. Wenn 1μl wird im Allgemeinen für die meisten Experimente verwendet wird, wird ein kleineres Volumen von DNA (etwa 0,5 pl) für Dendriten und der Wirbelsäule Analyse. In der Tat ein paar isolierte Zellen benötigen, um gezielt, um zu visualisieren und messen Sie die dendritischen Dorn elektroporierte Neuronen werden. </li><li> Die Elektroden an den Seiten des Embryos Kopf mit dem positiven (+) Paddel auf der gleichen Seite wie die Ventrikel injiziert Cortex Elektroporation oder auf der gegenüberliegenden Seite des eingespritzten Ventrikel Hippocampus Elektroporation (2). Dann bewerben Sie sich fünf 30V elektrischen Impulsen (50 ms Dauer) bei 1 Sek. Intervallen. Kritischer Schritt: Vermeiden Sie die Anwendung über die Plazenta aktuell wie dies im Keim zum Tod führen wird. All die Embryonen in einer schwangeren Maus kann elektroporiert, werden in der Regel mit dem gleichen DNA-Konstrukts, um Verwechslungen zu vermeiden. Jedoch eine lange Operation Abnahme<html> on die Überlebensrate der Embryonen. Die Bauchhöhle sollte nicht länger als 30 min geöffnet werden. </li></ol> 5. Chirurgie nach der Elektroporation <ol><li> Nach Elektroporation der Embryonen, fügen PBS in die Bauchhöhle und verwenden Sie die Ring-Zange, um die Uterushorn in seinem ursprünglichen Standort zu ersetzen. Nähen Sie die Bauchdecke und die Haut mit Vicryl resorbierbare Fäden. </li><li> Platzieren Sie das Tier in einer Erholung Kammer, bis er aufwacht (meist 5-10 min) und dann übertragen in einem Käfig auf einem Heizkissen platziert. </li></ol> 6. Post-Chirurgie Überprüfen Sie das Verhalten der Mäuse zu Schmerzen, Leiden oder Ängste einzuschätzen und wiegen die Tiere 24 h und 48 h nach der Operation. Bei Bedarf können Schmerzmittel verabreicht, um Schmerzen und Beschwerden zu minimieren. 7. Gewebeeinbettsystem Sammeln Sie die elektroporierte Embryonen oder Jungtieren bei den embryonalen oder postnatalen Stadien für das Experiment erforderlich. ove_content &quot;&gt; - Für die Analyse der embryonalen Stufen (z. B. die Zellproliferation und Migration zu untersuchen): Einschläfern Mutter über Genickbruch und sammeln die Embryonen. Nach Enthauptung, wählen Sie die Gehirne, die korrekt elektroporiert, wie von der Menge und Ort der Fluoreszenz-Signal angezeigt, visualisiert über den Schädel mit einem fluoreszierenden Fernglas. Sezieren das Gehirn aus dem Schädel und fixieren über Nacht in 4% PFA und dann in 20% Saccharose / PBS über Nacht. Einbetten in OCT-Verbindung, Einfrieren bei -80 ° C und Abschnitt mit Hilfe eines Kryostaten. - Zur Analyse an postnatalen Stadien (zum Beispiel an Dendriten und Dornen-Studie): Anesthetize Welpen oder erwachsenen Mäusen mit einer intraperitonealen Injektion von Pentobarbital (40-60 mg / kg) und führen transcardial Perfusion mit PBS, gefolgt von 4% PFA in PBS. Sezieren die Gehirne aus dem Schädel und Post-fix in 4% PFA über Nacht. Nach Waschen in PBS, Abschnitt das Gehirn mit Hilfe eines Vibratom (100 um Abschnitte für dendrite Analyse). Montieren Sie die Abschnitte in Aqua Poly / Mount mit 0,16 bis 0,19 mm dicken Deckgläsern zu Bild Dendriten und Dornen. 8. Repräsentative Ergebnisse 3 zeigt Beispiele für elektroporierten Zellen in der Großhirnrinde (3A, B), in der CA1 (3C, D) und im Gyrus dentatus des Hippocampus (3E, F). Wildtyp-Mäuse wurden im E14.5 mit einem GFP-Konstrukt (PCA-b-EGFPm5 Schalldämpfer 3) und Gehirne wurden am postnatalen Tag (P) 14 geerntet elektroporiert. Durch Einspritzen einer kleinen Menge der DNA-Lösung (0,5 ul oder weniger einer Lösung bei 1 ug / ul), sind ein paar Zellen markiert, die ermöglicht die Visualisierung der dendritischen Verzweigungen von isolierten GFP +-Zellen (Abbildung 3) sowie deren Stacheln bei stärkerer Vergrößerung (Abbildung 4). <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig1.jpg" /> &lt;strong&gt; Abbildung 1. Schematische Darstellung der Elektroporation Protokolle, die verwendet werden, um Dendriten und Dornen studieren können. (A) Elektroporation von einem GFP-Konstrukt, um Dendriten und Dornen in Wildtyp-und mutierten Mäusen zu vergleichen. (B) Elektroporation von GFP-shRNA (GFP aus dem gleichen Konstrukt exprimiert) Zum Dendriten und Dornen in Mäusen mit einem shRNA elektroporiert konstruieren, die spezifisch für ein Gen von Interesse (X) oder einer Steuerung shRNA. (C) IUE kann zusammen mit einem Cre-induzierbare System verwendet werden, um die Expression der shRNA auf die gewünschte Zeitdauer zu beschränken. In diesem Experiment Expression eines Vektors eine Form der Cre-Rekombinase, die von 4-Hydroxytamoxifen aktiviert werden kann (CAG-ER T2 Creer T2; 1 ug / ul) 10, zusammen mit einem Vektor, der ein shRNA in einer Cre abhängigen elektroporiert Weise (1 ug / ul, und mit einer Rekombination Indikator (CALNL-GFP-Konstrukt, GFP-Expression induzierbar durch Cre;. 1 ug / ul) 10 Die Effizienzcy des Zuschlags kann durch Erhöhen der Konzentration des shRNA sowie eine Erhöhung CAG-ER T2 Creer T2 Konzentration verbessert werden. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig2.jpg" /> Abbildung 2. Räumliche Steuerung der Elektroporation. Diese Abbildung zeigt, wo die Paddle-Elektroden nach der DNA an der Injektionsstelle, um die Gehirnrinde oder den Hippocampus Zielposition. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig3.jpg" /> Abbildung 3. Visualisierung der dendritischen Dorn in utero Elektroporation Zellen in der Hirnrinde und im Hippocampus. (A, B) Im koronaren Schnitte zeigen GFP + Pyramidenzellen in der Hirnrinde, (CD) in CA1 Pyramidenzellen des Hippocampus und (E, F), Körnerzellen im Gyrus dentatus auf P14. Ein GFP-Konstrukt (PCA-b-EGFPm5 Schalldämpfer 3) wurde bei E14.5 elektroporiert. Höhere Vergrößerung Bilder (B, D, F) zeigen, dass IUE eine effiziente Methode zur Visualisierung von Dendriten ist. Maßstabsbalken repräsentieren 50 um (B, D und F), 150 um (A, C, E). <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig4.jpg" /> Abbildung 4. Visualisierung von dendritischen Dornen in P14 Neuronen, die in utero bei E14.5 mit einem GFP-exprimierenden Konstrukt wurden elektroporiert. (A, B) Hohe Vergrößerung Bilder von Stacheln aus basalen Dendriten von Pyramidenzellen des Hippocampus. Scale-Balken stellen 5 um (A) und 2 um (B).

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Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain.">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Dev. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. L. o. n. g. -. t. e. r. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=selective+gene+expression+in+developing+and+adult+hippocampal+pyramidal+neurons+using+focal+in+utero+electroporation.">selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation.</a> J. Neurosci. 27, 5007-5011 (2007).</li><li>Nakahira, E., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+generation,+migration,+and+differentiation+in+the+mouse+hippocampal+primoridium+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation.">Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> J. Comp. Neurol. 483, 329-340 (2005).</li><li>Ramos, R. L., Bai, J., LoTurco, J. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

IUE ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Genexpression nicht nur im Raum sondern auch in der Zeit zu manipulieren. Wir zeigen hier, dass diese Technik verwendet werden, um sichtbar zu machen und genetisch manipulieren, Dendriten und Dornen in der Hirnrinde und im Hippocampus von Mäusen werden. Neben den Vorteilen zuvor zitierten, ist es erwähnenswert, dass IUE, im Gegensatz zur Methode Golgi, können mit Immunhistochemie oder in situ Hybridisierung, die zum Beispiel auf den Phänotyp elektroporierten Zellen können kombiniert werden. Es ist auch wichtig zu erwähnen, dass dieses Verfahren nicht induziert offensichtlich Hirnfehlbildungen trotz seiner relativen Invasivität. Außerdem auf der zellulären Ebene, hat IUE nicht verändern die elektrophysiologischen Eigenschaften der Neuronen elektroporierte 13. Während unserer Demonstration konzentriert sich auf die Visualisierung von Dendriten und Wirbelsäule Morphologien, könnte IUE der kortikalen Neuronen im Hippocampus oder bei E14.5 auch verwendet, um andere Entwicklungsstörungen Veranstaltungen wie Axon Bildung und Anleitung zu studieren. In hinzufügenition, die gleiche Art von Protokoll könnte in anderen Stadien der embryonalen Entwicklung umgesetzt werden, um verschiedene Bevölkerungsgruppen anzusprechen. Zum Beispiel kann ein Entwicklungs sehr spät kortikalen Elektroporation Paradigma an E18.5 durchgeführt, um die Expression in Astrozyten Vorläuferzellen 1 gebracht werden. In ähnlicher Weise, während eine Elektroporation des Hippocampus bei E14.5 ermöglicht CA1-CA3 Pyramidenneuron Vorläufer und dentatus Körnerzellen Vorläuferzellen zur gleichen Zeit richten, wäre ein Ende des Hippocampus Elektroporation (E18.5 oder frühen postnatalen) erlaubt, verschiedene dentatus Granulat Ziel Vorläuferzellen 14. In diesem Fall kann die eingespritzte Menge von DNA als auch die Stromstärke erhöht werden. Transgene durch IUE eingeführt scheinen episomal bleiben und werden daher von den Zellen nach wiederholten Zellteilungen verloren. In postmitotischen Zellen wie Neuronen, jedoch bleiben die episomale Transgene seit Monaten aktiv nach der Elektroporation ermöglicht Langzeitstudien 13, 15. In unserer Studie haben wir helle GFP +-Zellen beobachtet, die bis zu 7 Wochen nach der Geburt (die neueste Zeit Punkt, den wir analysiert) darauf hinweist, dass embryonale Ausrichtung der kortikalen oder neuronalen Vorläuferzellen des Hippocampus mit IUE zu bleibender Expression des Transgens aus frühen Entwicklungsstadien Zeitpunkten bis bis zum Erwachsenenalter. Eine aktuelle Einschränkung der Technik ist, dass es schwierig ist, eine genaue Kontrolle über die Gesamtzahl der elektroporierten Zellen ausüben. Jedoch, durch Verringern der eingespritzte Menge der DNA-Lösung, haben wir gezeigt, dass es möglich ist, ein paar Zellen zu markieren und die dendritische Verzweigung von GFP +-Zellen isoliert und ihre Wirbelsäule zu visualisieren. Die Dimension der transfizierten Bereich könnte auch durch eine Änderung der Parameter der Elektroporation wie Stromstärke für die Anzahl der Impulse oder der Durchmesser der Elektroporation Schaufeln eingestellt werden. Insgesamt IUE ist eine Methode, die einfach zu implementieren, ist eine schnelle undeffizienter zu Dendriten und Dornen in vivo zu untersuchen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> Vorbereitung von Nadeln und DNA-Lösung zur Injektion </td></tr><tr><td> Endofree Plasmid Maxi Kit </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> Sigma </td><td> F-7258 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikatglas Kapillaren 1,0 mm AD x 0,58 mm ID </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 30-0016 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader Tipps </td><td> Eppendorf </td><td> 5242956003 </td><td> Für Eppendorf-Pipetten 0,5 ul-10 ul / ul 2-20 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td><td> Material für die Chirurgie </td></tr><tr><td> Extra dünne Iris Schere </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Gebogenen Pinzette </td><td> Fine Science Tools </td><td> 91197-00 </td><td></td></tr><tr><td> Ring Zange </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11103-09 </td><td></td></tr><tr><td> Nadelhalter </td><td> Fine Science Tools </td><td> 12002-12 </td><td></td></tr><tr><td> Graefe Pinzette </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> Resorbierbares Nahtmaterial Vicryl </td><td> Ethicon Inc (Johnson &amp; Johnson) </td><td> W9074 </td><td></td></tr><tr><td> Sterilen Tüchern 30cm x 45 cm </td><td> Buster </td><td> 141765 </td><td></td></tr><tr><td> Sterile Tupfer </td><td> Shermond </td><td> Huby-340 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Wattestäbchen </td><td> Saubere Kreuz Co., Ltd </td><td> 1860 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenorphin (Vetergesic) </td><td> Alstoe Tiergesundheit </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chlorhexidin </td><td> Vetasept </td><td> XHG007 </td><td></td></tr><tr><td> Eye Gel Viscotears </td><td> Novartis </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Abbott Laboratories </td><td> B506 </td><td></td></tr><tr><td> Pentoject, Pentobarbital Natrium 20% </td><td> Animalcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> Die Elektroporation </td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BTX </td><td> ECM830 </td><td></td></tr><tr><td> Platinum Tweezertrode 5mm </td><td> BTX, Harvard Apparatus </td><td> 45-0489 </td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet Mikroinjektor </td><td> Eppendorf </td><td> 5247000030 </td><td></td></tr><tr><td> Fußschalter für FemtoJet Mikroinjektor </td><td> Eppendorf </td><td> 5247623002 </td><td></td></tr><tr><td> Kapillarhalter </td><td> Eppendorf </td><td> 5176190002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Gewebeverarbeitung </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> VWR (Prolabo) </td><td> 27480.294 </td><td></td></tr><tr><td> Objektträger </td><td> ThermoScientific (Menzel-Gläser) </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> Menzel-Gläser </td><td></td><td> 22 x 50 mm # 1,5 </td></tr><tr><td> Aqua Poly / Mount </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 18606 </td><td></td></tr></tbody></table>

visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation

In utero Elektroporation (IUE) hat sich eine mächtige Technik, die Entwicklung der verschiedenen Regionen des embryonalen Nervensystems 5.1 zu studieren. Bis heute wurde dieses Tool weit verbreitet, um die Regulation der zellulären Proliferation, Differenzierung und neuronalen Migration insbesondere in den Entwicklungsländern Großhirnrinde 6-8 studieren. Hier haben wir unsere Detail-Protokoll in utero elektroporieren der Großhirnrinde und den Hippocampus und den Nachweis erbringen, dass dieser Ansatz verwendet werden, um Dendriten und Dornen in diesen beiden Hirnregionen zu untersuchen. Visualisierung und Manipulation von Neuronen im primären Kulturen haben zu einem besseren Verständnis der Vorgänge in Dendriten, der Wirbelsäule und Synapse beteiligt Entwicklung beigetragen. Allerdings Neuronen wachsen in vitro sind nicht an allen physiologischen Signale, die Dendriten und / oder Wirbelsäule Bildung und Aufrechterhaltung während der normalen Entwicklung beeinflussen kann ausgesetzt. Unser Wissen über Dendriten und Strukturen der Wirbelsäule <em&gt; in vivo in Wildtyp-oder mutierten Mäusen kommt vor allem aus Beobachtungen mit dem Golgi-Cox-Methode 9. Jedoch ist Golgi-Färbung als unvorhersehbar sein. Tatsächlich sind Gruppen von Nervenzellen und Nervenbahnen nach dem Zufallsprinzip, mit bestimmten Bereichen häufig auftretende vollständig gefärbt, während benachbarte Bereiche frei von Verfärbungen sind beschriftet. Jüngste Studien haben gezeigt, dass IUE von fluoreszierenden Konstrukte eine attraktive Alternative zur Dendriten, Stacheln sowie Synapsen in der Mutante / Wildtyp-Mäusen 10 bis 11 (Abbildung 1A) Studie stellt. Außerdem im Vergleich zur Erzeugung von Maus-Knockouts, stellt IUE eine rasche Annäherung an Gewinn und Verlust der Funktions-Studien in speziellen Population von Zellen führen während eines bestimmten Zeitfensters. Darüber hinaus hat IUE erfolgreich mit induzierbaren Genexpression oder induzierbare RNAi nähert, um die zeitliche Steuerung der Expression eines Gens oder shRNA 12 zu präzisieren. Diese Vorteile von IUE haben damit openenterprd neue Dimensionen zur Untersuchung der Auswirkungen der Genexpression / Unterdrückung auf Dendriten und Dornen nicht nur in bestimmten zerebralen Strukturen (Abbildung 1B), sondern auch zu einem bestimmten Zeitpunkt der Entwicklung (Abbildung 1C). Schließlich bietet IUE ein nützliches Instrument, um funktionelle Wechselwirkungen zwischen Genen in Dendriten, der Wirbelsäule und / oder Synapse Entwicklung beteiligt sind. In der Tat, im Gegensatz zu anderen Gentransferverfahren wie Viren, ist es einfach, mehrere RNAi oder Transgene in der gleichen Population von Zellen zu verbinden. Zusammenfassend ist IUE eine leistungsfähige Methode, die bereits auf der Charakterisierung der molekularen Mechanismen der Hirnfunktion und Krankheit beigetragen hat, und es sollte auch in der Studie von Dendriten und Dornen nützlich.

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Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Dieser Artikel beschreibt im Detail, ein Protokoll zur in utero elektroporieren die Hirnrinde und im Hippocampus bei E14.5 bei Mäusen. Wir zeigen auch, dass dies eine wertvolle Methode, um Dendriten und Dornen in diesen beiden Hirnregionen zu untersuchen ist.

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

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Neuroscience

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

17.8K Aufrufe.  MRC National Institute for Medical Research. Dieser Artikel beschreibt im Detail, ein Protokoll zur in utero elektroporieren die Hirnrinde und im Hippocampus bei E14.5 bei Mäusen. Wir zeigen auch, dass dies eine wertvolle Methode, um Dendriten und Dornen in diesen beiden Hirnregionen zu untersuchen ist.

Serie: Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus-vermittelte Gen-Manipulation und Visualisierung von Riechzellen In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Voltage-sensitive Dye Aufnahme von Axonen, Dendriten und dendritischen Spines einzelner Neuronen in Hirnschnitten

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Gleichzeitige Elektroenzephalographie, Real-time Messung der Laktat-Konzentration und optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität in der Nagetier Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

Genetische Manipulation der Maus entwickeln Hypothalamus durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus, Lateral Septal Nucleus- und Striatum spezifische<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation in der C57BL / 6-Maus,

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

Induktion Cre Lox Rekombination in Maus Großhirnrinde durch Elektroporation In Utero

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex

Golgi impregnation, using the Golgi staining kit with minor adaptations, is used to impregnate dendritic spines in the rat hippocampus and medial prefrontal cortex. This technique is a marked improvement over previous methods of Golgi impregnation because the premixed chemicals are safer to use, neurons are consistently well impregnated, there is far less background debris, and for a given region, there are extremely small deviations in spine density between experiments. Moreover, brains can be accumulated after a certain point and kept frozen until further processing. Using this method any brain region of interest can be studied. Once stained and cover slipped, dendritic spine density is determined by counting the number of spines for a length of dendrite and expressed as spine density per 10 &#181;m dendrite.

The protocol describes a modification of the rapid Golgi method, which can be adapted to any part of the nervous system, for staining neurons in the hippocampus and medial prefrontal cortex of the rat.