The authors have nothing to disclose.

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH) eingestellt Politik von Ethic Ausschuss der Iran University of Medical Sciences (Teheran, Iran) zugelassen wurde. 1. Tiere, Chirurgie und Probenvorbereitungen HINWEIS: Bereiten Hirngewebe für 3D-konfokale mikroskopische Analyse. <ol><li> Divide Tiere zufällig in zwei Gruppen: 1-40 -Injektion (n = 8) und 1-40 -Injektion mit Genistein Behandlung (n = 8); verabreichen Genistein (10 mg / kg in einem Vehikel verdünnt wie polyethoxyliertes Rizinusöl) per Schlundsonde 1 Stunde vor der Operation. </li><li> Betäuben die Tiere mit Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg). Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch einen Mangel an Ziehreflex nach dem Einklemmen des Zehe. Verwenden Salbe auf die Augen während der Operation bis zur Trockenheit zu verhindern. </li><li> Zeigen Tiere in stereotaktischen Apparat und rasieren Kopf. Bewerben iodine Lösung, um die Kopfhaut vor dem Schnitt säubern und zu halten, das den Betrieb vor Ort sterile während der Operation, um das Infektionsrisiko zu verringern. Injizieren 1-40 stereotaktisch (4 ul) im Hippocampus bei -3,5 mm hinter Bregma, ± 2 mm lateral zur Mittellinie, und -2,8 mm unterhalb dura nach Rattenhirnatlas 8. Für stereotaktischen Verfahren finden Sie in früheren Veröffentlichung 9. </li><li> Geben Sie postoperative Beobachtungs / Pflege, bis die Tiere bei vollem Bewusstsein, um den Komfort der Tiere zu gewährleisten. Halten Sie die Tiere warmen während der Wiederherstellung, und schützen Sie sie vor einem Käfig mit anderen Tieren zurück, bis vollständige Genesung. Achten Sie auf Anzeichen von Infektionen bei den Tieren nach der Operation. </li><li> Betäuben die Tiere tief von Ketamin (150 mg / kg) drei Wochen nach der Operation. Führen transkardialer Fixierung durch Perfusion die Tiere mit 0,9% Kochsalzlösung, gefolgt von 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PBS (pH = 7,4), dann entfernen und zu beheben Gehirn wie in 10 beschrieben &lt;/ sup&gt;. </li><li> Post-fix die Gehirne in 4% Paraformaldehyd für 2-3 Tage bei 4 ° C. </li><li> Betten Sie das Gewebe in Paraffinblöcke durch die Verwendung von Gewebeeinbettungstechnik und vermeiden Unterfüllung oder Überfüllung der Kassette, da es mit der richtigen Ausrichtung oder Schnitte stören. Achten Sie auf die Ausrichtung des Gewebes in der Paraffinblock. HINWEIS: Die Ratte Hippocampus, zum Beispiel, ist in der Nähe von hinteren Teil der Hirnhemisphäre. Somit sollte das Gewebe in einer Art und Weise eingebettet werden, dass Schneiden beginnt am hinteren Teil des Gehirns. Verwenden Sie die Paxinos atlas 8 als Führung, um den gewünschten anatomischen Struktur zu erreichen. </li><li> Legen Sie das Mikrotom von Zugluft oder Türöffnungen, da Luftbewegungen machen die Handhabung der Teile schwierig. </li><li> Verwenden Abschnitte mit einer Dicke ≥20 um, wie diese Tiefe mit notwendig sein, Z-Stapel-Bilder von kompletten Astrozyten produzieren. Verwenden Sie nicht die ersten paar Abschnitte, da sie unerwünschte Dicke haben können, aufgrund der thermischen eXpansion. </li><li> Legen Sie die Teile auf der Oberfläche mit warmem Wasser (5 ± 2 C unterhalb der Schmelztemperatur für Paraffin) gerade lang genug, um die Abschnitte zu glätten. HINWEIS: Überexpansion des Profils kann die Morphologie der Struktur stören. Verwenden Sie kleine Pinsel, um vorsichtig zu übertragen Abschnitten. Sammeln Sie zwei vor drei Abschnitten auf jeder Folie. </li><li> Shop Dias in einem Rack in einer aufrechten Position und lassen Sie sie für mehrere Stunden oder O / N trocken bei 37 ° C. </li></ol> 2. Immunhistochemie <ol><li> Entparaffinieren Abschnitte in Xylol, 2 x 10 min, und rehydratisieren durch Alkohol-Gradienten (99,8%, 95% und 70%, jeweils 10 min) und PBS. </li><li> Inkubieren mit Antikörpern gegen saures Gliafaserprotein (GFAP), verdünnt 1: 1500 in PBS, das 0,25% Rinderserumalbumin (BSA), 0,25% Triton X-100 und 3,5% normales Serum (O / N bei 4 ° C). </li><li> Waschen Schnitte in PBS für 3 x 5 min. </li><li> Inkubieren mit sekundärem alkalische Phosphatase konjugierten antibodies für 1 h (1: 100, 21 C, verdünnt in PBS). </li><li> Für 3 x 5 min Waschen Sie die Schnitte in PBS. HINWEIS: Es ist wichtig, um die Abschnitte richtig waschen, nachdem Sekundärantikörper, um Hintergrundfärbung zu minimieren. </li><li> Abschnitte in Dunkelheit inkubieren mit Liquid Permanent Red Chromogen (15-20 min). Hinweis: Bereiten Sie die Lösung nicht mehr als 30 Minuten vor dem Gebrauch. </li><li> Waschen Schnitte in PBS für 3 x 5 min. </li><li> Schließlich färben die Kerne mit 4-6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; 1: 500, verdünnt in PBS) vor der Deckung Rutsch. Speichern Sie die Folien im Kühlschrank 24-48 h vor der Mikroskopie. </li></ol> 3. konfokale Mikroskopie HINWEIS: Zur quantitativen Auswertung (siehe unten), wählen Sie eine Astrozyten mit einem deutlich sichtbaren DAPI-gefärbten Zellkern mit einem Minimum von überlappenden Ästen, um das Fehlerrisiko zu verringern. Herstellung von Z-Bilder Stapeln ist zeitaufwendig. Seien Sie geduldig und nicht während der Verarbeitung zu stoppen. Upright konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop ist used, um 3D-Bilder von Astrozyten zu erstellen. <ol><li> Setzen Sie den Schieber auf der Mikroskop-Bühne, und wählen Sie das 63X Ziel. </li><li> Öffnen Sie die Imaging-Software und klicken Sie auf Start-System. Klicken Sie auf die Registerkarte Suchen. Zum Ordnen und wählen GFP, um die richtige Licht einzustellen. </li><li> Öffnen Sie den Auslöser, um Licht zu reflektieren. Finden Sie den Reflektor Revolver auf der rechten Seite der Shutter und wählen Sie die Farbe, die von Astrozyten (grün, rot oder violett) widerspiegeln sollte; rote Farbe (FSet20 wf) wurde verwendet. HINWEIS: Vergessen Sie nicht, um das Bild direkt in das Okular des Mikroskops zu konzentrieren. </li><li> Um den besten Fokus zu finden, klicken Sie auf alle geschlossen, legte das Mikroskop Stift im Bildmodus, und klicken Sie auf die Registerkarte Acquisition. </li><li> Klicken Sie auf Smart Setup im Register Acquisition; öffnet sich ein Fenster. Wählen Sie die richtige Fluorophors (dh DAPI und Alexa Fluor 555, im aktuellen Projekt) aus der Liste. Die Farbe wird automatisch ausgewählt. </li><li> Klicken Sie auf das beste Signal und Übernehmen, und klicken Sie auf Set Exposure; der Computer wird dann automatisch die Belichtungsparameter eingestellt. </li><li> Zur Optimierung der Bild, gehen Sie zum Fenster Kanäle. Unmark Track2, markieren Track1 und klicken Sie auf Live. Stellen Sie das Bild, wenn nötig. </li><li> Im Fenster Kanäle passen Sie die folgenden Tasten; klicken Sie 1AU automatisch optimieren die Lochkamera. Es ist sehr wichtig, diesen Schritt sonst die konfokale Bilder werden nicht optimalen tun. Verstärkung anpassen um das beste Intensität (halten Sie diese Einstellung unter 800, um zusätzliche Rauschen zu verringern) zu haben. Schließlich, stellen Sie die digitale Verstärkung zwischen 2 und 3. </li><li> Unmark Track1, klicken Sie auf Track2 und wiederholen Sie Schritt 3.8 für Track2. Dann hör Live. </li><li> Zum Erfassungsmodus-Fenster. Verbessern Sie das Image durch die Optimierung der Bildgröße und Mittelung. Um das zu ändern Frame-Größe auf X * Y und wählen 1.024 x 1.024. Wählen Sie eine langsame Geschwindigkeit, um ein besseres Bild zu erzeugen. </li><li> Zum Mittelwertbildung und wählen Sie eine Anzahl ≥4. Diese Mittelung Wert gibt die Anzahl der Scans, die gemittelt werden, um produc werdene die erfasste Bild. Klicken Sie nun auf den Druckknopf, und speichern Sie die aufgenommenen Bildes 2D. </li><li> Für 3D-Bildgebung, markieren Sie die Z-Stapel Element unter Smart Setup wodurch die Z-Stapel-Fenster zu öffnen. </li><li> Setzen die ersten und letzten Positionen für die Z-Stapel, dh die Tiefe der Zelle ist. Klicken Sie zunächst auf Live. Dann nutzen Sie den Fokustrieb des Mikroskops auf die oberste Position der Astrozyten im Gewebe, wobei die Z-Stapel ist zu Beginn zu konzentrieren. Klicken Sie auf Set Erste. Dann konzentriert bis zur untersten Position der Astrozyten im Gewebe, in dem Z-Stapel Abtastung gestoppt werden soll. Klicken Sie auf Set Last. Dann hör Live. </li><li> Wählen Sie das Intervall; 1,01 &amp; mgr; m in der vorliegenden Studie verwendet wird; Wahl-Intervall kann durch Klicken auf Optimal, um die Anzahl der Schichten eingestellt erfolgen. </li><li> Klicken Sie auf Start Experiment. Speichern Sie die Bilder, sobald die Überprüfung abgeschlossen ist. Oberfläche und Volumen der Astrozyten Gebiet der gesamte Astrozyten einschließlich BH: Dieses Bild wird für die Messung der folgenden Parameter verwendet werdennches, Zellkörper und Kern. </li><li> Erwerben Sie ein 2D-Bild mit einem 10X oder 20X Ziel wie in den Schritten 3,6-3,11 beschrieben. Dieses Bild kann für die Messung der Intensität der Fluoreszenz Immunreaktivität des Antikörper und Astrozyten Dichte (Anzahl / 1000 um 2) verwendet werden. </li></ol> 4. Astrocyte Dichte und GFAP + Fluoreszenzintensität <ol><li> Öffnen Sie das 20X 2D-Bild. Klicken Sie auf Histo (Hisogram) auf der linken Seite des Bildfensters. </li><li> Um Astrozyten Dichte zu berechnen, wählen Sie drei aufeinander folgenden Gesichtsfelder unter 20x-Objektiv. Zählen Sie die Anzahl der Astrozyten, die eine klare soma aufweisen mit einem Minimum an, sich überlappenden Niederlassungen in den Feldern. </li><li> Um Fluoreszenzintensität zu quantifizieren, wählen Sie ein geeignetes Werkzeug (Rechteck oder Kreis) in der Fußzeile der Bildfenster, und wählen Sie einen Bereich für die Messung. Beachten Sie, der Mittelwert und Standardabweichung automatisch unter dem Bild erscheinen. In der aktuellen Studie, ein 0,7 mm 2 rechteckigen Bereich zwischen striatum und mediale Klinge Gyrus dentatus wurde verwendet. </li></ol> 5. Astrocyte Branchen <ol><li> Um die Länge und die Gesamtzahl der Filialen zu quantifizieren, verwenden Sie 3D-Bilder (mit 20X erworben) in der Bildanalysesoftware. Zeichnen Sie eine Linie von Hand entlang der Länge jedes Zweiges des ausgewählten Astrozyten. Wählen Sie dann den Mess-Tool, das zur Messung von Leitungslängen spezialisiert ist. Um die Zahl der Filialen zu quantifizieren, wählen Sie den Count-Werkzeug, um die Anzahl der markierten Objekte zu zählen. </li></ol> 6. Volumen und Oberfläche HINWEIS: Markieren einer Struktur manuell in 3D-Bildanalyse-Software erfordert Fokus und Ausbildung. Üben Sie mehrmals, bevor ein Experiment. <ol><li> Um das Volumen und Oberfläche des Astrozyten-Zellkern, soma, Zellkörper und Territorium zu quantifizieren, übertragen Sie die 3D-Bilder (in Schritten von 3,1 bis 3,16 erworben) zu einem 3D-Bildanalyse-Software wie Volocity 6.1. </li><li> Öffnen Sie die Software und erstellen Sie eine neueBibliothek. Ziehen Sie alle Bilder auf der linken grauen Spalte in der neuen Bibliothek. Dann wählen Sie eine 3D-Bild. Auf der rechten Seite gibt es unterschiedliche Kanäle mit unterschiedlichen Farben. Schalten Sie einen Kanal von Interesse; beispielsweise die Blaukanal für DAPI bei der Messung der Zellkern. Ändern Sie die Helligkeit manuell, um einen optimalen Kontrast zu erhalten. </li><li> Wählen Sie das Menü Extras finden Sie auf Volume Stellen und erzeugen ein einziges 3D-Bild von Z-Stapel-Bildern. Klicken Sie auf Eigenschaften in dem Menü Bearbeiten und stellen Sie sicher, dass X, Y und Z-Eigenschaften werden vorgestellt; sonst ist es unmöglich durchzuführen 3D-Analyse. </li><li> Klicken Sie auf das Freihand-RIO-Werkzeug-Symbol in der Symbolleiste. Um das Volumen und Oberfläche der Astrozyten-Zellkern zu messen ziehen Sie eine Linie um den DAPI-markierten Zellkern. </li><li> Um das Volumen und Oberfläche der Astrozyten-Zellkörper zu messen, ziehen Sie eine Linie um den Soma ohne Filialen. </li><li> Um das Volumen und Oberfläche der gesamten Astrozyten (Zellkörper einschließlich Zweigniederlassungen) messen, ziehen Sie eine Linie um den Soma nach demFläche aller Branchen. </li><li> Um das Volumen und Oberfläche der Astrozyten-Gebiet zu bewerten ziehen Sie eine Linie zwischen den Spitzen der Zweige. HINWEIS: Drücken Sie Entf auf der Tastatur, um unerwünschte Zeichnungen zu löschen. </li><li> Klicken Sie auf die Messungen-Menü am oberen Rand des Bildfensters, um ein Messprotokoll zu erstellen; ein Fenster mit verschiedenen Werkzeugen geöffnet. </li><li> Ziehen Sie die Objekte finden, um oben im Fenster (Fensterbereich). Geben Sie einen aussagekräftigen Namen für die Bevölkerung ein, wählen Sie die zugehörigen Farbe, und klicken Sie auf Messen. Ein weiteres Fenster öffnet sich. </li><li> Wählen Sie einen Parameter, dh, das Volumen oder Fläche. Klicken Sie auf OK. Die Daten werden in einer Tabelle angezeigt. </li><li> Um die Daten klicken Sie auf das Menü Messung zu speichern und wählen Machen Mess Artikel. </li><li> Wählen Sie einen neuen Messpunkt aus dem geöffneten Fenster aufgerufen. Dann geben Sie einen Namen ein, um die Daten und klicken Sie auf OK. </li><li> Schließlich exportieren Sie die Daten der Statistik-Software wie Graph Pad oder Excel-Programm. Verwenden Sie t-Test, um die Daten zu analysieren, dann zeichnen 2D grAPHS. </li></ol>

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	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Pellerin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+regulation+of+energy+metabolism+by+astrocytes:+an+update.">Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update.</a> Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).</li><li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+biology+and+pathology.">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).</li><li>Pekny, M., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+activation+and+reactive+gliosis.">Astrocyte activation and reactive gliosis.</a> Glia. 50 (4), 427-434 (2005).</li><li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation.">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).</li><li>Anderova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death/proliferation+and+alterations+in+glial+morphology+contribute+to+changes+in+diffusivity+in+the+rat+hippocampus+after+hypoxia-ischemia.">Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro.">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A stereotaxic atlas of the rat brain. , (1998).</li><li>Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+surgery+for+excitotoxic+lesion+of+specific+brain+areas+in+the+adult+rat.">Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat.</a> J Vis Exp. (65), e4079 (2012).</li><li>Bagheri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta(1-40)-induced+astrogliosis+and+the+effect+of+genistein+treatment+in+rat:+a+three-dimensional+confocal+morphometric+and+proteomic+study.">Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study.</a> PloS One. 8 (10), e76526 (2013).</li><li>Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+confocal+morphometry+-+a+new+approach+for+studying+dynamic+changes+in+cell+morphology+in+brain+slices.">Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices.</a> J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).</li><li>Kulkarni, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3-D+analysis+of+GFAP+labeled+astrocytes+from+fluorescence+confocal+images.">Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images.</a> J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).</li><li>Wagner, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Object-based+analysis+of+astroglial+reaction+and+astrocyte+subtype+morphology+after+ischemic+brain+injury.">Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury.</a> Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).</li></ol>

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem County Council von Östergötland, (Schweden) und der Cellular and Molecular Research Center an der Iran University of Medical Sciences (Teheran, Iran) unterstützt.

In der aktuellen Protokoll beschäftigten wir 3D-konfokale Morphometrie zu 12 verschiedene Parameter, die mit Astrozytenmorphologie verbunden waren zu bewerten. Hierzu Hippocampusgewebe von Ratten mit 1-40 - induziert wurden Astrogliose, mit oder ohne Vorbehandlung Genistein als entzündungshemmendes Mittel verwendet. Durch Verwendung von 3D-Bildern und morphometrische Software, waren wir in der Lage, die Wirkung von Genistein auf Astrogliose dh der Morphologie von Astrozyten zeigen. <p class="jo...

Bei gesunden zentralen Nervensystems (ZNS), spielen Astrozyten eine wichtige Rolle bei der Regulation des Blutflusses, Energiestoffwechsel, synaptische Funktion und Plastizität und extrazellulären Ionen und Neurotransmitter Homöostase 1-3. Darüber hinaus Astrozyten reagieren auf verschiedene schädliche Reize und anormale Zustände wie Trauma, Infektion, Ischämie oder Neurodegeneration über reaktive Astrogliose die durch Hypertrophie, Proliferation und funktionellen Umgestaltung Astrozyten 4,5 gekennzeichnet ist. Reaktiv Astrogliose kann die Entzündungsreaktion und Reparaturprozesses in der Gewebezüchtung, und daher kann das klinische Ergebnis therapeutischer Maßnahmen beeinflussen. Dementsprechend Astrozyten Aufmerksamkeit von Neuro in den letzten Jahrzehnten als potentielle Ziele für therapeutische Interventionen für eine Vielzahl von Erkrankungen des ZNS erhalten. Astrozyten haben normalerweise eine Sternform mit gut defined Zweige, die rund um den Soma 6 zu verbreiten. In einem erkrankten Zustand, in dem Gehirn, Astrozyten Verzweigungen verworren und zeigen gequollenen Enden 7, beispielsweise in Gegenwart von Amyloid-beta (Aß). Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Analyse von 3D-Bildern von Astrozyten durch konfokale Mikroskopie erworben. Zwölf verschiedene quantitative Parameter für jeden Astrozyten wurden gemessen: die Flächen und Volumina der Astrozyten-Gebiet (die durch einen überdachten Astrozyten Gewebe), gesamte Zelle (einschließlich Zweigniederlassungen), Zellkörper und Kern; die Gesamtlänge und die Zahl der Filialen; die Fluoreszenzintensität von Antikörpern für Astrozyten Erkennung verwendet; und die Dichte der Astrozyten (Anzahl / 1.000 &amp; mgr; m 2). Zu diesem Zweck verwendeten wir Gehirnschnitten von Ratten, um die Injektion von 1-40 mit oder ohne Genistein Behandlung eines entzündungshemmenden Substanz intrahippocampal belichtet. Das beschriebene Protokoll kann für eine morphometrische verwendet werdenalysis verschiedener Zelltypen in vitro oder in vivo in verschiedenen Bedingungen.

<table><tbody><tr><td>Amyloid beta 1-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>79793</td><td>Keep in -70 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Genistein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>446-72-0</td><td>keep in -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies</td><td>DAKO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Permanent Chromogen</td><td>DAKO</td><td>K0640</td><td></td></tr><tr><td>Liquid permanent Red Substrate Buffer</td><td>DAKO</td><td>K0640</td><td></td></tr><tr><td>Cremophor EL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>27963</td><td>Polyethoxylated castor oil - Step 1.1</td></tr><tr><td>LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>Perkin Elmer Inc.,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Analysis 2000</td><td>Tekno Optic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streotaxic apparatus</td><td>Stoelting</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graph pad Prism 5</td><td>Graph pad software Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for three-dimensional confocal morphometric analysis of astrocytes

Gliazellen im Gehirn haben Astrozyten diverse funktionelle Rolle im zentralen Nervensystem. In Gegenwart von schädlichen Stimuli, Astrozyten ihre funktionellen und strukturellen Eigenschaften, eine so genannte reaktive Astrogliose modifizieren. Hier wird ein Protokoll für die Beurteilung der morphologischen Eigenschaften der Astrozyten wird vorgestellt. Dieses Protokoll umfasst die Quantifizierung der 12 verschiedene Parameter, dh die Fläche und das Volumen der von einem Astrozyten (Astrozyten Gebiet) abgedeckt Gewebe, das gesamte Astrozyten einschließlich Filialen, Zellkörper und Kern sowie Gesamtlänge und die Anzahl der Filialen, die Intensität Fluoreszenz Immunreaktivität von Antikörpern für Astrozyten Erkennung verwendet, und Astrozyten Dichte (Anzahl / 1000 um 2). Hierzu dreidimensionale (3D) konfokale mikroskopische Bilder wurden erzeugt und 3D-Bildanalyse-Software wie Volocity 6.3 wurde für die Messungen verwendet. Rattenhirngewebe, um Beta-Amyloid 1-40 ausgesetzt </sub&gt; (1-40) mit oder ohne einen therapeutischen Eingriff verwendet wurde, um das Verfahren darzustellen. Dieses Protokoll kann auch für 3D morphometrische Analyse anderer Zellen entweder in vivo oder in vitro-Bedingungen verwendet werden.

Dieser Abschnitt enthält einige Beispiele für die qualitative und quantitative Beobachtungen 3D morphometrische Analyse hergestellt. Die vollständigen Ergebnisse aller 12 zuvor genannten Parameter finden Sie in unserer früheren Veröffentlichung 10. Qualitative Beobachtungen Astrozyten zeigten dünne oder dicke Äste, die in der Regel in 1-40 injizierten Ratten (Abbildung 1) lang waren. Einige kleine sternförmigen Astro...

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Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K Aufrufe.  Linköping University. Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Serie: Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

Dreidimensionale konfokale Analyse der Mikroglia / Makrophagen-Marker der Polarisation in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Dreidimensionale Gewebezüchtungen ausgerichtet Astrozyten Netzwerke Nervensystem Regeneration zu rekapitulieren Entwicklungsmechanismen

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Biotechnik

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Ein analytisches Werkzeug, das zelluläre Morphologie Änderungen von Dreidimensionale Fluorescence Images Quantifiziert

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Biologie

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network level. Astrocytes are strongly connected to each other through gap junctions and coupling through these junctions is dynamic and highly regulated. An emerging concept is that astrocytic functions are specialized and adapted to the functions of the neuronal circuit with which they are associated. Therefore, methods to measure various parameters of astrocytic networks are needed to better describe the rules governing their communication and coupling and to further understand their functions.
Here, using the image analysis software (e.g., ImageJFIJI), we describe a method to analyze confocal images of astrocytic networks revealed by dye-coupling. These methods allow for 1) an automated and unbiased detection of labeled cells, 2) calculation of the size of the network, 3) computation of the preferential orientation of dye spread within the network, and 4) repositioning of the network within the area of interest.
This analysis can be used to characterize astrocytic networks of a particular area, compare networks of different areas associated to different functions, or compare networks obtained under different conditions that have different effects on coupling. These observations may lead to important functional considerations. For instance, we analyze the astrocytic networks of a trigeminal nucleus, where we have previously shown that astrocytic coupling is essential for the ability of neurons to switch their firing patterns from tonic to rhythmic bursting1. By measuring the size, confinement, and preferential orientation of astrocytic networks in this nucleus, we can build hypotheses about functional domains that they circumscribe. Several studies suggest that several other brain areas, including the barrel cortex, lateral superior olive, olfactory glomeruli, and sensory nuclei in the thalamus and visual cortex, to name a few, may benefit from a similar analysis.

Here we present a protocol to assess the organization of astrocytic networks. The described method minimizes bias to provide descriptive measures of these networks such as cell count, size, area, and position within a nucleus. Anisotropy is assessed with a vectorial analysis.

Analyse der Größe, Form und Direktionalität von Netzwerken von gekoppelten Astrozyten

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction of high-resolution imaged stacks to reveal ultrastructural patterns that could not be resolved using 2D images. Indeed, the latter might lead to a misinterpretation of morphologies, like in the case of mitochondria; the use of 3D models is, therefore, more and more common and applied to the formulation of morphology-based functional hypotheses. To date, the use of 3D models generated from light or electron image stacks makes qualitative, visual assessments, as well as quantification, more convenient to be performed directly in 3D. As these models are often extremely complex, a virtual reality environment is also important to be set up to overcome occlusion and to take full advantage of the 3D structure. Here, a step-by-step guide from image segmentation to reconstruction and analysis is described in detail.

The described pipeline is designed for the segmentation of electron microscopy datasets larger than gigabytes, to extract whole-cell morphologies. Once the cells are reconstructed in 3D, customized software designed around individual needs can be used to perform a qualitative and quantitative analysis directly in 3D, also using virtual reality to overcome view occlusion.

Eine Methode zur 3D-Rekonstruktion und Virtual Reality-Analyse von Glia- und Neuronalzellen

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...

Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, which include neurotransmitter clearance, ion regulation, synaptic modulation, metabolic support to neurons, and blood flow regulation. Astrocytes are complex cells that have a soma, several major branches, and numerous fine processes that contact diverse cellular elements within the neuropil. In order to assess the morphology of astrocytes, it is necessary to have a reliable and reproducible method to visualize their structure. We report a reliable&#160;protocol to perform intracellular iontophoresis of astrocytes using fluorescent Lucifer yellow (LY) dye in lightly fixed brain tissue from adult mice. This method has several features that are useful to characterize astrocyte morphology. It allows for three-dimensional reconstruction of individual astrocytes, which is useful to perform morphological analyses on different aspects of their structure. Immunohistochemistry together with LY iontophoresis can also be utilized to understand the interaction of astrocytes with different components of nervous system and to evaluate the expression of proteins within the labelled astrocytes. This protocol can be implemented in a variety of mouse models of CNS disorders to rigorously examine astrocyte morphology with light microscopy. LY iontophoresis provides an experimental approach to evaluate astrocyte structure, especially in the context of injury or disease where these cells are proposed to undergo significant morphological changes.

Astrocytes are morphologically complex cells, exemplified by their multiple processes and bushy territories. To analyze their elaborate morphology, we present a reliable protocol to perform intracellular Lucifer yellow iontophoresis in lightly fixed tissue.

Visualisierung der Astrozytenmorphologie mit Luzifer gelben Iontophorese

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at adult stages. Thus far, no immunostaining strategy can single them out and segment their morphology in mature animals and over the course of corticogenesis. Cortical PrA originate from progenitors located in the dorsal pallium and can easily be targeted using in utero electroporation of integrative vectors. A protocol is presented here to label these cells with the multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) Markers strategy, which relies on piggyBac/Tol2 transposition and Cre/lox recombination to stochastically express distinct fluorescent proteins (blue, cyan, yellow, and red) addressed to specific subcellular compartments. This multicolor fate mapping strategy enables to mark in situ nearby cortical progenitors with combinations of color markers prior to the start of gliogenesis and to track their descendants, including astrocytes, from embryonic to adult stages at the individual cell level. Semi-sparse labeling achieved by adjusting the concentration of electroporated vectors and color contrasts provided by the Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers or MM) enable to individualize astrocytes and single out their territory and complex morphology despite their dense anatomical arrangement. Presented here is a comprehensive experimental workflow including the details of the electroporation procedure, multichannel image stacks acquisition by confocal microscopy, and computer-assisted three-dimensional segmentation that will enable the experimenter to assess individual PrA volume and morphology. In summary, electroporation of MAGIC Markers provides a convenient method to individually label numerous astrocytes and gain access to their anatomical features at different developmental stages. This technique will be useful to analyze cortical astrocyte morphological properties in various mouse models without resorting to complex crosses with transgenic reporter lines.

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

Astrocytes tile the cerebral cortex uniformly, making the analysis of their complex morphology challenging at the cellular level. The protocol provided here uses multicolor labeling based on in utero electroporation to single out cortical astrocytes and analyze their volume and morphology with a user-friendly image analysis pipeline.

In Utero Elektroporation von Multiadressierbaren Genom-integrierenden Farbe (MAGIC) Marker zur Individualisierung kortikaler Maus-Astrozyten

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at ...

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain cells and their interactions. Viral vector transduction enables the marking of diverse cell types in different fluorescence colors within the same tissue. Cells can be identified genetically by activity or projection. Using a modified CLARITY protocol, the potential sample size of astrocytes and neurons has grown by 2-3 orders of magnitude. The use of CLARITY allows the imaging of complete astrocytes, which are too large to fit in their entirety in slices, and the examination of the somata with all their processes. In addition, it provides the opportunity to investigate the spatial interaction between astrocytes and different neuronal cell types, namely, the number of pyramidal neurons in each astrocytic domain or the proximity between astrocytes and specific inhibitory neuron populations. This paper describes, in detail, how these methods are to be applied.

Combining viral vector transduction and brain clearing using the CLARITY method allows the investigation of a large number of neurons and astrocytes simultaneously.

Untersuchung der räumlichen Interaktion zwischen Astrozyten und Neuronen in geräumten Gehirnen

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections

Astrocytes possess an astounding degree of morphological complexity that enables them to interact with nearly every type of cell and structure within the brain. Through these interactions, astrocytes actively regulate many critical brain functions, including synapse formation, neurotransmission, and ion homeostasis. In the rodent brain, astrocytes grow in size and complexity during the first three postnatal weeks and establish distinct, non-overlapping territories to tile the brain. This protocol provides an established method for analyzing astrocyte territory volume and astrocyte tiling using free-floating tissue sections from the mouse brain. First, this protocol describes the steps for tissue collection, cryosectioning, and immunostaining of free-floating tissue sections. Second, this protocol describes image acquisition and analysis of astrocyte territory volume and territory overlap volume, using commercially available image analysis software. Lastly, this manuscript discusses the advantages, important considerations, common pitfalls, and limitations of these methods. This protocol requires brain tissue with sparse or mosaic fluorescent labeling of astrocytes, and is designed to be used with common lab equipment, confocal microscopy, and commercially available image analysis software.

This protocol describes methods for sectioning, staining, and imaging free-floating tissue sections of the mouse brain, followed by a detailed description of the analysis of astrocyte territory volume and astrocyte territory overlap or tiling.

Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Kachelung in dicken frei schwebenden Gewebeabschnitten

Astrocytes possess an astounding degree of morphological complexity that enables them to interact with nearly every type of cell and structure within the ...

Immunostaining of Fluorescently Labeled Astrocytes in a Mouse Brain Tissue Section

Source: Eaker, A. R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/63804">Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the procedure for immunostaining a fixed mouse brain tissue section with fluorescently labeled astrocytes using primary and secondary antibodies and capture the images of the stained astrocytes through confocal microscopy.

Source: Eaker, A. R., et al. Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections. J. Vis. Exp. (2022)
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