Diese Studie wurde von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Grants-in-Aid for Scientific Research 17H05661 und 18K19903, Core-2-Core-Programm und Beyond AI Institute unterstützt.

<ol>
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G. M., Kamm, R. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+at+the+air-liquid+interface+generate+diverse+nerve+tracts+with+functional+output.">Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output.</a> Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).</li><li>Egawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+for+ALS+using+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).</li><li>Qu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).</li><li>Kirihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Tissue+Model+of+a+Cerebral+Tract+Connecting+Two+Cortical+Regions.">A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions.</a> iScience. 14, 301-311 (2019).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor.">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li></ol>

In einem Teil dieses Protokolls wurde Jiksak Bioengineering, Inc., das von Jiro Kawada gegründet wurde, ein Patent lizenziert.

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung eines Motornervenorganoids (MNO), das ein Axonbündel hat, das aus einem motorischen Neuronensphäroid aus menschlichen iPS-Zellen ausgefahren wird. Das geformte Axonbündel ist dick, flexibel und in unidirektionalen Strukturen gut organisiert. Durch die Sezieren des Axonbündels können hochreines axonales Protein und RNA ausreichend für biochemische Analysen gewonnen werden. Die neuronale Aktivität kann in Axonbündeln und Sphäroiden mit Kalziumbildgebung gemessen werden. Eine Kontamination von kerntechnischen und dendritischen Proteinen im axonalen Lysat wurde durch westliches Blotting nicht nachgewiesen, was zeigt, dass unsere Methode Axone effizient von Zellkörpern und Dendriten trennte.
Einer der Vorteile dieses Protokolls ist die schnelle Differenzierung und Generierung von MNO mit einem Axonbündel, in dem alle Prozesse in 4 Wochen mit dem 3D-Protokoll und 5-6 Wochen mit dem 2D-Protokoll durchgeführt werden können. Dies ist kurz im Vergleich zu anderen Protokollen, die in der Regel 3-4 Wochen dauern, um einfach in MN von embryonalen Stammzellen und iPS-Zellen17 zu unterscheiden, und es dauert zusätzliche 2-4 Wochen, um axonale Dehnung zu erhalten. Das 3D-Protokoll wird aufgrund der kürzeren Differenzierungszeit, weniger Schritten und reduzierten technischen Risiken ohne den Dissoziationsschritt im Vergleich zum 2D-Protokoll in der Regel gegenüber dem 2D-Protokoll bevorzugt. Der mikrofluidische Gewebekulturchip wurde so konzipiert, dass sich die Axone von MNS durch den Mikrokanal zum anderen Fach hin ausziehen können, was die Bildung eines Bündels von Axonen erleichtert, indem axo-axonale Wechselwirkungen und Affinität zwischen Axonen induzieren. Aufgrund des einfachen Versuchsaufbaus können alle hier beschriebenen Protokolle nicht nur von Bioingenieuren durchgeführt werden, die mit der Manipulation eines Gewebekulturchips vertraut sind, sondern auch von Biologen und Neurowissenschaftlern, die mit Mikrofluidik und Mikrofabrikationstechniken nicht vertraut sind. Es sollte beachtet werden, dass die Schritte 1 und 2 auch mithilfe eines externen Fertigungsdienstes ausgeführt werden können.
Einer der entscheidenden Schritte zum Ausführen des Protokolls ist ein sequenzieller Wechsel des Kulturmediums. Es wird empfohlen, das Kulturmedium bei jedem Schritt während der Differenzierung vollständig zu ändern, damit Faktoren im verbrauchten Medium die MN-Differenzierung nicht stören. Ein weiterer kritischer Punkt dieses Protokolls ist die Aufrechterhaltung undifferenzierter iPS-Zellen in guter Qualität. Die Qualität der anfänglichen iPS-Zellkultur wirkt sich signifikant auf die Effizienz bei der Gewinnung von motorischen Neuronen und MNO aus. Ein weiterer Punkt ist, dass der Durchmesser von MNS kleiner sein sollte als die Größe der Bohrung des Chips (1,5 mm). Größere Sphäroide können nicht in die Kammer gelangen und können im Mittelteil eine schwere hypoxische Nekrose erleben. Die Größe von MNSs kann gesteuert werden, indem eine anfängliche Aussaatanzahl von iPS-Zellen (im 3D-Protokoll) oder motorischen Neuronen (im 2D-Protokoll) geändert wird. Die Sädichte der Zellen sollte für jede iPS-Zelllinie optimiert werden.
Unterteilte mikrofluidische Geräte mit Mikrorillen und kleinen Porenfiltern wurden häufig verwendet, um Axone von Zellkörpern und Dendriten zu trennen. Diese Technik kann auch Axone von Zellkörpern und Dendriten trennen, mit überlegener Fülle von Axonen in gebündeltem Gewebe. Im Vergleich zu den anderen Methoden besteht eine wesentliche Einschränkung dieser Methode darin, dass sie nicht zwei verschiedene Kulturmedien in der aktuellen Gestaltung des Gewebekulturchips trennen kann, was die Fähigkeit der Kokultur zweier unterschiedlicher Zellen behindert, die zwei unterschiedliche Medien erfordern. Eine weitere Einschränkung ist, dass der PDMS-Chip eine vorbestimmte Beschränkung der Größe des Gewebes vorgegeben hat. Ein Sphäroid, das größer als das Loch ist, kann nicht in die Kammer gelangen, und das Axonbündel kann nicht dicker als die Breite des mikrofluidischen Kanals werden.
Diese Methode kann auf andere Arten von Neuronen angewendet werden. Unsere Gruppe hat gezeigt, dass sie in der Lage ist, einen Zerebralparesetrakt mit einer modifizierten Methode in Kombination mit zerebralen Organoidtechniken zu modellieren18. Kortikale Sphäroide wurden in beide Fächer eingeführt und die Axone spontan wechselseitig zu jedem Sphäroid gestreckt, und in der Folge bildete sich spontan ein Axonbündel. Dadurch können zwei kortikale Sphäroide durch ein Axonbündel verbunden werden, und das Gewebe konnte als ein Stück erhalten werden. Dies zeigt, dass der Ansatz sehr vielseitig ist, um Axon-Bündelgewebe unabhängig von neuronalen Zelltypen zu bilden. In diesem Protokoll wurden menschliche iPS-Zellen verwendet, jedoch können andere Stammzellen, einschließlich menschlicher ES-Zellen und menschlicher neuronaler Stammzellen, mit Änderungen am vorgestellten Protokoll verwendet werden. 3D-Sphäroide von Neuronen können durch verschiedene Protokolle19,20erzeugt werden. Diese Methode der Herstellung von Geweben mit einem Axon-Bundle kann möglicherweise in Der Zukunft mit den anderen Differenzierungsprotokollen für die Herstellung von 3D MN Sphäroid kombiniert werden. Darüber hinaus können die Dicke und Länge des Axonbündels durch einfache Änderung der Breite und Höhe der Mikrokanäle des Gewebekulturchips für zukünftige Entwicklungen gesteuert werden.
Wir glauben, dass dieses Protokoll für Arzneimitteltests und -screenings verwendet werden kann und zum Verständnis der Mechanismen beitragen kann, die der Entwicklung und Denkkrankheiten von Axonfaszien zugrunde liegen.

Spinale motorische Neuronen (MN) erweitern Axone auf Skelettmuskeln, um die Körperbewegung zu steuern. Ihre axonalen Bahnen sind im Entwicklungsprozess hoch organisiert und reguliert. Trotz vieler Studien über Axonverlängerung und Anleitung1werden die Mechanismen für die organisierte Axonbündelbildung noch untersucht. Axone von motorischen Neuronen werden oft durch neurodegenerative Erkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS)2geschädigt, aber pathophysiologische Mechanismen der Schäden an Axonfascicles sind schlecht verstanden. Daher ist ein physiologisches und pathologisches Modell zur Rekapitulation der Axonbündelbildung und Regression im Feld erforderlich.
Ein menschliches, von Stammzellen abgeleitetes motores Neuron ist eine vielversprechende Plattform, um die Entwicklung und Krankheiten wie ALS3zu verstehen. Humaninduzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) können verwendet werden, um Krankheiten mit Patienten-abgeleiteten Zellen zu modellieren. Bis heute wurden verschiedene Differenzierungsmethoden von pluripotenten Stammzellen in MN4,5,6berichtet. Axone von Neuronen in zweidimensionaler Kultur sind jedoch zufällig orientiert und rekapitulieren nicht in vivo Mikroumgebung innerhalb sich entwickelnder Nerven, in denen Axone durch dichte axo-axonale Wechselwirkungen unidirektional zusammengesetzt werden7. Um dieses Problem zu überwinden, haben wir eine Technik entwickelt, um ein dreidimensionales Gewebe zu erzeugen, das dem motorischen Nerv aus den menschlichen iPS-Zellen8ähnelt, und das Gewebe als Motornervenorganoid (MNO) bezeichnet. Das MNO besteht aus Zellkörpern, die sich in einem motorischen Neuronensphäroid (MNS) und einem axonalen Faszikel befinden, das aus dem Sphäroid ausgestreckt ist. Die Axone im Faszikel sind unidirektional ausgerichtet, was Axonen bei der Entwicklung von Motornerven ähnelt. Daher bieten MNOs auf einzigartige Weise eine physiologische axonale Mikroumgebung, was von keiner anderen zuvor entwickelten neuronalen Kulturmethode durchgeführt wurde.
In diesem Protokoll beschreiben wir Methoden für die Gewebekultur-Chips-Herstellung, schnelle motorische Neurondifferenzierung und motorische Nervenorganoidbildung in entwickelten Chips. Unser Gewebekultur-Chip ist sehr einfach, und er enthält nur ein Fach zum Akzeptieren eines Sphäroids, einen Mikrokanal zur Bildung eines Axonbündels und ein Fach für das Gehäuse von Axonklemmen. Das Gerät enthält keine komplexen Strukturen, einschließlich Mikrogrooves oder Mikroporenfilter, die häufig verwendet werden, um Axone und Zellkörper nach Größe9,10zu trennen. Daher können unsere Geräte einfach hergestellt werden, indem Sie die in diesem Protokoll beschriebenen Schritte befolgen, wenn ein Photolithographie-Setup verfügbar ist.
Eine schnelle Differenzierung menschlicher iPS-Zellen wird durch eine optimierte Kombination von Induzierenden und Musterfaktoren (SB431542, LDN-193189, Retinoinsäure (RA) und geglätteten Agonisten (SAG)) und Beschleunigungsfaktoren (SU5402 und DAPT) erreicht. Es wurde berichtet, dass die Kombination von SU5402 und DAPT die Differenzierung von peripheren Neuronen und neuronalen Kammzellenbeschleunigt 11. In diesem Protokoll bieten wir drei verschiedene Methoden zur Generierung von MNOs an, damit Leser sich für eine Methode entscheiden können, die ihren Bedürfnissen am besten entspricht. Wir empfehlen die Differenzierung menschlicher iPS-Zellen nach der Bildung eines Sphäroids (die 3D-Methode), da das differenzierte MNS direkt in einen Gewebekulturchip übertragen werden kann. Alternativ können menschliche iPS-Zellen in monolayer (2D)-Kultur in motorische Neuronen unterschieden und dann zu dreidimensionalen motorischen Neuronsphäroiden erzeugt werden, wie wir zuvor berichteten8. Wir haben das Protokoll aktualisiert, und mit der in diesem Protokoll beschriebenen dreidimensionalen Differenzierungsmethode kann der Übergang von 2D zu 3D vermieden werden und MNOs können mit kürzerer Differenzierungszeit, weniger Schritten und reduzierten technischen Risiken ohne den Dissoziationsschritt erhalten werden. Kommerziell erhältliche Neuronen können auch verwendet werden, um MNS zu generieren, um die Zeit für differenzierung zu reduzieren.
Um ein MNO zu generieren, haben wir ein MNS im Gewebekulturchip kultiviert. Die Axone verlängern sich aus dem Sphäroid und erstrecken sich in den Mikrokanal, in dem sich Axone unidirektional sammeln und ausrichten. Dies erleichtert die axo-axonale Interaktion und spontane Bildung eines eng zusammengesetzten unidirektionalen Bündelgewebes von Axonen im Mikrokanal, das durch dieses Protokoll einzigartig erreicht wird, während entweder eine spontane Bündelbildung oder eine geführte axonale Orientierung allein durch andere Protokolle12,13,14erreicht werden kann. In einem typischen Experiment wandern nur wenige Zellen aus Sphäroiden zum Mikrokanal und die meisten Zellen bleiben in der Nähe von Sphäroiden. Diese Methode ermöglicht es, Axone spontan von den Sphäroiden zu trennen, ohne größenabhängige physikalische Barrieren (z. B. Mikronuten oder Mikroporenfilter) zu verwenden, um Axone von Zellkörpern zu trennen.
Das resultierende MNO kann verschiedenen Untersuchungen unterzogen werden, einschließlich morphologischer, biochemischer und physikalischer Analysen. Der Zellkörper und das verlängerte Axonbündel können durch Schneiden physikalisch isoliert und für nachgelagerte Experimente, z.B. biochemische Assays, separat analysiert werden. Biologische Materialien wie RNA und Protein können aus wenigen Axonbündeln für regelmäßige biochemische Tests wie RT-PCR und Western Blotting isoliert werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von Motornervenorganoid aus iPS-Zellen, das ein attraktives physiologisches und pathologisches Modell bietet, um den Mechanismus zu untersuchen, der der Entwicklung und Krankheit von Axonfascicles zugrunde liegt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#181;l Wide Bore Pipet Tips</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BMT-200WRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Violamo</td>
			<td>2-8588-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ICT</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>020-12913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Dojindo Laboratories</td>
			<td>CS22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-22542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wako</td>
			<td>085-09355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons)</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol (IPA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA probe</td>
			<td>Alpha MED Scientific inc</td>
			<td>MED-P5004A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>S9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Wako</td>
			<td>141-08941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 2100</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>#SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime surface 96U</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-9096U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR (passaging reagent)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>186-01114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-16541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>SUMCO</td>
			<td>PW-100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td>Dow Toray</td>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smi32 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU5402</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin I Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-24021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional motor nerve organoid generation

Eine Faszikel von Axonen ist eines der wichtigsten strukturellen Motive im Nervensystem beobachtet. Eine Störung der Axonfaszien könnte entwicklungs- und neurodegenerative Erkrankungen verursachen. Obwohl zahlreiche Studien mit Axonen durchgeführt wurden, ist unser Verständnis der Bildung und Dysfunktion von Axonfascicles aufgrund des Mangels an robusten dreidimensionalen In-vitro-Modellen immer noch begrenzt. Hier beschreiben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur schnellen Generierung eines Motornervenorganoids (MNO) aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) in einem mikrofluidischen Gewebekulturchip. Zunächst wird die Herstellung von Chips beschrieben, die für das Verfahren verwendet werden. Aus menschlichen iPS-Zellen wird ein motorischer Neuronsphäroid (MNS) gebildet. Als nächstes wird das differenzierte MNS in den Chip übertragen. Danach wachsen Axone spontan aus dem Sphäroid heraus und fügen sich in einem Mikrokanal, der im Chip ausgestattet ist, zu einem Faszikel zusammen, der ein MNO-Gewebe erzeugt, das ein Bündel von Axonen trägt, das aus dem Sphäroid ausgestreckt wird. Für die nachgelagerte Analyse können MNOs aus dem Chip entnommen werden, um für morphologische Analysen fixiert oder für biochemische Analysen sowie Kalzium-Bildgebung und Multi-Elektroden-Array-Aufnahmen seziert zu werden. Mit diesem Protokoll generierte MNOs können Arzneimitteltests und -screenings erleichtern und zum Verständnis der Mechanismen beitragen, die der Entwicklung und Erkrankungen von Axonfaszikeln zugrunde liegen.

Motorneuronen wurden innerhalb von 12-14 Tagen in 3D-Differenzierungsverfahren unterschieden (Abbildung 4 und Abbildung 5). Wichtig ist, dass mehr als 60% der Zellen während der Differenzierung den motorischen Neuronenmarker HB9 exprimiert haben. Die Immunhistochemie ergab, dass etwa 80% der Zellen im MNS SMI32-positive motorische Neuronen waren. HB9 und SMI32 sind die etablierten motorischen Neuronmarker im Frühstadium15,16. Die Expression von HB9 und SMI32 sind die wichtigsten Parameter, die bestätigt werden müssen, um die zelluläre Identität der motorischen Neuronen zu gewährleisten. Nach der Einführung eines MNS in den Kulturchip erstrecken sich Axone in den Kanal und ein Axonbündel bildet sich. Durch Mikrokanäle, die als physikalische Leitfäden dienen, erlängen sich Axone aus dem MNS und bilden ein Bündel durch axo-axonale Wechselwirkung (Abbildung 6A). Es ist wichtig, die Bildung des Axonbündels durch mikroskopische Beobachtung zu bestätigen, um die Erzeugung eines MNO zu bestätigen. Ein erfolgreiches MNO trägt ein Axonbündel, das breiter als 50 m ist, und wenige isolierte Axone aus dem Bündel im Kanal. Die anfängliche Dehnung der Axone kann 24 Stunden nach der Einführung des Sphäroids beobachtet werden. Innerhalb der nächsten 3-4 Tage erreichten die Axone die Mitte des Mikrokanals und erreichten dann innerhalb von weiteren 10 Tagen das andere Ende(Abbildung 6A). Folglich sammelten sich die Axone und bildeten ein gerades und unidirektionales Bündel in 2-3 Wochen in einem Chip, und danach wurden neuronale Aktivitäten beobachtet.
Motornervenorganoide können aus dem Chip gesammelt werden, indem das PDMS aus dem Mikroskopglas für die biologische Analyse abgelöst wird (Abbildung 6B). Axonbündel und Zellkörper können durch Schneiden mit einem chirurgischen Messer oder einer Pinzette unter dem Mikroskop seziert und isoliert werden (Abbildung 6B). Diese biologischen Materialien einschließlich RNA und Protein können für regelmäßige biochemische Tests wie RT-PCR und Western Blotting verwendet werden. In Axonbündeln von MNOs werden nukleare oder dendritische Herstellerproteine bei der westlichen Blotting nicht nachgewiesen (Abbildung 6C).
In Kombination mit einem Kalziumindikator (Fluo-4 AM) kann die neuronale Aktivität im Gewebekulturchip erfasst werden. Spontane Aktivität von motorischen Neuronen im Sphäroid und im Axonbündel wurde innerhalb des MNO beobachtet. Auch wurden die neuronalen Aktivitäten mit Hilfe eines Multi-Elektroden-Array-Systems beobachtet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> Abbildung 1: Die Dimension des PDMS-Gewebekulturchips. (A) Fotomaske des Gewebekulturchips. (B) Abmessungen des Mikrokanals im Gewebekulturchip. Der Durchmesser der Basiskammer zum Halten des motorischen Neuronsphäroids beträgt 2 mm und das Loch von PDMS über der Kammer 1,5 mm. Die Breite und Höhe eines Mikrokanals, der zwei Kammern überbrückt, sind beide 150 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> Abbildung 2: Schematische Darstellung der motorischen Neuronendifferenzierung. (A) Die Differenzierungsschritte beinhalteten die neuronale Induktion, die Musterung in die Motorneuronenlinie und die Reifung der motorischen Neuronen. (B) Zwei Optionen zum Erstellen von Motorneuronsphäroid (MNS) aus iPS-Zellen: 3D-Protokoll und ein 2D-Protokoll mit Dissoziationsschritt von motorischen Neuronen. Motornervenorganoid (MNO) kann durch beide Protokolle erhalten werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> Abbildung 3: Schritt-für-Schritt-Protokoll für Keller-Membran-Matrix-Beschichtung und Motorneuron-Sphäroid-Einführung. (A) Kellermembran-Matrixbeschichtung im Kanal des Gewebekulturchips. (B) MNS-Einführung in das Loch des Chips. (C) Kulturmedium veränderung durch Streben nach erschöpftem Medium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> Abbildung 4: Differenzierung von 2D- und 3D-Motorneuronen. (A) Zeitverlauf der repräsentativen 3D-MNS-Differenzierung (3D-Protokoll). Die Größe des MNS nahm im Laufe der Zeit allmählich zu. Maßstabsleiste: 500 m. (B) Zeitverlauf der 2D-Differenzierung auf -D2, D0, D1, D6, D12 (2D-Protokoll). Maßstabsleiste: 500 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> Abbildung 5: Charakterisierung der motorischen Neuronen. (A) (Links) Eine Kryosektion eines MNS, der mit SMI-32-Antikörper und DAPI gefärbt ist. (Mitte) Ein Phasenkontrastbild von neu beschichtetem MNS auf einer mit der Kellermembran beschichteten Oberfläche. Axonale Dehnung wurde beobachtet. (Rechts) Axone von replated MNS mit Synapsin I und Tuj1 Antikörpern gefärbt. Skalenbalken: 500 m (Links und Mitte) und 50 m (rechts). (B) Ein repräsentatives Bild von 2D-Motorneuronen, die mit Tuj- und HB9-Antikörpern immunostainiert sind. Maßstabsleiste: 200 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> Abbildung 6: Charakterisierung eines Motornervenorganoids (MNO), das in einem Kulturchip erzeugt wird. (A) Repräsentative Bilder der Axondehnung und der dicken Axonbündelbildung auf D32. Maßstabsleiste: 500 m. (B) Immunostainierung des Motornervenorganoids (MNO) durch SMI-32 und DAPI. Axone und Zellkörper können durch physikalisch schneiden isoliert werden. Scale bar: 1 mm. (C) Reinheit des Proteins aus Axonen und Zellkörpern, quantifiziert durch western Blotting. MAP2, ein dendritischer Marker, wurde im axonalen Protein nicht nachgewiesen, während der axonale Marker Tau1 im axonalen Protein angereichert ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Dieses Protokoll bietet ein umfassendes Verfahren zur Herstellung des menschlichen iPS-Zell-abgeleiteten motorischen Nervenorganoids durch spontane Montage eines robusten Bündels von Axonen, das von einem Sphäroid in einem Gewebekulturchip erweitert wird.

Dreidimensionale Motornerve Organoid Generation

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

three-dimensional-motor-nerve-organoid-generation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K Aufrufe.  The University of Tokyo. Dieses Protokoll bietet ein umfassendes Verfahren zur Herstellung des menschlichen iPS-Zell-abgeleiteten motorischen Nervenorganoids durch spontane Montage eines robusten Bündels von Axonen, das von einem Sphäroid in einem Gewebekulturchip erweitert wird.

Serie: Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Motor Nervendurchtrennung und Zeitraffer-Imaging von Gliazellen Verhalten im Live Zebrafisch

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Forschung

Neurowissenschaften

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

Dreidimensionale Bildgebung und Analyse der Mitochondrien innerhalb von menschlichen Intraepidermal Nervenfasern

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex (pre-SMA and SMA proper) using a combination of fiber dissection techniques on cadaveric specimens and magnetic resonance (MR) tractography. The protocol will also describe the procedure for a white matter dissection of a human brain, diffusion tensor tractography imaging, and three-dimensional documentation. The fiber dissections on human brains and the 3D documentation were performed at the University of Minnesota, Microsurgery and Neuroanatomy Laboratory, Department of Neurosurgery. Five postmortem human brain specimens and two whole heads were prepared in accordance with Klingler's method. Brain hemispheres were dissected step by step from lateral to medial and medial to lateral under an operating microscope, and 3D images were captured at every stage. All dissection results were supported by diffusion tensor imaging. Investigations on the connections in line with Meynert's fiber tract classification, including association fibers (short, superior longitudinal fasciculus I and frontal aslant tracts), projection fibers (corticospinal, claustrocortical, cingulum, and frontostriatal tracts), and commissural fibers (callosal fibers) were also conducted.

The purpose of this study is to show each step of the fiber dissection technique on human cadaveric brains, the 3D documentation of these dissections, and the diffusion tensor imaging of the anatomically dissected fiber pathways.

Faserverbindungen des Ergänzungsmotorenbereichs Revisited: Methodik der Faserdissektion, DTI und Dreidimensionale Dokumentation

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

Erzeugung und Langzeitpflege von Nervenfreiheit<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

In Vivo Einzelmolekül-Tracking bei Drosophila präsynaptischen motorischen Nerv Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

Dreidimensionale Formmodellierung und Analyse von Gehirnstrukturen

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

3D Kinematische Analyse zur funktionellen Bewertung im Rattenmodell von Ischias-Nerven-Crush-Verletzungen

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Reinigung von Fibroblasten und Schwannzellen von sensorischen und motorischen Nerven in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...