Die Autoren möchten sich Nicole Hasenkampf und Amanda Tardo für technische Unterstützung danken. Wir danken auch Drs. Linden Hu und Adriana Marques für die Empfehlung des LeFlap Aufnahme-Vorrichtung, und Dr. Lise Gern für den Unterricht an der Kapillare Fütterungsmethode. Diese Arbeit wurde vom NIH / NCRR Zuschuss 8 P20 GM103458-09 (MEE) und vom National Center for Research Resources und dem Office of Research Infrastructure Programme (OriP) der National Institutes of Health durch Gewährung P51OD011104/P51RR000164 unterstützt.

Eine experimentelle Umriss Zeckenimpfung und Fütterung bei Tieren für die Lyme-Borreliose Forschung ist in Abbildung 1 dargestellt. 1. Impfen Nymphen Ixodes Zecken mit B. burgdorferi Mit Kapillarrohr-Fütterung Bei der Durchführung von Manipulationen mit Zecken werden weiße Laborkittel mit elastischen Ärmel, Handschuhe und Einweg füllig Mützen getragen. <ol><li> Unser Verfahren ist eine modifizierte Version von dem durch Broadwater et al. 49 gemeldet. Bereiten Kapillaren durch Erhitzen und Ziehen Pasteur Pipetten zu brechen Dünne Verwendung einer Pipette Magnet. Mit einer Pinzette und Binokular, brechen Sie die Tipps zur optimalen Durchmesser (ca. 0,2 mm). Ein Rohr standardisiert auf Mundwerkzeuge der Zecke Größe als der Bemessung. Ein Gesichtsschutz sollte bei der Vorbereitung der Pipetten getragen werden. </li><li> Wachsen B. burgdorferi zwischen 2-8 × 10 7 / ml (mid-log-Phase) in BSK-H-Medium (Sigma) conhaltige 6% Kaninchenserum. </li><li> Verwenden Nymphen Zecken, die bei 23 ° C für 4-6 Wochen nach der Häutung der Larven abgelegt wurden. Ort Zecken auf eine kleine 60 x 15 mm Petrischale mit einem doppelseitigen Klebeband auf der äußeren unteren Oberfläche der Schale. Legen Sie die Zecken ventralen Seite nach oben. </li><li> Tauchen Sie die Kapillare Spitze in der B. burgdorferi Kulturröhrchen nach dem Mischen. Legen Sie die Kapillare über das Hypostom der Zecke Mundteile mit einem Binokular. Verwenden Knetmasse, um den Schlauch zu fixieren, wie in 2A gezeigt. </li><li> Legen Sie die Petrischalen mit aufgeklebten Zecken in einem großen, klaren Kunststoffwanne für einen zusätzlichen Grad des Einschlusses. Nasse Handtücher werden hinzugefügt, um Feuchtigkeit zu versorgen. Zeigen die Zecken in einem 37 ° C warmen Inkubator für 30 Minuten-2 Stunden, bis der Defäkation ist offensichtlich. Dies zeigt, dass die Medien, die Spirochäten wurde durch die Zecke übergeben. </li><li> Seien Sie die Zecken für 2-4 Wochen bei 23 ° C, um die Anpassung an die Umwelt Tick vor der Fütterung zu ermöglichensie auf Tiere. </li></ol> 2. Infizieren Mäuse mit B. burgdorferi von Tick <ol><li> Verdünnen Ketamin Lager 1:10 in sterilem Wasser. Betäuben jeder Maus mit 100 mg / kg Ketamin durch intraperitoneale Injektion mit einer Tuberkulinspritze </li><li> Sobald die Maus vollständig betäubt wird, rasieren Sie die Maus von den Ohren bis zur Mitte zurück mit einem feinen (Remington glatt und seidig) Elektro-Trimmer. </li><li> In einem weißen Pfanne ohne andere Gegenstände in der Nähe, übertragen Sie die Nymphen Zecken (Hafen, dass B. burgdorferi) mit einem angefeuchteten Pinsel auf den haarlosen Bereich der Maus. Alternativ können nicht infizierten Zecken auf Mäuse für Xenodiagnose von Mäusen mit verdächtigen Infektion platziert werden. Die Verwendung eines sauberen, weißen Oberfläche Zecken Platzierung wird sichergestellt, dass alle Zecken ungebunden ist leicht ersichtlich. </li><li> Platzieren Sie die Maus in spezialisierten Käfighaltung (Käfighaltung Allentown, Allentown, PA). Die Käfighaltung besteht aus einem Edelstahl-Grill aus dem Boden des Käfigs erhöht. Ter Käfig oben wurde von unserer hauseigenen Werkstatt modifiziert, um den Flaschenhalter genug, um freie Bewegung der Maus unterhalb erlauben zu erheben. Die Pfanne wird mit etwa ½ Zoll von Wasser zu stoppen alle Zecken, die aus Mäusen (3A) fallen gefüllt. Um die Gefahr der Unterkühlung zu minimieren, wiederverwendbare Wärmekissen, Mikrowelle vor verwenden, werden unter den Käfigen, bis Mäuse aus der Narkose aufwachen komplett. Tiere sind oft Ataxie, als sie aus der Narkose und reiben gegen Lebensmittel-und Wasserschalen zu erholen, so müssen diese entfernt werden. Der Wasserstand ist niedrig genug, um Gliedmaßen von Mäusen aus Untertauchen verhindern. </li><li> Setzen Sie den Käfig in einem Fach, das mit Tangle-Trap-Paste (Contech, Victoria, BC, Kanada) und Band gesäumt wurde, um den Einschluss von Arthropoden zu gewährleisten. Die Mäuse werden einzeln in Käfigen gehalten und kontinuierlich während der Dauer der Anästhesie beobachtet. </li><li> Innerhalb von 2 Stunden, wenn Mäuse sind völlig aus der Narkose erwacht, das Essen Schale und Wasserflasche sind in den Käfig ersetzt. Nach 24 Stunden, das Gehäuse Bereicherung, bestehend aus einem Kunststoff-Hütte und Nylabone ersetzt wird. </li><li> Nach 3, 4 und 5 Tage, prüfen Sie die Maus, Käfig und Käfig Wasser gefüttert Zecken. Der Käfig Wasser wird durch einen weißen Metallwanne gesiebt (zB &quot;Goldwaschen&quot;). Spülen gefüttert Zecken in sauberem Wasser und lagern in Plastikdosen (Abbildung 3B). An den Tagen 3 und 4 ersetzen Wasser im Käfig mit sauberem Wasser. Am Tag 5, überprüfen Sie nicht nur den Käfig, aber die Maus gründlich nach Zecken absuchen. In der Regel von dieser Stelle alle Zecken zugeführt und die Mäuse können regelmäßige Käfighaltung zurückgegeben werden. </li><li> Zeigen alle Abfälle aus den Mäusekäfige, einschließlich Flüssigkeiten, Biohazard Behälter für Autoklavieren und Entsorgung. Halten Sie ein Protokoll von der Anzahl der Zecken auf Mäuse und solche, jederzeit wiederhergestellt platziert. </li></ol> 3. Füttern Ticks auf nicht-menschlichen Primaten für die Infektion mit B. burgdorferi oder Xenodiagnose <ol><li> Bereiten Sie die Zecke Aufnahme-Vorrichtung: Schneiden Sie ein 1 ¾ Zoll Durchmesser Kreis in der 3-Zoll-x3-Zoll-LeFlap (Flap) mit einem sauberen Skalpell und die Mess-Reiseführer. Verwenden Sie den Ausschnitt als Vorlage, um Kreise von identischer Größe in der Biatane Schaum und Duoderm geschnitten. Der Schaum wird zur Klappe über der Oberfläche der Haut erhöhen und verhindern, dass mögliche Zerschlagung der Zecke. Die Duoderm fügt eine weitere Schicht der Polsterung und überlagert die Kanten der Aufnahme-Vorrichtung für zusätzliche Sicherheit durch Zecken Flucht. Ein Diagramm der Aufnahme-Vorrichtung ist in Fig. 4 dargestellt. </li><li> Veterinär Personal wird das Tier mit 5-8 mg / kg Telazol durch intramuskuläre Injektion betäuben. </li><li> Clip das Haar des Tieres mit elektrischen Trimmer (Oster) mit der Größe 40 Messern ausgestattet. Alle Bereiche, die von der Jacke abgedeckt werden, werden abgeschnitten: Rücken, Front, Oberarme. Mit Rasierschaum und Dual-Blade Einwegrasierer, dicht eine Fläche von ca. 25 cm x 20 cm vertikal horizontal rasieren. Wischen Sie mit einem feuchten Papiertüchern und trocken blasen mit geringer Wärme, um die Haut zu trocknen. </li><li> Legen Sie die Klappe auf ter Tierrücken, knapp unterhalb des Schulterblatts, auf jeder Seite der Wirbelsäule. Verwenden Sie eine Markierung, um den Kreis an dieser Stelle verfolgen. Bereiten Sie den Hautbereich, um den Kreis von mit SkinPrep abwischen. Dadurch wird Öl in die Haut, die die Haftung von Klebstoff-und Containment-Geräte beeinträchtigen könnten. So dass etwa 1 cm Umfang der Raum um den Kreis, eine Schicht der Hautkleber (SkinBond) mit einer Breite von ca. 4 cm. </li><li> Entfernen Sie die Schutzfolie von der Biatane Schaum und bringt die Haut in die entsprechende Stelle. Die Tiere werden wieder von Tierärzten mit 5 mg / kg Telazol betäubt. Dichten Sie die Ränder mit Hautkleber und Hypafix Band. Entfernen Sie die Schutzfolie von der Klappe und bringen auf dem Biatane. Zeigen Hypafix Band um die Kanten des LeFlap, dann kleben Sie die Maschen des Klappen und legen Sie die Jacke auf das Tier. Band-und Tangle-Trap-Paste wird auf dem Boden in einem Umkreis um den menschlichen Primaten Käfighaltung für zusätzliche Sicherheit angewendet. </li><li> Um die Auswirkungen zu minimieren chemicALS in Schritt 3.4 auf Pump Fütterung verwendet wird, werden die Zecken hat 24 Stunden nach der Aufnahme-Vorrichtung an Ort und Stelle ist. An diesem Punkt wird die Sicherheit der Vorrichtung inspiziert und auch verstärkt werden, wenn nötig. Typischerweise werden 20 nüchterne Nymphen (4-8 Wochen nach der Häutung der Larven) auf die Haut im Gerät mit einem Pinsel aufgenommen. </li><li> Entfernen Sie die Schutzfolie aus dem Netz der Klappe und verschließen Sie sie fest. Schließlich entfernen Sie die Duoderm Unterstützung, um Kleber freizulegen, und legen Sie oben auf der Aufnahme-Vorrichtung. Fügen Sie ein Stück Hypafix Band über das offene Mesh-Kreis und die Jacke ersetzen. Die fertige Behältervorrichtung ist in Fig. 5A gezeigt. </li><li> Nach 5 Tagen, die Tiere zu betäuben, wie oben und die Jacken entfernt. Entfernen Sie das Band erste Zecke Fütterung durch die Maschen (5B) zu inspizieren. Ziehen Sie vorsichtig die Duoderm weg von der Klappe. </li><li> Ziehen Sie den Netzabschnitt an den Rändern, um Zugang zu den Zecken bereitzustellen. Fed Zecken werden häufig in der Nähe oder im Internet unterder Schaum Kreis (Fig. 5C) und werden entfernt und mit einem Pinsel in reinem Wasser gegeben. Entfernen Sie das Gerät einmal alle sichtbaren gefüttert Zecken gesammelt (5D). </li></ol> Hinweis: Normalerweise können die Rückhaltevorrichtung einfach von der Haut abgezogen werden. Wenn die Haftung ist stark und könnte die Haut schädigen, wird Unisolve Lösungsmittel auf den Bereich für schonende Entfernung aufgetragen. Die Haut wird mit Isopropanol abgewischt und Zecken werden bei 23 ° C gelagert Wenn für die Infektion verwendet wird, kann die Zecken zerkleinert, um die Nummer, die B enthalten bestätigen burgdorferi. Wenn für Xenodiagnose verwendet wird, werden die Zecken für 1-3 Wochen vor der Analyse der Mitteldarminhalt gehalten.

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Um Zecken diesem Hafen B zu erhalten burgdorferi für nachfolgende Untersuchungen kann die Zecken werden: (1) bei infizierten Mäusen im Larvenstadium zugeführt wird, (2) in B. taucht burgdorferi Kulturen entweder an der Larven oder Nymphenstadium 48, (3) mit B. mikroinjizierten burgdorferi-47, oder (4)-Kapillare zugeführt B. burgdorferi-49. Während jedes dieser Verfahren hat den Zweck, zu gewährleisten, dass ein großer ...

Im Jahr 2011, Lyme-Krankheit war die 6. häufigste Landesmeldepflichtige Krankheit in Nordamerika ( <a href="http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html" target="_blank">http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html</a> ). B. burgdorferi ist ein vielseitiges Mikrobe, genetisch und antigene (Übersicht in 1). Seine genetische Konstitution umfasst eine große (&gt; 900 kB) Chromosom und bis zu 21 Plasmide (12 lineare, kreisförmige 9), die mit Plasmid-Gehalt unter unterschiedlichen Isolaten. Viel ist über diese Spirochäten gelernt werden, da mehr als 90% der Plasmid-offenen Leserahmen mit keinem der bekannten bakteriellen Sequenzen sind 2,3. B burgdorferi bietet eine Vielzahl von Antigenen als mögliche Ziele der Wirtsimmunität. Doch eine unbehandelte Infektion oft anhält. Das Zusammenspiel der Spirochäten mit der Zecke Milieu und dem Wirbel Host-Umgebung erfordert Anpassung von B. burgdorferi während des Infektionsprozesses. Mehrere Plasmid-kodiertenGene sind dafür bekannt, unterschiedlich in Reaktion auf Änderungen der Temperatur, des pH, der Zelldichte und sogar Stufe des Lebenszyklus der Zecke 4-8 ausgedrückt. Die Studie von B. burgdorferi Anpassung während seiner Enzootische Zyklus und Wirtsreaktionen nach der Infektion durch den natürlichen Weg beruht auf der Fähigkeit, Zecken auf geeigneten Tiermodellen zu ernähren. Solche Studien sind mit den technischen Herausforderungen der Erzeugung von Zecken, die B. Hafen erfüllt burgdorferi und die Sicherstellung der effizienten Übertragung und / oder Fütterung von Zecken auf dem Modell-Host. Darüber hinaus ist die Rückhaltung und Gewinnung von infizierten Zecken wesentlich. Unter den verwendeten Modelle sind Mäusen und nicht-menschlichen Primaten, von denen jeder dient als wertvolles Werkzeug bei Lyme-Borreliose Forschung. Wie mit dem weiß-footed Maus, die ein natürliches Reservoir für B. Host ist burgdorferi, ist die Labormaus ein sehr anfällig Host, persistierende Infektion unterstützt von B. burgdorferi-9. Folgende Infektion Krankheit anfälligen Mäusen, wie den C3H-Stamm, der Spirochäten zu verbreiten, um mehrere Gewebe, einschließlich der Haut, der Blase, Muskeln, Gelenke und Herz. Entzündliche Reaktionen auf die Infektion erkrankten Herz-und Gelenkgewebe führen. Während die Spirochäten bestehen in diesem Wirt und infektiös bleiben können entzündliche Läsionen intermittierende werden, nicht anders als der Prozess beim Menschen. Das Mausmodell ist damit vorgesehen viel Informationen über B. burgdorferi-induzierten Pathologie, einschließlich Arthritis und Karditis und Host-Immunantworten 10-12. Aus der Perspektive des Erregers sind bestimmte Gene in Säuger Infektion differentiell exprimiert wird, da einige notwendige zur Übertragung von der Zecke Vektor 13-21 haben. Obwohl mehrere Tierarten verwendet worden, um die Lyme-Krankheit 22 studieren, Rhesusaffen am ehesten imitieren die Multi-Organ-Charakter der menschlichen Krankheit 23. Im Gegensatz zu anderenTiermodelle, die Breite von Krankheitserscheinungen wie Erythema migrans, Karditis, Arthritis und Neuropathien des peripheren und zentralen Nervensysteme bei Makaken beobachtet. Bei Mäusen, die Reservoirwirt für B. burgdorferi, variiert Krankheit durch Mausstamm und 24 Jahren, während der frühen und späten verbreitet Manifestationen sind selten 9. Darüber hinaus sind andere Nagetiere, Hasentiere, und Eckzähne alle scheitern zu neurologischen Krankheit von B. zeigen burgdorferi-Infektion 25. Wichtig ist, Makaken zeigen Anzeichen, die charakteristisch für alle drei Phasen der Lyme-Borreliose, nämlich früh lokalisierte, Früh verbreitet, und im Spätstadium Lyme-Borreliose sind 26-28. Erythema migrans (EM) ist gedacht, um in 70-80% der Fälle bei Menschen 29 auf, und ist auch in Rhesusaffen 28,30 ersichtlich. Nach der Infektion verbreiten die Borrelien aus der Impfstelle, mehrere Organe. Spirochäten DNA wurde in Skelett mu erkanntscles, Herz, Blase, periphere Nerven-und Plexus sowie im zentralen Nervensystem (Gehirn-, Hirnstamm und Kleinhirn, Rückenmark und Dura mater) 31. Kreuzen Sie ernähren sich von Mäusen, wurde von uns und anderen Forschungsteams wurden für die Vermehrung von Zecken Kolonien genutzt, im Vorratsbehälter Kompetenz studiert 32-36 und in den Studien von B. burgdorferi Pathogenese 37-40. Diese Technik ist auch für Xenodiagnose und Prüfung von Impfstoffwirksamkeit bei Mäusen 41-44 verwendet. Wir haben eingespeist Ixodes Zecken auf nicht-menschlichen Primaten für die Modellentwicklung 28, eine Studie über die Wirksamkeit des Impfstoffes 45 und für Xenodiagnose in der Beurteilung der Persistenz Post-Antibiotika-Behandlung 46. Zecken diesem Hafen B. burgdorferi kann in einem natürlichen Zyklus, indem Enzootische Larven auf infizierten Mäusen und mit den Nymphen für Studien, wie die Borrelien werden durch die Lebensphasen übertragen beibehalten werden. In diesem BerichtWeisen wir auf, wie man Zecken mit Wildtyp-oder Mutanten-B-Infektion erzeugen burgdorferi, mit Kapillarrohr-Fütterung. Dies kann auch durch Mikroinjektion 47 und 48 durch Eintauchen durchgeführt werden. Der Zweck der Einführung von künstlichen B. burgdorferi in Zecken sein kann, Mutanten-Stämme, deren Übertragbarkeit ist nicht bekannt, zu untersuchen, um eine Gruppe von Zecken mit einer hohen Infektionsrate zu erzeugen und Fehlerpotential zu reduzieren, indem sie eine saubere und sonst nicht infizierten Zecke Kolonie. Darüber hinaus zeigen wir, Tick Fütterung auf Mäuse und nicht-menschlichen Primaten, um Eindämmung und Rückgewinnung von Zecken voll zu gewährleisten. Die Verwendung von Haken Fütterung ist für zukünftige Studien der Immunantwort auf B. burgdorferi-Infektion, mögliche Lyme-Impfstoff Wirksamkeit und Xenodiagnose zum Nachweis von okkulten Infektionen.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSK-H</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-8291</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tangle Trap coating Paste</td>
			<td>Ladd research</td>
			<td>T-131</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SkinPrep</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>177364</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LeFlap, 3" x 3"</td>
			<td>Monarch Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hypafix tape</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>191523</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SkinBond</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>554536</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>UniSolve</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>176640</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Biatane Foam, adhesive 4"x4"</td>
			<td>Coloplast</td>
			<td>3420</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DuoDerm CGF Dressing - 4" x 4", (3/4)" adhesive border </td>
			<td>Convatec</td>
			<td>187971 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonhuman primate jackets with flexible 2" back panels; add drawstrings at top and bottom</td>
			<td>Lomir Biomedical Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipet puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 700C</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dark field microscope</td>
			<td>Leitz Wetzlar</td>
			<td>Dialux</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Zoom 2000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mouse caging</td>
			<td>Allentown caging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

feeding of ticks on animals for transmission and xenodiagnosis in lyme disease research

Die Übertragung der Erreger der Lyme-Borreliose, Borrelia burgdorferi, tritt durch die Anbringung und Blut Fütterung von Ixodes Zecken auf Säugetierarten Gastgeber. In der Natur kann diese zoonotischen bakteriellen Erreger eine Vielzahl von Reservoirwirten verwenden, aber die weiß-footed Maus (Peromyscus leucopus) ist der wichtigste Reservoir für die Larven-und Nymphen Zecken in Nordamerika. Menschen sind Neben Gastgeber am häufigsten infiziert mit B. burgdorferi durch den Biss von Zecken im Nymphenstadium. B. burgdorferi passt seine Hosts am enzootische Zyklus, also die Fähigkeit, die Funktionen dieser Spirochäten und deren Auswirkungen auf Säugetierwirte erforschen erfordert die Verwendung von Haken Fütterung. Darüber hinaus ist die Technik der Xenodiagnose (unter Verwendung des natürlichen Vektor für Erkennung und Wiederherstellung eines Infektionserregers) hat sich als nützlich in Studien der kryptischen Infektion. Um diese zu erhalten, Nymphen Zecken Hafen B. burgdorferi,Zecken werden live Spirochäten in der Kultur durch Kapillaren zugeführt. Zwei Tiermodelle, Mäusen und nicht-menschlichen Primaten, werden am häufigsten für die Lyme-Borreliose Studien mit Zeckenzeit verwendet. Wir zeigen die Methoden, mit denen diese Zecken können auf zugeführt werden, und von den Tieren entweder für Infektion oder Xenodiagnose erholt.

Nach der Beendigung der kapillaren Zuführung, die Zecken werden typischerweise bei 23 ° C für 2-3 Wochen ruhen, bevor sie an Tieren für die Übertragung zugeführt. Verwendung der kapillaren Zufuhr Technik haben wir festgestellt, dass über 90% des zugeführten Zecken Hafen B. burgdorferi. Der Prozentsatz der positiven Zecken wird durch Waschen bestimmt Zecken in Wasserstoffperoxid und Ethanol, dann locker und in sterilem PBS mit einem Mikrozentrifugenröhrchen förmige Stößel. Die Mitteldarminhalt in die...

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Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Lyme-Borreliose ist die am häufigsten berichteten Vektor-übertragene Krankheit in Nordamerika. Der Erreger ist Borrelia burgdorferi Spirochäten Bakterium übermittelt durch Schildzecken. Übertragung und Erfassung von Infektionen in Tiermodellen durch die Verwendung von Zecken Fütterung, die wir hier beschreiben optimiert.

Fütterung von Zecken auf Tiere, die zur Übertragung und Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.1K Aufrufe.  Tulane University Health Sciences Center.  Lyme-Borreliose ist die am häufigsten berichteten Vektor-übertragene Krankheit in Nordamerika. Der Erreger ist Borrelia burgdorferi Spirochäten Bakterium übermittelt durch Schildzecken. Übertragung und Erfassung von Infektionen in Tiermodellen durch die Verwendung von Zecken Fütterung, die wir hier beschreiben optimiert. 

Serie: Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

RNA Interference in Ticks

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors of human diseases1 and the most important vectors affecting cattle industry worldwide2. Ticks are classified in the subclass Acari, order Parasitiformes, suborder Ixodida and are distributed worldwide from Arctic to tropical regions3. Despite efforts to control tick infestations, these ectoparasites remain a serious problem for human and animal health4,5.
RNA interference (RNAi)6 is a nucleic acid-based reverse genetic approach that involves disruption of gene expression in order to determine gene function or its effect on a metabolic pathway. Small interfering RNAs (siRNAs) are the effector molecules of the RNAi pathway that is initiated by double-stranded RNA (dsRNA) and results in a potent sequence-specific degradation of cytoplasmic mRNAs containing the same sequence as the dsRNA trigger7-9. Post-transcriptional gene silencing mechanisms initiated by dsRNA have been discovered in all eukaryotes studied thus far, and RNAi has been rapidly developed in a variety of organisms as a tool for functional genomics studies and other applications10.
RNAi has become the most widely used gene-silencing technique in ticks and other organisms where alternative approaches for genetic manipulation are not available or are unreliable5,11. The genetic characterization of ticks has been limited until the recent application of RNAi12,13. In the short time that RNAi has been available, it has proved to be a valuable tool for studying tick gene function, the characterization of the tick-pathogen interface and the screening and characterization of tick protective antigens14. Herein, a method for RNAi through injection of dsRNA into unfed ticks is described. It is likely that the knowledge gained from this experimental approach will contribute markedly to the understanding of basic biological systems and the development of vaccines to control tick infestations and prevent transmission of tick-borne pathogens15-19.

A method for RNA interference (RNAi) by injection of dsRNA into unfed ticks is described. RNAi is the most widely used gene-silencing technique in ticks where the use of other methods of genetic manipulation has been limited.

RNA-Interferenz in Ticks

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1. A tick-borne murine model 2 has been developed to study Lyme disease in the laboratory. While na&iacute;ve ticks can be infected with B. burgdorferi by feeding them on infected mice, the molting process takes several weeks to months to complete. Therefore, development of more rapid and efficient tick infection techniques, such as a microinjection-based procedure, is an important tool for the study of Lyme disease 3,4. The procedure requires only hours to generate infected ticks and allows control over the delivery of equal quantities of spirochetes in a cohort of ticks. This is particularly important as the generation of B. burgdorferi infected ticks by the natural feeding process using mice fails to ensure 100% infection rate and potentially results in variation of pathogen burden amongst fed ticks. Furthermore, microinjection can be used to infect ticks with B. burgdorferi isolates in cases where an attenuated strain is unable to establish infection in mice and thus can not be naturally acquired by ticks 5. This technique can also be used to deliver a variety of other biological materials into ticks, for example, specific antibodies or double stranded RNA 6. In this article, we will demonstrate the microinjection of nymphal ticks with in vitro-grown B. burgdorferi. We will also describe a method for localization of Lyme disease pathogens in the tick gut using confocal immunofluorescence microscopy.

Lyme disease research studies often require generation of ticks infected with the pathogen Borrelia burgdorferi, a process that typically takes several weeks. Here we demonstrate a microinjection-based tick infection procedure that can be accomplished within hours. We also demonstrate an immunofluorescence method for in situ localization of B. burgdorferi within ticks.

Methoden zur raschen Transfer und die Lokalisierung von Lyme-Borreliose Erreger innerhalb der Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

Speichel, Speicheldrüse, und Hämolymphe Abholung Ixodes scapularis Zecken

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab Sampling Verfahren zum Nachweis von humanem Norovirus auf Oberflächen

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

Protokolle für die Untersuchung die Host-Gewebeverteilung, Transmission-Modus und Effekt auf der Host-Fitness eines Densovirus im Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Bewertung der zytotoxischen und immunmodulatorische Wirkung von Substanzen im menschlichen Precision-Cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

Erhebung und Verarbeitung von Lymphknoten von großen Tieren für RNA-Analyse: Vorbereitung auf Lymphknoten Transkriptomischen Studien der großen Tierarten

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

Sexual Transmission of American Trypanosomes from Males and Females to Naive Mates

American trypanosomiasis is transmitted to humans by triatomine bugs through the ingestion of contaminated food, by blood transfusions or accidently in hospitals and research laboratories. In addition, the Trypanosoma cruzi infection is transmitted congenitally from a&#160;chagasic mother to her offspring, but the male partner&#39;s contribution to in utero contamination is unknown. The findings of nests and clumps of amastigotes and of trypomastigotes in the theca cells of the ovary, in the goniablasts and in the lumen of seminiferous tubules suggest that T. cruzi infections are sexually transmitted. The research protocol herein presents the results of a family study population showing parasite nuclear DNA in the diploid blood mononuclear cells and in the haploid gametes of human subjects. Thus, three independent biological samples collected one year apart confirmed that T. cruzi infections were sexually transmitted to progeny. Interestingly, the specific T. cruzi antibody was absent in the majority of family progeny that bore immune tolerance to the parasite antigen. Immune tolerance was demonstrated in chicken refractory to T. cruzi after the first week of embryonic growth, and chicks hatched from the flagellate-inoculated eggs were unable to produce the specific antibody.&#160;Moreover, the instillation of the human semen ejaculates intraperitoneally or into the vagina of naive mice yielded T. cruzi amastigotes in the epididymis, seminiferous tubule, vas deferens and uterine tube with an absence of inflammatory reactions in the immune privileged organs of reproduction. The breeding of T. cruzi-infected male and female mice with naive mates resulted in acquisition of the infections, which were later transmitted to the progeny. Therefore, a robust education, information and communication program that involves the population and social organizations is deemed necessary to prevent Chagas disease.

The Trypanosoma cruzi agent of Chagas disease produces long-lasting asymptomatic infections that abruptly develop into clinically recognized pathology. The following research protocol describes a short-run family-based epidemiological study to unravel the T. cruzi infection transmitted sexually from parent to progeny.

Sexuelle Übertragung von amerikanischen Trypanosomen von Männchen und Weibchen zu Naive Mates

American trypanosomiasis is transmitted to humans by triatomine bugs through the ingestion of contaminated food, by blood transfusions or accidently in ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

Hocheffiziente Transfektion von primärer Makrophagen mit In Vitro transscribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This parasitic disease requires a protozoan parasite, an Anopheles mosquito vector, and a vertebrate host. The Anopheles genus comprises more than 500 species, of which 60 are known as vectors of the parasite. The Plasmodium parasite genus consists of 250 species, and 48 of these are involved in disease transmission. Furthermore, the Plasmodium falciparum parasite has contributed toward an estimated 99.7% of malaria cases in sub-Saharan Africa in recent years. 
Gametocytes form part of the sexual stage of the parasite and are ingested by the female mosquito upon feeding on an infected human host. Further development of the parasite within the mosquito is enhanced by favorable environmental conditions in the midgut of the mosquito. Here, the fusion of the female and male gametes takes place, and the motile ookinetes originate. The ookinetes enter the midgut epithelium of the mosquito, and mature ookinetes form oocysts, which, in turn, produce motile sporozoites. These sporozoites migrate to the mosquito's salivary glands and are injected as a mosquito takes a blood meal. 
For drug discovery purposes, mosquitoes were artificially infected with gametocyte-infected blood in the standard membrane feeding assay (SMFA). To detect infection within the mosquito and/or to assess the efficacy of antimalarial compounds, the midguts of the female mosquitoes were removed post infection and were stained with mercurochrome. This method was used to enhance the visual detection of oocysts under the microscope for the accurate determination of oocyst prevalence and intensity.

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

The standard membrane feeding assay (SMFA) is regarded as the gold standard for the assessment and identification of potential antimalarial compounds. This artificial feeding system is used to infect mosquitoes to further evaluate the effects of such compounds on the intensity and prevalence of the Plasmodium falciparum parasite.

Standard-Membran-Fütterungstest zum Nachweis von Plasmodium falciparum-Infektionen in Anopheles-Mückenvektoren

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...