Die Finanzierung wurde von NSF CCLI # 0633618 und der Ohio University zur Verfügung gestellt. Einige Stämme wurden vom Caenorhabditis Genetics Center geliefert. Graduate Student Reetobrata Basu erscheint in dem Video.

HINWEIS: Mehrere Protokollschritte sind mit Optionen für die Einrichtung und Vorbereitung abhängig von den spezifischen Bedingungen des Experiments vorgestellt. Für diese Fälle sind alternative Schritte A, B, C usw. dargestellt Das Protokoll mit alternativen Schritte ist in Fig. 1 skizziert. 1. Vorbereitung von Polylysin beschichtete Objektträger Drei verschiedene Arten von Folien verwendet werden können, abhängig von dem gewünschten Kompromiß zwischen der Leichtigkeit der Herstellung, relativ Haftung und nicht-spezifische Bindung des Antikörpers. Details der Objektträgerpräparations Alternativen sind unten in den Schritten 1A-1C in der Reihenfolge zunehmender Komplexität und Adhäsion gegeben. Folien mit diesen verschiedenen Verfahren hergestellt werden, können für ein einzelnes Experiment zusammen verwendet werden. 1A. Keine Rutsche Vorbereitung Im Handel erhältliche Polylysin beschichtete Objektträger bieten geringe Haftung und niedrigen Hintergrund. 1B. Slide preparation Optimum für Methanol-Aceton-Fixierung Medium Haftung und geringe Hintergrund. <ol><li> Bereiten Sie einen Polylysin-Lösung für das Eintauchen der Objektträger: In 400 mg mit sehr hohem Molekulargewicht (150.000 - 300.000 D) Poly-L-Lysin zu 200 ml doppelt destilliertem Wasser. 2 ml 10% Natriumazid Lager (Endkonzentration 0,1%) als Konservierungsmittel. ACHTUNG: trocken Natriumazid ist reaktiv und alle Formen sind giftig. Maske tragen und Handschuhe beim Wiegen Pulver zu 10% Lager in doppelt destilliertem Wasser zu machen. </li><li> Wischen einzelne Ende Milchglasobjektträger mit fusselfreien Tüchern, Entfernen Flecken und Partikel. Dies sollte auch auf Objektträger mit der Bezeichnung gekauft getan werden &quot;vorgereinigt.&quot; </li><li> Die Objektträger Rücken an Rücken in einer Objektträgerhalter, Glasküvette oder andere Dia-Färbung Behälter, halten mattierte Kanten und nicht ganz perfekt ausgerichtet (um spätere Trennung einfacher). Zeigen Scheibe Halter im Becherglas mit 70% Ethanol (Alkohol Reagenzqualität nicht erforderlich) mit 1% HCl in diWasser gestillt oder füllen Küvette zu Ebene der Zuckerguss. Steinschlag in der Lösung für mindestens 5 min. ACHTUNG: Diese Lösung ist ätzend, Handschuhe tragen. HINWEIS: Diese Lösung kann mehrfach wiederverwendet werden können (bis zu mehreren Monaten). </li><li> Spülen Sie Folien in destilliertem Wasser läuft für 1 min. </li><li> Trockenrutschen komplett in einer staubfreien Umgebung entweder, indem in einem Ofen 40-60 ° C für 30-60 Minuten oder über Nacht bei Raumtemperatur zu halten. </li><li> Die Objektträger in Polylysin-Lösung (für unfrosted Teile) auf Wippe für 15 min. </li><li> Wiederholen Trocknung von Folien. </li><li> Wiederholen Polylysin-Lösung Inkubation und Trocknungsschritte. </li><li> Trennen Sie die Folien mit einem schlanken Metallgegenstand mit einem Gewicht von einer dünnen Spachtel. Wenn sie korrekt eingehalten werden, sind sie schwierig zu trennen. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung (Schutzbrille) und die Arbeit an Tischpapier (nach Gebrauch weggeworfen werden), da kleine Glassplitter fliegen können lose, wenn Folien voneinander getrennt sind. </li><li> Shop Dias in Rein(Staubfrei) Dia-Box bei 4 ° C bis benötigt. </li></ol> 1C. Schieben Vorbereitung optimal für Formaldehyd-Fixierung Höchste Haftung, aber hohe Hintergrund. <ol><li> Objektträger mit der Methode 1B Wohnung in einer staubfreien, ofenfeste Form (für das Trocknen im Ofen) oder auf einer flachen Oberfläche staubfrei vorbereitet (für die Lufttrocknung). </li><li> Platzieren einer 20-60 &amp;mgr; l Tropfen der Polylysin-Lösung auf die Mitte der einzelnen Folien. </li><li> Trocken Folien vollständig im Ofen oder bei Raumtemperatur. Die Polylysin hinter blass Ovale lassen, wie es verdunstet. Diese Ovale sind sehr Kleber. Leider sind sie auch für die primären und sekundären Antikörper zu binden, auch nach der Blockierung. </li><li> Shop Folien sauber (staubfrei) Dia-Box bei 4 ° C bis benötigt. </li></ol> 2. Herstellung von Frozen Nematode Slides Bereiten Nematoden für die Färbung durch Spülen vollständig frei von Bakterien mit der Methode 2A (für Platten von Nematoden) oder2B (für einzelne Nematoden). 2A. Herstellung von Folien aus Platten von Nematoden <ol><li> Stellen Sie ein flaches Stück Metall auf Trockeneis Vorkühlung. </li><li> Verwenden Sie destilliertes Wasser und einer Glaspipette (verringert Verlust von Würmern) oder Mikropipette, um Würmer aus NGM-Platte mit Bakterien in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen spülen. Die Platten können synchronisiert werden oder gemischt Alters; verwenden Sie keine Platten mit vielen dauers (schwer zu knacken) oder verhungert Würmer (erhöhte Autofluoreszenz), sofern erforderlich. </li><li> Mit destilliertem Wasser spülen die Würmer 3-4x, bis sie frei von Bakterien. (Um den Verlust von Würmern verringern die gleiche Glaspipette.) Zum Pellet Würmer, entweder wir sie auf der Bank sitzen für 3-5 min (zu meist Erwachsene auf dem Boden des Röhrchens zu sammeln) oder Spin 30 Sekunden bei ~ 1000 rpm (~ 500 g) in einer Tischzentrifuge (für Erwachsene, Larve, sammeln und Embryonen). </li><li> Entfernen Sie die meisten von Wasser aus Rohr mit Würmern, so dass etwa die doppelte Menge Wasser wie Würmer (mindestens jedoch 25 ul Gesamtvolumen). </li><li&gt; Etiketten mattierte Seite der &quot;Boden&quot; (in Schritt 1) ​​behandelt Polylysin Folien mit wasserfester Tinte und Objektträger auf Zähler nächsten Behälter mit Trockeneis Etikett nach oben. </li><li> Eine gleiche Anzahl von regelmäßigen (sauber gewischt, aber nicht behandelt Polylysin) &quot;oben&quot; Folien zur Verfügung. </li><li> Platz ~ 25 ul Würmer im Wasser auf dem &quot;Boden&quot; haftRutsche und die Ausbreitung der Flüssigkeit, die die Würmer über den mittleren Abschnitt des Schlittens mit der Seite der Pipettenspitze. </li><li> Lassen Sie die Würmer für 30 Sekunden bis 2 Minuten zu begleichen. Wenn der Schieber entsprechend klebrig, werden die Enden der Schnecken halten, wie sie den Schieber kontaktieren. </li><li> Halten Sie den Boden gleiten in einer Hand und legen Sie den Oberschlitten über den Boden gleiten, so dass alle, aber die Vereiste Bereiche überlappen. Die Flüssigkeit sollte die Folien leicht auseinander halten, so dass die Würmer noch leicht bewegen lassen Sie sich nicht die Folien gleiten übereinander -. Diese verdreht die Würmer. </li><li> Drücken Sie vorsichtig gerade nach unten sleicht auf den Oberschlitten, mit dem Daumen und Zeigefinger jeder Hand. Mit der idealen Menge an Druck, wird ein paar der größten Hermaphroditen am Rande der Folien reißen, während die meisten Erwachsenen und Larven wird jede Folie zu kontaktieren, aber intakt bleiben. </li><li> Sofort und vorsichtig (ohne zu rutschen) setzen die Folien auf dem Stück Metall auf Trockeneis. Die Folien sollten innerhalb einer Minute eingefroren erscheinen. Halten Sie auf Trockeneis für 5 Minuten, bis sie gründlich eingefroren. </li><li> An diesem Punkt können die Objektträger in ein Eingabefenster bei -80 ° C für mehrere Tage gelagert werden. (Wenn sie bei -80 ° C gehalten Wochen sind, wird das Wasser anfangen zu sublimieren entfernt und die Würmer nicht so gut färben). Wenn Folien werden bei -80 ° C gelagert, lassen Sie sie &quot;warm up&quot; auf Trockeneis für 10 min vor Rissbildung. </li><li> Gehen bis 3 (Fixierung) Schritt. </li></ol> 2B. Herstellung von Folien aus einzelnen Nematoden <ol><li> Stellen Sie ein flaches Stück Metall auf Trockeneis precHügel. </li><li> Verwenden Sie einen Wurm holen, um einzelne Nematoden zu einem Wassertropfen auf einem NGM Platte übertragen, um sie von Bakterien zu befreien. Nematode (n) sollte gut zugeführt, um die Autofluoreszenz zu verringern, wenn möglich. Wiederholen Übertragung auf neue Spots von Wasser wie nötig, bis Wurm (n) frei von Bakterien. </li><li> Beschriften mattierte Seite der &quot;Boden&quot; Polylysin-Objektträger mit wasserfester Tinte und Objektträger auf Zähler nächsten Behälter mit Trockeneis Etikett nach oben. Eine gleiche Anzahl von weniger haft &quot;oben&quot; (unbehandelt) Folien zur Verfügung. </li><li> Platzieren 5-10 &amp;mgr; l-Tropfen Wasser auf den Bereich der Bodenträger mit Polylysin doppelt behandelt. Verwenden Sie die größere Lautstärke, wenn die Übertragung mehr Würmer, um das Wasser zu verdunsten vor Fertigstellung zu verhindern. </li><li> Übertragen Sie die Schnecke (s) an die Wassertropfen mit dem Wurm-Pick, mit dem Mikroskop zu beobachten, wie die Würmer sinken, um die klebrige Gleitfläche berühren. Übertragen so wenig wie ein Wurm, so viele wie 20 + Würmer pro Tropfen. </li><li> Halten Sie den Boden slide in einer Hand und legen Sie den Oberschlitten über den Boden gleiten, so dass alle, aber die Vereiste Bereiche überlappen. </li><li> Sofort und vorsichtig (ohne zu rutschen oder Kompression) setzen die Folien auf dem Stück Metall auf Trockeneis. Halten Sie auf Trockeneis für 5-30 min. (Diese Folien lagern langfristig, da die Folien leicht austrocknen.) </li><li> Gehen bis 3 (Fixierung) Schritt. </li></ol> 3. Fixierung Fixierungsmittel sind notwendig, um &quot;fix&quot; das Antigen an Ort und Stelle in der Zelle, entweder durch Ausfällen (&quot;light-Fixierung&quot;) oder Vernetzung (&quot;harte Fixierung&quot;) das Antigen. Die Fixierung kann Antigenität stören, die meisten bekannten Antikörper funktionieren am besten mit einer bestimmten Fixierung Zustand. Für neue Antikörper, sollte ein Bereich der Fixierung Bedingungen getestet werden. Für jede Fixierung, ist der erste Schritt, um Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung herzustellen. Weiter fix Folien mit Nematoden zur Antikörperfärbung nach Methode A (Lichtfix mit Methanol und Aceton) oder B (härter fix mit Formaldehyd oder Glutaraldehyd). <ol><li> Bereiten Sie eine sterile 10x PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) Stammlösung durch Zugabe von 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 27,2 g Na 2 HPO 4 • H 2 0, 2,4 g KH 2 PO 4, 20 ml 10% Natriumazid Lager. Um diese Stammlösung zu machen, wiegen Natriumazid Pulver zu 10% ige Lösung in doppelt destilliertem Wasser zu machen. Rühren Sie mit Kochsalzlösung sanfte Wärme bis gelöst. ACHTUNG: trocken Natriumazid ist reaktiv und alle Formen sind giftig. Tragen Maske und Handschuhe bei der Arbeit mit trockenen Natriumazid oder Lösungen. </li><li> Lassen Salz cool (Tris pH temperaturempfindlich ist), dann pH-Wert auf 7,2 mit 1-10 M NaOH. Top auf 1 L mit doppelt destilliertem Wasser und Autoklaven zu sterilisieren. Lagerung bei Raumtemperatur und verdünnt auf 1x als mit sterilem doppelt destilliertem Wasser benötigt. ACHTUNG: NaOH ist ätzend - Handschuhe während der Anwendung zu tragen. </li></ol> 3A. Licht fix mit Methanol-Aceton- <ol><li> Setz 100% Methanol, 100% Aceton und 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in Küvetten auf Eis für mindestens 10 min Vorkühlung. ACHTUNG: Methanol und Aceton sind giftig, Handschuhe. </li><li> Nehmen Sie ein Paar von unteren und oberen Dias aus dem Trockeneis, schnell verdrehen sie auseinander, und sofort tauchen die &quot;unten&quot; slide in eiskaltem Methanol für 2 min. Die &quot;Top&quot;-Rutsche können verworfen werden. </li><li> Objektträger aus Methanol kaltem Aceton für 4 min Eis. Wenn die Folien hatte viele Würmer, die meisten (90%) wird in dem Update fallen, auch mit den am besten vorbereiteten Folien. Wenn einzigen Wurm Träger wurden richtig vorbereitet, sollten die Würmer eingehalten bleiben. </li><li> Zeigen oder tauchen Sie die Folien in das Glas mit PBS (abzuspülen Fixiermittel) und fahren bis 4 (Färbung) Schritt. </li></ol> 3B. Fest fix unter Verwendung von Formaldehyd oder Glutaraldehyd <ol><li> Verdünnen Reagenzqualität Formaldehyd oder Glutaraldehyd-Lösung in 1x PBS auf 0,5-4% Endkonzentration. Aliquots (1,5 ml) may gespeichert dicht bei -20 bis -30 ° C begrenzt werden; auftauen Aliquots auf Eis kurz vor der Verwendung. HINWEIS: Formaldehyd-Lösungen mit der Zeit abgebaut und an der Luft. ACHTUNG: Formaldehyd und Glutaraldehyd sind giftig, Handschuhe und arbeiten in der Kapuze. </li><li> Nehmen Sie ein Paar von unteren und oberen Dias aus dem Trockeneis, schnell verdrehen sie auseinander, und sofort legen Sie die &quot;unten&quot; slide mit Würmern in der flachen Schale mit Deckel. (Der Oberschlitten kann verworfen werden). </li><li> Unmittelbar pipettieren 200 ul giftig Fixiermittel über der Mitte der Fläche des Objektträgers mit Würmern. Das Fixiermittel wird teilweise an Ort und Stelle einzufrieren, dann schmelzen, um einen größeren Bereich der Folie abzudecken. </li><li> Wenn die Würmer nicht völlig mit Fixiermittel bedeckt, sofort und vorsichtig mehr Fixiermittel mit einer Mikropipette. Nicht Fixiermittel über den Rand der Folie fließen. </li><li> Decken Sie die Schüssel mit einem Deckel und lassen für 10 min bis über Nacht bei Raumtemperatur. Seien Sie sicher, dass das Gericht wird befeuchtet, wenn längere Inkubationen are verwendet - dies kann durch Zugabe von gefalteten feuchten, fusselfreien Tüchern in die Schale durchgeführt werden. Lassen Sie sich nicht die Tücher berühren Sie die Folien. </li><li> Nach der vollständigen Fixierung vorsichtig pipettieren Fixiermittel mit losen Würmer in ein 1,5-ml-Röhrchen und tauchen Sie die Folie in eine Küvette mit PBS. </li><li> Drehen Sie das Rohr mit Würmern, die locker für 30 Sekunden kam mit hoher Geschwindigkeit zu pelletieren. Zweimal mit PBS spülen Würmer, verarbeitet dann parallel zu den Schnecken auf den Folien (tut Schritte Mikrozentrifugenröhrchen statt auf Folien). </li><li> Gehen bis 4 (Färbung) Schritt. </li></ol> 4. Antikörperfärbung Die Antikörperfärbung Protokoll ist ähnlich wie Standard-Protokolle für jedes Gewebe auf Folien. Dieses Protokoll ist für alle Folien, unabhängig von der Herstellung in den Schritten 1-3. <ol><li> Antikörper herzustellen Puffer durch Mischen 700 ml doppelt destilliertem Wasser, 100 ml 10-fach PBS, 5 ml Triton X-100 (0,5% Endkonzentration), 2 ml 0,5 M EDTA pH 8 (1 mM final), 1 g BSA (0,1% Endkonzentration), 5 ml 10% iger azide-Lösung (0,05% endg.). pH-Wert auf 7,2 mit HCl, fügen Sie dann doppelt destilliertem Wasser auf 1 L; lagern bei 4 ° C </li><li> Bereiten Blockieren durch Rekonstitution Esel-Serum mit doppelt destilliertem Wasser, dann Zugabe von 5 ml Serum 45 ml Antikörperpuffer (final 10% Serum). </li><li> Bereiten Sie Primär-und Sekundärantikörperlösungen durch Verdünnen Antikörper in Antikörperpuffer plus 1% BSA. Empfohlene Verdünnungen 1:50-1:2,000 für Primärantikörper und 1:1,000-1:5,000 für Sekundärantikörper (Cy3or OG488 konjugierte Antikörper gegen Esel verwendet, um primäre Antikörper erhöhen Arten). </li><li> Bereiten DAPI Lager durch Mischen von 2,5 mg / ml in doppelt destilliertem Wasser; Store in 8 ul Aliquots bei -30 ° C eingefroren ACHTUNG: DAPI ist ein giftiges DNA-bindenden Farbstoff, Handschuhe, während Einwaage aliquotiert. </li><li> Vorbereitung 10 ml Mounting Medium durch Mischen von 200 mg n-Propylgallat, 0,3 ml 1 M Tris, pH 9, 2,7 ml doppelt destilliertem Wasser in einem 15 ml konischen Röhrchen. Hitze bei 65 ° C für etwa 10 min bis gelöst.In 7 ml Glycerin und eine 8 ul Aliquot von DAPI und Wirbel auch. Aliquot Medium in 1,5-ml-Röhrchen, in Folie wickeln und nur im Dunkeln bei 4 ° C (sowohl Luft und Licht verschlechtern die Mittel - wenn es mehr gelb, verwerfen in Biohazard Abfall). ACHTUNG: n-Propylgallat ist eine reaktive Anti-Oxidationsmittel, Handschuhe beim Wiegen. </li><li> Übertragen Objektträger in eine Küvette mit Sperren für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C (bevorzugt über Nacht hart fix). Vermeiden Sie Schütteln, um zu verlieren, Würmer zu vermeiden. </li><li> Objektträger auf Glas mit primären Antikörper oder Objektträger flach in einer Schüssel und befeuchtet oben mit jeweils 100-500 ul primären Antikörper-Färbung. Dias über Nacht bei 4 ° C ohne Schütteln inkubiert. </li><li> Nach der primären Antikörper-Inkubation, Transfer gleitet, um Glas PBS Färbung. </li><li> Filterblock durch den Trichter mit Filterpapier und bei 4 ° C gefüttert, und wenn steril filtriert alle 1-2 Wochen, können Sperren für 1 oder mehrere Monate wiederverwendet werden. Ebenso filtern und speichernprimären Antikörper bei 4 ° C für die Wiederverwendung (bis zu 10 oder mehr Runden der Färbung). </li><li> Rinse gleitet dreimal (~ 20 min jeweils) in Antikörperpuffer. </li><li> Die Objektträger in sekundäre Antikörper in einem lichtdichten Behälter Färbung und Inkubation 4 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Objektträger auf Glas PBS Färbung. Filter und sparen sekundären Antikörper bei 4 ° C für die Wiederverwendung (für bis zu 10 oder mehr Runden-Färbung). </li><li> Rinse gleitet dreimal (~ 20 min jeweils) in Antikörperpuffer. </li><li> Objektträger zu PBS und lassen in PBS (Minuten bis über Nacht bei 4 ° C) bis bereit zu montieren. </li><li> Arbeiten Sie schnell auf einzelne Folien, so dass die Würmer auf der Vorderseite der Folie bleiben nass. Einen Objektträger aus dem PBS, trocknen Rückseite der Folie mit einem fusselfreien abwischen, und auf Küchenpapier. </li><li> Platz ~ 20 ul Montagemedium über Würmer, so dass es zu etwa gleichen Teilen Mittel-und PBS auf Schiebe-Kipp-Schiebe sanft auf die beiden Lösungen mischen. CAUTION: Montage Medium ist giftig. </li><li> Kippschiebers so Mattrand ist niedriger und Lösung sammelt in der Nähe von Zuckerguss, dann legen Sie einen Rand von 24 x 60 mm Deckglas auf Lösung. </li><li> Senken Sie die Deckglas, um Luftblasen (die Bleich erhöhen und stören Leser) zu minimieren. Wenn sich Blasen bilden, heben Sie den Rand des Deckglases langsam, dann relower ohne Verschieben des Deckglases über die Würmer. </li><li> Die Kante der Folie vorsichtig trocknen, ohne den Deckglas, durch Zusammendrücken der Kanten mit einem fusselfreien zu wischen. Der relativ trockene Kante der Folien müssen rund um den Rand des Deckglases sichtbar </li><li> Deckglas mit 2-3 Schichten Nagellack. Dias können in einem flachen Trägerhalter bei Herstellung und Lagerung vor Licht zu schützen platziert werden. Sobald Schlitten gut verschlossen und trocken, reinigen Sie die Deckglas-und Rückseite der Folie. </li><li> Gut verschlossenen Folien können im Dunkeln Tage bei 4 ° C oder Wochen bei -20 ° C gehalten werden, Über längere Zeiträume, DAPI staining von DNA und die meisten grünen Farbstoffe (z. B. 488 nm Anregung) verblassen. Verschließen Sie das Deckglas mit Nagellack nach Bedarf, z. B. nach Verwendung eines Ölimmersionsobjektiv. </li></ol>

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Der Autor erklärt, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Das gefrierCrack Protokoll ist eines von mehreren Verfahren zur Antikörperfärbung in C. elegans. Es bietet eine relativ einfache Möglichkeit, Würmer Fleck, erfordert aber spezifische Reagenzien und Praxis für optimale Ergebnisse. Kritische Schritte (in Abbildung 1 dargestellt) umfassen: 1) Bei Objektträgervorbereitung (siehe Schritte 1 und 2) manuelle Kompression der Nematoden (siehe Schritte 2 und 3) schnelle Fixierung (siehe Schritt 3). Erstens, um die Haftung der Nematoden auf die Obje...

Um die zellulären und subzellulären Lokalisation von Proteinen zu bestimmen, haben Wissenschaftler traditionell mit Antikörpern ausgewählt, um bestimmte Proteine ​​spezifisch erkennen, ein markierter Gewebe. In einigen Modellorganismen wie C. elegans, Antikörperfärbung wurde oft durch molekulargenetische Techniken, die Ergebnisse schneller erzielen ersetzt. Diese umfassen die Umwandlung Organismen mit Konstrukten aus Genfusionen zwischen dem Promotor und der codierenden Regionen des Gens von Interesse und das grün fluoreszierende Protein. Jedoch unterliegen einer Anzahl von Artefakten, einschließlich der Probleme mit Kenntnis der wahren Promotor und Veränderungen in der Expression von Konstrukten mit hoher Kopienzahl (die üblichen Techniken in C. elegans) 2,3 molekularen Techniken. Daher Färbung mit Antikörpern bleibt ein Ziel für viele Wissenschaftler, die Proteinfunktion in vivo. Anfärben mit Antikörpern Gewebe kann schwierig sein, da eineAntikörpern kann nur ihre Antigen in einer bestimmten Konformation 1 zu erkennen. Zum Beispiel können Antikörper nur denaturiert oder intakten Antigen fixiert in einer bestimmten Weise zu erkennen und nicht das Antigen in situ zu erkennen. Das Problem der Antikörperfärbung in Nematoden wird durch die Tatsache, dass die Kutikula der Nematoden bildet eine relativ undurchlässige Barriere, die Blockierung des Zugangs von Antikörpern gegen Gewebe verstärkt. Es gibt mehrere verschiedene Methoden für die Antikörper-Färbung verwendet in C. (4 in unserer bisherigen Arbeit überprüft) elegans. Um intakte Fleck &quot;Würmer&quot;, wurden Methoden entwickelt, zu frieren und tauen in einem relativ harten Fixiermittel (Formaldehyd oder Glutaraldehyd), die Frost-Tau-Zyklen helfen, die Nagelhaut zu knacken, um eine schnelle Durchdringung der Fixiermittel 5 zu ermöglichen. Nach der Fixierung wurde die Kutikula permeabilisiert, um das Eindringen der Antikörper zu ermöglichen; Methoden enthalten eine Behandlung mit Reduktionsmitteln, Collagenase oder beides 5-7. Diese Treatments Morphologie erhalten, aber oft reduziert oder zerstört Antikörpererkennung. Alternative Methoden sind Dissektion 8 bis Antikörper Eindringen zu ermöglichen. &quot;Freeze-Cracking&quot; ist eine Möglichkeit, den Zugang zum Inneren des Halb intakt Wurm gewinnen, damit Antikörperfärbung 9-10. Gefrier Cracken kann mit einer Vielzahl von Befestigungs Bedingungen durchgeführt werden, während die Vermeidung Kollagenase-und Reduktionsbehandlungen. Die Nematoden sind zwischen zwei Folien gelegt Klebstoffe, gefroren, und dann werden die Folien voneinander getrennt sind, so dass die meisten der Nematode auf der Bodenschieber und viel von der Kutikula auf der oberen Folie. Die untere Folie kann in Fixiermittel gelegt und die gesamte Folie mit haft Nematoden durch den Antikörper Färbeverfahren übertragen. Die Methode hat derzeit zwei große Schwierigkeiten. Erstens ist es schwierig, die richtige Menge von Druck notwendig, um die Nematoden, ohne ernsthaft zu verformen aufgeteilt anzuwenden. Zweitens sind viele der Würmer wird nicht sTick ​​zu jeder Folie, und werden in der Fixiermittel oder Spülungen verloren. Doch mit den richtigen Folien und Praxis wird das Verfahren rasch ergeben Nematoden mit vernünftigen Morphologie, die mit einer Vielzahl von Fixiermittel und Antikörpern verwendet werden kann. Das Verfahren kann leicht in Abhängigkeit von dem Ziel der Experimentator variiert werden. Wenn Färbung der einzelnen Nematoden erwünscht ist (z. B. um zu bestimmen, ob eine einzelne Transformante wurde Antikörperfärbung verändert), gleitet dann mit maximaler Haftung (aber höhere Hintergrundfärbung) verwendet werden können, wie Labor hergestellte Folien mit zusätzlichen Polylysin (siehe unten). Für Formaldehyd oder Glutaraldehyd-Fixierung, sollte höher Adhäsions-Objektträger (Labor vorbereitet Polylysin Dias) verwendet werden, da Nematoden mehr haften schlecht auf Polylysin nach diesen Fixierungen. Wenn Wildtyp-Nematoden werden mit Methanol und / oder Aceton fixiert, gleitet dann mit geringerer Haftung und geringer Hintergrundfärbung verwendet werden sollte (kommerziell oder labor vorbereiteten Folien). Wenn eine Vielzahl von Antikörpern und Fixiermittel werden im Labor verwendet werden, kann eine Auswahl von Folien voraus hergestellt und gelagert, bis sie benötigt werden. Nach dem Zugriff auf die Nematoden-Gewebe wurde gewonnen, Antikörperfärbung Verfahren folgen Standardverfahren (mit längeren Inkubationszeiten Merkmal von Geweben statt Zellen 1,11).

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine slide (ESCO brand)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-545-78</td>
			<td>Sigma brand slides also suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1524</td>
			<td>IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>single frosted edge slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>48312-002</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>coplin staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47751-792</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5-slide mailer</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>71549-01</td>
			<td>One of many different brands of small slide holder, suitable for staining</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MK262159</td>
			<td>IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25% in water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G 5882</td>
			<td>IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-9410</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN820451</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Serum, lyophilized</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td>This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody). </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>n-propyl gallate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN10274750</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI, 4',6'-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 9542</td>
			<td>TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Whatman #1 15 cm diameter filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09805G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-252</td>
			<td>#1 1/2 thickness is optically best</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope slide folder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48429-092</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

antibody staining in c. elegans using &quot;freeze-cracking&quot;

Um C. Fleck elegans mit Antikörpern müssen die relativ undurchlässig Kutikula durch chemische oder mechanische Verfahren umgangen werden. &quot;Freeze-Cracking&quot; ist eine Methode verwendet, um körperlich ziehen Sie die Nagelhaut von Nematoden durch Komprimieren Nematoden zwischen zwei haftenden Folien, Einfrieren, und ziehen Sie die Folien auseinander. Gefrier Cracken liefert eine einfache und schnelle Möglichkeit, den Zugang zu den Geweben ohne chemische Behandlung erhalten und kann mit einer Vielzahl von Fixiermitteln verwendet werden. Sie führt aber zum Verlust von vielen der Proben und die erforderliche Kompression der Probe mechanisch verformt. Praxis ist erforderlich, um Rückgewinnung der Proben mit guter Morphologie zu maximieren. Gefrier Cracken kann für bestimmte Fixierbedingungen, Rückgewinnung der Proben oder niedrige nicht-spezifische Färbung optimiert werden, aber nicht für alle Parameter auf einmal. Für Antikörper, die sehr schwer Fixierung Bedingungen erfordern und tolerieren die chemischen Behandlungen erforderlich, um chemisch permeabilisieren die Nagelhaut, treatment intakter Nematoden in Lösung bevorzugt werden. Wenn der Antikörper erfordert eine leichtere Lösung oder, wenn die optimale Fixierung Bedingungen bekannt sind, bietet gefrier Cracken eine sehr nützliche Methode, um schnell zu testen, die den Antikörper und spezifische subzelluläre und zelluläre Lokalisation Information für das Antigen von Interesse zu ergeben.

Wenn Würmer richtig komprimiert, rissig, und leicht fixiert ist, kann nahezu die gesamte Schnecken zugänglich Antikörper-Färbung (siehe Abbildung 2). Die Lage der Kerne durch DAPI-Färbung angezeigt anzeigt, welche Teile der Schnecke sind intakt, wenn die Würmer zu einem härteren Fixiermittel wie Formaldehyd ausgesetzt wird, kann sich die Morphologie der Schnecke verzerrt werden (wie durch die unnatürlich wellige Aussehen der gesehen Muskeln in den Fig. 3A-D). Ein weiteres häufi...

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Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

&quot;Freeze-Cracking&quot;, ein Verfahren zur Freilegung der inneren Gewebe des Nematoden C. elegans, um Antikörper für die Proteinlokalisierung, wird demonstriert.

Antikörperfärbung in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Mit der &quot;Freeze--Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

antibody-staining-in-c-elegans-using-freeze-cracking

Research

JoVE Journal

Biology

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

22.5K Aufrufe.  Ohio University.  "Freeze-Cracking", ein Verfahren zur Freilegung der inneren Gewebe des Nematoden C. elegans, um Antikörper für die Proteinlokalisierung, wird demonstriert. 

Serie: Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Forschung

Biologie

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Verfahren zur Whole Mount Antikörper-Färbung in Küken

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imaging C. elegans Embryos mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop und Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Bestimmung genetischer Expressionsprofile in C. elegans Verwenden Microarray-und Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Chemotaxis-Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Ein Anoxia-Hunger-Modell für Ischämie / Reperfusion in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Methoden zur subzellulärer Kompartimente der Muskel in Beurteilen<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Tracking und Quantifizierung von Entwicklungsprozessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Verwendung von Open-Source-Werkzeuge

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

Messung physiologischer Stressreaktionen in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...