Wir wollen den Geist der Zusammenarbeit aller Caldwell Lab Mitglieder anzuerkennen. Bewegungsstörungen Forschung im Labor wurde von der Bachmann-Strauss Dystonie &amp; Parkinson Foundation, Vereinigte Parkinson Foundation, American Parkinson Disease Association, Parkinson Disease Association of Alabama, die Michael J. Fox Foundation for Parkinson Research, und ein Undergraduate Research unterstützt.

Expressionsplasmid Construction Zwei Plasmide sind erforderlich: eine für Gewebe-spezifische Expression des Gens von Interesse und eine zweite als wählbare Transformation Marker. Experimentelle Plasmid <ol><li> Wählen Sie einen Promotor, der in dem Gewebe / Zelltyp von Interesse, zum Beispiel, einen Nerv oder Muskel-spezifischen Promotors exprimiert wird. Wenn man mehrere Gene im gleichen Gewebe auszudrücken ist, kann ein Promotorkassette Plasmid in das Gateway-System (Invitrogen) verwendet werden. Dieser Ansatz ermöglicht die Einfügung von jedem Gen von Interesse stromabwärts des Promotors durch recombinational Klonen 4. Generell ist 2-5 kb Upstream-Sequenzen aus, um korrekte und genaue Ausdruck haben. </li><li> Die cDNA des Gens von Interesse kann auf zwei Arten geklont werden: <ol><li> Konventionelle Klonen mit Hilfe von Restriktionsenzymen. </li><li> Für Gateway-Klonen ist es PCR mit den Primern, dass das Gateway att B recombinational Sequenz enthalten. Die amplifizierte cDNA wird zunächst in der Donor-Vektor pDONR201 um den Eintrag zu erstellen Vektor rekombiniert und dann in E. coli-Stamm DH5a. Nach der Auswahl von erfolgreichen Rekombinanten und mini-prep Isolierung von DNA, wird der Eintrag Vektor in die Promotor-Destination-Vektor zu erstellen Expressionsplasmid rekombiniert. Details zu recombinational Klonen sind entweder von der Invitrogen Gateway-Handbuch oder in Caldwell et al Verfügung. 5. </li></ol></li></ol> Selektionsmarker Plasmid Als Beispiele transgener Marker Plasmide umfassen rol-6 oder Gebrauch des Körpers Wand Muskel Promoter unc-54 um fluoreszierende Protein-Expression zu fahren. Diese Marker Plasmide sind in der Regel innerhalb der Forschergemeinde auf Anfrage zur Verfügung. Mikroinjektion von C. elegans Vorbereitung <ol><li> Führen DNA-Isolierung der beiden Plasmide, die injiziert werden sollen. Quantifizieren sie und mischen im Verhältnis 1:1 von 50 ng / ul jeder. </li><li> Bereiten Sie Agar-Pads: <ol><li> Machen Sie einen 2% igen Lösung in Wasser, Wärme oder in der Mikrowelle bis zur Lösung. </li><li> Set aus mehreren 22 x 50 mm Deckgläser auf einem Labortisch. </li><li> Mit einer Pasteurpipette einen Tropfen des geschmolzenen Agarose auf einem Deckglas und sofort Platz ein zweites Deckglas über die Tropfen in einem 90-Winkel zur ersten. Wiederholen Sie dies für einige andere Deckgläser. Der Durchmesser des abgeflachten Scheibe aus Agarose sollte zwischen 15-20 mm sein. </li><li> Nach Erstarren der Agarose (dies dauert nur Momente), entfernen Sie die Abdeckung aus Glas und lassen Sie das Pad an der Luft trocknen komplett (mehrere Stunden bis über Nacht). </li><li> Bewahren Sie die Pads in einem Deckglas Feld bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Machen Nadel Lader für DNA-Lösung: Needle Lader sind aus 100 ul Kapillaren, die in der Mitte über einer offenen Flamme erhitzt und schnell auf etwa das Doppelte ihrer Länge gezogen geschaffen. Die beiden Hälften sind getrennt, sobald die Kapillare kühlt aufgeschnappt. Stockpile 10-20 Nadel Lader zur Injektion. Aufrecht lagern in einem Mikrozentrifugenröhrchen Rack. Seien Sie vorsichtig, um nicht aufspießen sich auf die Punkte. </li><li> Machen Mikroinjektion Nadeln: Die Nadel ist aus einem speziellen Kapillarröhrchen, dass eine interne Glasfilament enthält gemacht, das Filament dient als Docht für die DNA-Lösung. Diese basieren auf einer Nadel-Abzieher Maschine gezogen. Wir verwenden eine Narishige PP-830 Abzieher mit einer Heizstufe von 24,8. Mehrere Nadeln sind in einer Zeit gezogen und in einem kleinen Plastik-Box gespeichert. Mehrere Nadeln können leicht &quot;gemountet&quot; werden auf einem Streifen Knetmasse für eine langfristige Lagerung. </li><li> Nadelspitze &quot;Brandung&quot;: Die Spitze des Mikroinjektionsnadel gezogen wird so fein, dass es tatsächlich daran geschlossenen Ende und sollte aufgebrochen werden mit kleinen Scherben Deckglas. Diese werden durch das Einwickeln eines 18 x 18 mm Deckglas in ein Papiertuch und sanft Druck, bis es in mehrere Teile zerbricht vorbereitet. Scherben eines nützliche Größe ca. 3 x 4 mm. </li><li> Wachsen Wildtyp (N2) Würmer bis in die frühen Erwachsenen-Stadium für die Injektion mit Standard-Verfahren 6. Bereiten Sie etwa 100 richtig inszeniert Würmer / Konstrukt injiziert. </li></ol> Verfahren <ol><li> Öffnen Sie das Ventil auf ein Helium-Tank, die zu einem Mikroinjektionsnadel Arm und Halter verbunden ist. Schließen Sie das Regelventil, damit das Gas in die Zeile eingeben, wodurch der Druck auf 35 psi. Beachten Sie, dass das freigesetzte Gas kann mit einem Fußpedal werden. </li><li> Legen Sie eine Nadel-Loader in einen Standard-Mund Pipette Schlauch (gefunden in Behältnissen aus Glas Kapillaren) und stellt eine kleine Menge der Plasmid-Mischung (~ 1 ul). </li><li> Die Nadel-Loader wird vorsichtig in das hintere Ende einer Injektionsnadel gesetzt und sanft eingesetzt ganzen Weg durch die Länge derdie Nadel bis Widerstand zu spüren. Vertreibt die DNA-Lösung durch leichtes Blasen, entfernen Sie dann mit dem Kran. </li><li> Legen Sie die Nadel in den Arm Mikroinjektion, wobei darauf geachtet, um es im kleinen internen Gummidichtung Platz. </li><li> Legen Sie eine Nadel-breaking Splitter Deckglas an einer Kante einer Agar-Pad. Bedecken Sie den Splitter, sowie die gesamte Oberfläche des Agar-Pad, mit Halocarbonöl. Legen Sie die Agar-Pad auf der Stufe eines inversen Mikroskops. </li><li> Position der Nadel in der Mitte des Gesichtsfeldes mit dem 4X objektive und Hellfeldbeleuchtung, aber noch nicht unten in das Öl. Auch, stellen Sie den inneren Rand der Scherbe Deckglas in der Mitte, dann auf ihn zu konzentrieren (immer noch mit 4X Ziel). Senken Sie die Nadel in das Öl, womit sie in der gleichen Bildebene als Splitter Deckglas. Erhöhen Sie die Vergrößerung durch die Umstellung auf den 40X-Objektiv. Neuausrichtung auf den Rand der Scherbe und Neupositionierung der Spitze der Nadel, wenn nötig. </li><li> Zum Öffnen der Spitze der Injektionsnadel, sanft anstoßen die Nadel gegen die Kante der Abdeckung Glasscherbe, während zur gleichen Zeit die Anwendung einen kurzen Impuls von Gas über das Fußpedal. Die Nadel wird ausreichend gebrochen werden geöffnet, wenn kleine Tröpfchen von Flüssigkeit austreten Ende der Nadel. Überschüssige Flüssigkeit fließen durch eine zu große Öffnung ist nicht wünschenswert, da es die Tiere zu töten. </li><li> Entfernen Sie die Agar-Pad von der Bühne durch eine Erhöhung der Nadel nach oben, aber keine Änderung der X-oder Y-Achsen-Position. Schieben Sie die Bühne nicht unterhalb der Nadel, entfernen Sie die Agar-Pad und platzieren es auf einem Binokular. Transfer ein Wurm auf dem Pad, unter der Oberfläche des Öls. Wenn der Wurm schlängelt sich sanft streicheln, bis sie die Agar-Pad. Die feuchte Wurm sollte auf die trockene Agarose halten. </li><li> Injektion <ol><li> Raschen Platzierung der Agar-Pad zurück auf die Bühne, Zentrierung der Wurm in das Blickfeld. </li><li> Senken Sie die Nadel in der gleichen Ebene des Fokus wie der Wurm. </li><li> Schalten Sie den Filter auf Hoffman Illumination (eine Art von Gegensatz Filter). Dies ermöglicht morphologische Details des Wurms sichtbar werden. Wenn Nomarski / DIC-Optik sind auf den invertierten Bereich, der so gut funktionieren wird. Mit dem 40X-Objektiv, über die &quot;körnige&quot; Syncytial Zentrum der Wurm Gonade, unterhalb der &quot;Wabe&quot;-Muster des Keims Kerne (wählen Sie je nachdem, was Gonade befindet sich auf der Seite der Wurm vor der Nadel positioniert) zu konzentrieren. </li><li> Feinabstimmung der Position der Nadel, bis die Spitze auch im Fokus (der gleichen Ebene wie die Gonade &quot;Körnigkeit&quot;). </li><li> Schieben Sie die Nadel in der Mitte der Gonade und wenden Sie einen kurzen Puls der Gasdruck auf einen Tropfen oder zwei von DNA in die Gonaden Arm zu vertreiben. Sie sollten eine Welle der Flüssigkeit verteilt über den distalen Gonaden zu beobachten. Gehen Sie nicht davon mehr flüssig ist besser, da zu viel Flüssigkeit in den proximalen Kurve der Gonade Arm, der heruntergefahren werden Eizelle Produktion fließen kann. Wenn möglich, abhängig von der Position des Wurms, spritzen sie den anderen Gonade Arm in der gleichen Weise. </li><li> Es ist wichtig, schnell zu arbeiten während der Injektion ein Wurm, da sie leicht austrocknen. Die Entscheidung für die zweite Gonade Arm spritzen ist abhängig, wie schnell man wieder Position der Nadel und Wurm. Der gesamte Prozess sollte idealerweise weniger als 1-2 Minuten. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Abdeckung aus Glas von der Bühne und legen Sie es auf einem Binokular. Bewerben 1μl der M9-Puffer (22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 85mm NaCl, 1 mM MgSO 4) direkt auf das injizierte Wurm (dies könnte zur Folge Eintauchen der Pipettenspitze unter der Oberfläche des Halocarbonöl). Der Puffer sollte rehydrieren der Wurm, es wird dann float aus dem Agarose-Pad-Oberfläche. Übertragung der Wurm zu einer regelmäßigen Platte mit einem Wurm zu pflücken. Die Agarose-Pad kann mehrere Male wiederverwendet werden, bis es geworden ist, zu gesättigt mit Puffer und die Würmer nicht mehr zu halten. </li></ol> Transgene Auswahl <ol><li> Injected Würmer, die P 0 Generation, sind auf die individuellen frisch, bakteriell ausgesät Platten (60 mm) überführt und zu reproduzieren. Typischerweise sind injizierten Tieren bei 20 ° C für 2-3 Tage inkubiert, bis die Nachkommen erscheinen. </li><li> Die F 1 Nachkommen sind zum Nachweis der transgenen Marker (z. B. Fluoreszenz) mit Hilfe eines Fluoreszenz-Stereomikroskop beobachtet. Jeder fluoreszierend, Träger F 1, ist Tier einzeln auf eine neue Platte geklont (seit Nachkommen von jedem F 1 eine klare Linie berücksichtigt werden). Die F 1 Hermaphroditen sind erlaubt sich zu vermehren. Auch dies ist in der Regel bei 20 ° C für 2-3 Tage durchgeführt, bis die Nachkommen erscheinen. </li><li> Die F 2-Generation ist für transgene Tiere sowie beobachtet. F 2 Tiere, die geerbt haben und drücken die transgenen Array werden als &quot;stable&quot;-Zeile. HINWEIS: Bei der F 1 stAlter kann es viele transgene Tiere, aber sie sind nicht stabil. Die Mehrzahl der F 1 transgenen Tieren nicht in F 2 stabile Linien vermehrt werden. HINWEIS: Für die Steuerung für die Variabilität in der Genkopienzahl, erzeugen ein Minimum von drei unabhängigen stabilen Linien pro Konstrukt injiziert. </li><li> Jeder unabhängige stabile Linie sollte in einer separaten Zeile der Würmer gehalten werden. Jede Zeile kann durch die Übertragung von mehreren transgenen Tieren, um eine neue Platte bei jeder Generation weitergegeben werden, dies muss mit Hilfe eines fluoreszierenden Stereomikroskop werden, wenn der Selektionsmarker ist fluoreszierend. </li></ol>

<ol>
	<li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans.">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+requirements+for+somatic+and+germline+expression+of+a+generally+expressed+Caenorhabditis+elegans+gene.">Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene.</a> Genetics. 146, 227-238 (1997).</li><li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans.">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li><li>Caldwell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li></ol>

Wenn Sie dieses Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, um: - Einfügen direkt in das Zentrum der Gonade - Nicht spritzen zu viel Flüssigkeit - Schnell zu arbeiten, um Austrocknung zu verhindern. Wenn Sie Probleme mit der Nadel, wie es gebrochen ist zu groß ausgeführt wird, ist es am besten Remake eine frische Nadel, anstatt zu versuchen, mit einem weniger als ideal Nadel injiziert. Die Erzeugung von transgenen Würmer hat viele Anwendungen wie zum Beispiel: - Identifizierung von muti...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>Ultrapure</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Halocarbon Oil, Voltalef</td>
<td>Hulle 10S</td>
<td>elfatochem, France</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 18x18 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-548-A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 20x30 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-548-5A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 22x50 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-545-E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 ul Capillary</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>53432-921</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillary for Needles</td>
<td>"Kwik-Fil"</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>1B100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Puller</td>
<td>Tool</td>
<td>Narishige</td>
<td>Model PP-830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>microINJECTOR System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tritech Research</td>
<td>MINJ-1000</td>
<td>Scope, Stage, Manipulator</td>
</tr>
<tr>
<td>Dissecting, with Fluorescence</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ645</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

generation of stable transgenic c. elegans using microinjection

Transgene Caenorhabditis elegans leicht über Mikroinjektion eines DNA-Plasmid-Lösung in die Gonade 1 erstellt werden. Die Plasmid-DNA lagert sich extrachromosomale Konkatamere, die stabil vererbt werden, wenn auch nicht mit der gleichen Effizienz wie tatsächliche Chromosomen 2 zu bilden. Ein Gen von Interesse ist mit einer offensichtlichen phänotypischen Marker, wie rol-6 oder GFP co-injiziert, um die Auswahl von transgenen Tieren unter einem Binokular erlauben. Das exogene Gen kann aus seiner nativen Promotor für zelluläre Lokalisation Studien ausgedrückt werden. Alternativ kann das Transgen von einem anderen Gewebe-spezifischen Promotor, um die Rolle des Genprodukts in der jeweiligen Zelle oder eines Gewebes zu beurteilen gefahren werden. Diese Technik effizient Laufwerke Genexpression in allen Geweben von C. elegans mit Ausnahme der Keimbahn oder frühen Embryo 3. Erstellung von transgenen Tieren ist bekannt für eine Reihe von experimentellen Paradigmen genutzt. Dieses Video zeigt die Mikroinjektion Verfahren zur transgenen Würmern zu generieren. Darüber hinaus ist die Auswahl und Pflege von stabilen transgenen C. elegans Zeilen beschrieben.

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Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Dieses Video zeigt die Technik der Mikroinjektion in die Gonade von C. elegans, um transgene Tiere zu schaffen.

Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

generation-of-stable-transgenic-c-elegans-using-microinjection

Research

JoVE Journal

Biology

52.7K Aufrufe.  University of Alabama. Dieses Video zeigt die Technik der Mikroinjektion in die Gonade von C. elegans, um transgene Tiere zu schaffen.

Serie: Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Mikroinjektion von A. aegypti Embryonen, um transgene Moskitos erhalten

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Forschung

Biologie

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Erzeugung von transgenen C. elegans Nach Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imaging C. elegans Embryos mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop und Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Die Aktivierung der Apoptose durch cytoplasmatische Mikroinjektion von Cytochrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Bestimmung genetischer Expressionsprofile in C. elegans Verwenden Microarray-und Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Chemotaxis-Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Antikörperfärbung in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Mit der &quot;Freeze--Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Messung der Auswirkungen von Bakterien auf<em&gt; C. Elegans</em&gt; Verhalten Mit einem Ei Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Erzeugung transgener<em&gt; Hydra</em&gt; Durch Mikroinjektion Embryo

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Untersuchung der Verbreitung und Toxizität von Prion-ähnlichen Proteine ​​Mit dem Metazoan Modellorganismus<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Methods Article

Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion