Diese Methoden können verwendet werden, um Stressreaktionen in C.elegans zu charakterisieren und zu bestimmen, ob genetische oder pharmakologische Störungen die Aktivierung von schützenden zellulären Bahnen beeinflussen. Diese Methoden ermöglichen schnelle und hochdurchsatzige Tests von Hunderten von Störungen wie Genknockdown sowohl auf molekularer als auch auf physiologischer Ebene. Um sicherzustellen, dass der Test ordnungsgemäß durchgeführt wird, schließen Sie positive und negative Kontrollen ein.
Synchronisieren Sie gesunde, gut ernährte Tiere auf das richtige Stadium und verwenden Sie frische Platten für das Experiment. Die Visualisierung der Mikromanipulation der Würmer mit einem Pick kann neuen Benutzern helfen zu verstehen, wie die Würmer aufgereiht und auf ihre Lebensfähigkeit geprüft werden können. Die Verfahren werden Phil Frankino, Holly Gildea und Melissa Metcalf, Absolventen in unserem Labor, demonstrieren.
Um Tiere zu verwenden, die GFP unter dem Promotor des Hitzeschockproteins vier zur Aktivierung des endoplasmatischen Retikulums exemitzen, wachsen synchronisierte Reportertiere bei 20 Grad Celsius bis zur L4-Stufe und waschen Sie die Würmer mit M9-Medium von der Platte und übertragen sie in eine Röhre. Nach dem Sammeln der Würmer durch Zentrifugation, ersetzen Sie die M9 durch 25 Nanogramm pro Milliliter des Medikaments von Interesse in M9 oder Dimethylsulfoxid in M9 in den Kontrolltierröhren. Dann legen Sie die Würmer drei bis vier Stunden bei 20 Grad Celsius auf eine rotierende Plattform.
Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Würmer, um sich abzusetzen, bevor sie die Behandlungslösung allein durch 15 Milliliter M9 ersetzen. Nach zwei Wäehs, übertragen Sie die Tiere auf NGM-Platten oder NGM-RNA-Interferenzplatten und lassen Sie die Würmer über Nacht bei 20 Grad Celsius erholen. Wenn sich die Würmer erholt haben, fügen Sie fünf bis zehn Mikroliter 100 Millimolar-Natriumazid ohne Bakterien auf eine Standard-NGM-Platte und legen Sie eine Platte von Würmern unter ein Sezierenmikroskop.
10 bis 20 Tiere von der Platte in die Stelle von Natriumazid geben. Die Tiere sollten sich kurz nach der Landung in der Salzlösung bewegen. Sobald das Natriumazid verdampft ist, richten Sie die Tiere in der gewünschten bildgebenden Einrichtung mit den vorderen und hinteren Seiten in der gleichen Ausrichtung für alle Tiere aus und stellen Sie die Tierplatte sofort unter ein Stereomikroskop.
Starten Sie die Stereomikroskop-Bildgebungssoftware und klicken Sie unter der Registerkarte "Akquisitionen" auf Projekte und Ordner, um ein neues Projekt zu öffnen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie umbenennen aus, um den Ordner umzubenennen. Positionieren Sie die Schneckenprobe unter dem Mikroskopobjektiv und verwenden Sie die Brightfield-Einstellung, um den richtigen Brennpunkt der Würmer zu lokalisieren, um fluoreszierende Bleichmittel zu minimieren.
Das Zentrum der Probe wird der Punkt sein, an dem die Linie der Eier deutlich sichtbar und nicht unscharf ist. Legen Sie die Belichtungszeit fest, um sicherzustellen, dass Die Pixel nicht gesättigt sind, und stellen Sie auch sicher, dass das Signal über der Erkennungsgrenze liegt. Nachdem Sie Belichtungszeit, Zoom, Fokus und Brightfield-Kondensatoren auf die entsprechenden Einstellungen gesetzt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Bild aufnehmen, um ein Bild zu erhalten.
Legen Sie für die Bildgebung mit einem zusammengesetzten Weitfeldmikroskop die Basiskontroll-Behandlungsplatte auf die Zusammengesetzte Breitfeldmikroskopstufe und verwenden Sie das Touchpad, um das Steuerungsprogramm zu starten. Erstellen Sie ein neues Album und Dateiname und positionieren Sie die Platte unter der Objektivlinse. Verwenden Sie die Basissteuerung und die positiven Kontrollplatten, um die Belichtungszeit und die Fluoreszenzintensität so einzustellen, dass das Signal sichtbar, aber nicht gesättigt ist.
Speichern Sie dann Brightfield- und GFP FITC-Bilder. Um die Induktion des Reporters durch große Partikelflusszytometrie zu quantifizieren, schalten Sie zuerst die Zytometerlaser ein und öffnen Sie die Zytometer-Software. Klicken Sie auf Starten, um die Laser im Softwarefenster einzuschalten, und klicken Sie auf Ausführen, um den Laser im Popupfenster der Argonlasersteuerung zu initiieren.
Wenn der Laser rund 12 Milliwatt erreicht und der Lichtquellenpegel von 488 auf etwa 12 ansteigt, klicken Sie auf Fertig und überprüfen Sie die vier Druckwerte. Wenn die Werte denen ähneln, die im ursprünglichen Setup beobachtet wurden, aktivieren Sie das Feld Druck OK. Klicken Sie als Nächstes, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen oder Schmutz den Fluss von Mantel und Probe durch die Durchflusszelle blockieren, mehrmals auf "Reinigen".
Schalten Sie dann sort und auf Mantel, um den Fluss neu zu starten. Um die Durchflussrate zu überprüfen, sammeln Sie den Mantel für 60 Sekunden. Sammeln Sie den Mantel 60 Sekunden lang in ein 15-Milliliter-Rohr.
Der Durchfluss sollte neun bis 10 Milliliter pro Minute betragen. Um die Proben auszuführen, stellen Sie die Laser-Photomultiplierleistung auf einen Pegel ein, der so hoch ist, dass das Signal über der Erkennungsgrenze liegt, aber nicht höher als die Sättigungsgrenze. Führen Sie Größen-Gating durch, um Blasen, Trümmer, Eier und andere unerwünschte kleine Partikel auszuschließen und nur die Tiere einzubeziehen, die von Interesse sind, z. B. Erwachsene.
Wenn die Siebparameter festgelegt wurden, fügen Sie die vorbereiteten Würmer zu einer Tasse hinzu und klicken Sie auf Acquire. Achten Sie darauf, dass die gesamte Flüssigkeit nicht in die Maschine aufgenommen wird, da dies dazu führt, dass das Durchflusszytometer Luft einnimmt und Blasen im Detektor erzeugt. Wenn die Probe niedrig ist und/oder genügend Tiere gesammelt wurden, klicken Sie auf Stopp.
Um gated data nur basierend auf den Größenbeschränkungen zu speichern, klicken Sie auf Setup, Datenspeicherung, nur gated und Store Gated, um die Daten zu speichern. Dann spülen Sie den Sammelbecher mit entionisiertem Wasser und entfernen Sie die Wäsche durch Vakuum dreimal, bevor Sie die Analyse mit der nächsten Probe wiederholen. Um die mitochondriale und oxidative Spannungsempfindlichkeit zu messen, fügen Sie 50 bis 75 Mikroliter Paraquat in M9 bis acht bis 10 Brunnen pro Zustand einer flachen 96-Well-Platte hinzu und übertragen Sie acht bis zehn Würmer pro Zustand auf jeden Brunnen von Paraquat.
Tippen Sie alle zwei Stunden sanft auf die Platte, damit die lebenden Tiere stürzen oder sich biegen, um die Anzahl der toten Tiere pro Brunnen zu begleichen. Um die Temperaturempfindlichkeit der Tiere zu messen, bebrüten Sie die Würmer drei bis vier Tage bei 20 Grad Celsius, bevor Sie 10 bis 15 Tiere pro Platte pro Zustand für insgesamt vier bis sechs Platten plattieren. Legen Sie dann die Platten in einen 34 oder 37 Grad Celsius Inkubator und bewerten Sie das Wurmüberleben alle zwei Stunden, wie gerade gezeigt.
Der hsp-4-Reporter hat einen minimalen Basaleindruck in Abwesenheit von Stress, zeigt aber einen robusten GFP-Ausdruck, wenn die Tiere mit dem Medikament Tunicamycin endoplasmatischen Retikulumbelastungen ausgesetzt sind. Diese Unterschiede können auch mit einem großen Partikeldurchflusszytometer quantifiziert werden. Darüber hinaus kann die Induktion des Transgens unter endoplasmatischer Retikulumspannung durch Knockdown von XBP-1 über RNA-Interferenz vollständig unterdrückt werden.
Ähnliche Assays können durchgeführt werden, um mitochondrialen Stress, oxidativen Stress und Hitzestress zu messen. Ganze physiologische Reaktionen der Tiere auf Stress können auch mit mehreren Überlebenstests gemessen werden. Zum Beispiel wird die Exposition gegenüber Tunicamycin verwendet, um die Empfindlichkeit bei endoplasmatischem Retikulum zu messen.
Der Knockdown des XBP-1-Gens führt zu einer signifikanten Erhöhung der Empfindlichkeit gegenüber Tunicamycin. Darüber hinaus wird die Exposition gegenüber dem chemischen Mittel Paraquat verwendet, um die oxidative und mitochondriale Spannungsempfindlichkeit zu messen. Knockdown des DAF-2-Gens führt zu einer signifikanten Erhöhung der Resistenz gegen Paraquat.
Die Thermoverträglichkeit kann durch Bestimmung des Überlebens von Tieren bei erhöhten Temperaturen gemessen und als Überlebenskurve dargestellt werden. Diese Assays sollten mindestens vier- bis sechsmal durchgeführt werden und alle Repliken sollten gegeneinander geplottet werden, da die Thermotoleranz eine unglaublich hohe Variabilität im Vergleich zu anderen Stresstests zeigt. Bei der Abbildung von Tieren ist es wichtig, die Parameter so einzustellen, dass es keine Über- oder Untersättigung des Signals gibt, und sicherzustellen, dass während des gesamten Experiments die gleichen Parameter verwendet werden.
Die hier beschriebenen bildgebenden Protokolle sind für großflächige Screenings einschließlich genomweiter Bildschirme zugänglich und eignen sich sowohl für explorative als auch für bestätigende Studien, denen dann die beschriebenen physiologischen Tests folgen können.
