Wir danken Life Sciences und der Fakultät der Künste und Wissenschaften an der Queens University für die Finanzierung dieser Arbeit. Ebenso danken wir der Chin-Sang Labor für die Bereitstellung der benötigten Reagenzien, Geräte und technische Unterstützung. Wir danken auch QGEM 2011 vor allem Tony Er für seinen Beitrag zu der Diskussion.

1. Vorbereiten / Waschen der Worms <ol><li> Synchronisieren Würmer jungen Erwachsenen 11. </li><li> Pipette 2 ml der S Basal auf eine 5 cm Chemotaxis Platte inszenierter Würmer, die nur den Rasen von OP50 E. gelöscht haben coli. Kippen Sie die Platte wie notwendig, um sicherzustellen, dass die Würmer aus der Plattenoberfläche in den Puffer gewaschen werden. </li><li> Je 1 ml der Wurm-S Basal Lösung in ein Reaktionsgefäß. </li><li> Zentrifuge für 10 sec mit einer PicoFuge bei 6.600 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Saugen Sie die S Basal, so dass die Pellets von Würmern ungestört. </li><li> 1 ml S Basal Lösung des Mikrozentrifugenröhrchens, kehren ein paar Mal, um die Würmer zu waschen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,4 bis 1,6 noch dreimal. </li><li> Zentrifuge für 10 sec ein fünftes Mal, diesmal Absaugen der Überstand auf ein Gesamtvolumen von ca. 100 ul. </li><li> Pipette 2 ul der Würmer auf eine NGM Platte, um sicherzustellen, gibt es zwischen 50 und 250 Würmer in jedem 2 ul Probe. Einstellendie Konzentration von Würmern in der S Basal durch Resuspendieren die Würmer in einem kleineren oder größeren Volumens von S Basal benötigt. </li><li> Verwenden Sie die Würmer in dem Test sofort nach dem Waschen die Würmer für bis zu 1 Stunde. </li></ol> 2. Vorbereitung der Test-Platten <ol><li> Kennzeichnung der Unterseite eines 5 cm Platte, teilen Sie die Schale in 4 gleich große Quadranten. Chemotaxis NGM-Agar oder verwendet werden. Ein Minimum von 3 Versuche pro genetische Belastung getestet erforderlich. </li><li> Markieren Sie einen Kreis mit einem Radius von 0,5 cm um den Ursprung (Abbildung 1). </li><li> Markieren Sie einen Punkt in jedem Quadranten entweder mit einem &quot;T&quot; für &quot;Test&quot; oder &quot;C&quot; für &quot;Control&quot;, um sicherzustellen, dass die Seiten gleich weit vom Ursprung und zueinander stehen. Die Punkte müssen mindestens 2 cm vom Ursprungs sein. Markieren Sie die oben links und unten rechts Quadranten als Test-Quadranten und dem oberen rechten und unteren linken Quadranten als Kontrollen (Abbildung 1). </li></ol> 3. Ausführen des Assay </p&gt; <ol><li> Mischen Sie die Testlösung durch die Kombination von gleichen Volumina der Testverbindung und 0,5 M Azid (ein Anästhetikum verwendet werden, um die Würmer bei Erreichen eines Quadranten verhaften). Mischen der Kontrolllösung durch Kombinieren des verwendeten Lösungsmittels, um die Testverbindung mit 0,5 M Azid verdünnen. </li><li> Pipette 2 ul der Wurm-Lösung (hergestellt in 1.8) aus dem Pellet auf die Herkunft (wo sich die beiden Linien schneiden). </li><li> Unmittelbar nach, Pipette 2 ul der Testlösung auf die beiden &quot;T&quot;-Websites. Ebenso pipettieren die gleiche Menge der Kontroll-Lösung auf die beiden &quot;C&quot;-Sites. </li><li> Sobald die Schnecke und Geruchsstoff Tropfen in den Agar absorbiert wurden, ersetzen Sie den Deckel und drehen Sie die Platten. </li><li> Nach 60 min, legen die Würmer in einem 4 ° C Inkubator. Nur nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator, wenn sie gezählt werden können. Weggehen Würmer bei Raumtemperatur kann es ihnen ermöglichen, wieder zu mobilisieren. </li><li> Notieren Sie sich die Anzahl der Würmer in jedem Quadranten, die vollständig überquert die innere circle. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.2 bis 3.6 mit der Kontroll-Lösung sowohl in der Test-und Kontrollgruppe Quadranten. Dies wird als der Steuerscheibe dienen. Drei solcher Platten werden sollten, und laufen als entsprechende Steuerung dienen. </li></ol> 4. Die Interpretation der Ergebnisse / Bestimmung der Chemotaxis Index <ol><li> Berechnen Sie die Chemotaxis Index mit Gleichung 1. Dies ergibt eine chemotaktische Index zwischen -1.0 und +1.0. </li></ol> (1) Chemotaxis Index = (# Worms in beiden Versuchsreihen Quadranten - # Worms bei den Kontroll-Quadranten) / (Gesamtanzahl erzielter Worms) A +1.0 Punkte zeigt maximale Anziehungskraft in Richtung des Ziels und stellt 100% der Würmer Ankunft in den Quadranten mit der chemischen Ziel. Ein Index von -1.0 ist ein Beweis für maximale Abstoßung. Ähnliche Testverfahren wurden bereits 3 (Tabelle 1) eingesetzt. <ol start="2"><li> Melden Sie den Mittelwert Chemotaxis Index (CI) und Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Mache eine Student-T-Test Vergleich der Daten aus den Versuchs-und Kontrollgruppen Platten. </li></ol>

<ol>
	<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74, 515-527 (1993).</li><li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans.">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7, 729-742 (1991).</li><li>Lee, J., Jee, C., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+preference+in+C.+elegans.">Ethanol preference in C. elegans.</a> Genes Brain Behav. 8, 578-585 (2009).</li><li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans.">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nat. Methods. 8, 592-598 (2011).</li><li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants.">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 817-821 (1973).</li><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans.">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14, 803-812 (1995).</li><li>Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Positive+Butanone+Learning,+Short-term,+and+Long-term+Associative+Memory+Assays.">C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).</li><li>Troemel, E. R., Kimmel, B. E., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+chemotaxis+responses:+sensory+neurons+define+olfactory+preferences+in+C.+elegans.">Reprogramming chemotaxis responses: sensory neurons define olfactory preferences in C. elegans.</a> Cell. 91, 161-169 (1997).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fundamental+role+of+pirouettes+in+Caenorhabditis+elegans+chemotaxis.">The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis.</a> J Neurosci. 19, 9557-9569 (1999).</li><li>Frokjaer-Jensen, C., Ailion, M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammonium-acetate+is+sensed+by+gustatory+and+olfactory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Ammonium-acetate is sensed by gustatory and olfactory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 3, e2467 (2008).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+Methods:+Synchronization+and+Observation.">Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).</li><li>Sengupta, P., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+specification+and+differentiation+in+the+nervous+system+of+Caenorhabditis+elegans.">Cell fate specification and differentiation in the nervous system of Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Genet. 18, 73-80 (1996).</li><li>Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior.">Behavior.</a> WormBook. , (1895).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Chemotaxis, obwohl durch eine komplexe Reihe von neuronalen und zellulären Mechanismen gesteuert werden, können leicht und objektiv quantifiziert mit Chemotaxisassays sein. Um die besten Ergebnisse aus den Tests zu erhalten, müssen bestimmte kritische Schritte unternommen werden. Erstens, die Inszenierung der Würmer ist wichtig, was in Einklang experimentellen Ergebnisse. Worms in verschiedenen Lebensphasen unterschiedlich verhalten 13; so gemischten Bühne Würmer können Skew experimentellen Ergebnisse....

Ward entwickelte die erste Chemotaxisassay 1973 5, und seitdem hat weitreichende Anwendungen. Neurobiologie ist ein Feld, das von der Verwendung einer Vielzahl von Chemotaxisassays profitiert hat. Olfaktorischen Adaption, eine einfache Form von Lernen und Gedächtnis, hat in C nachgewiesen elegans mit Chemotaxisassays 6. Sie sind auch verwendet worden, um zu zeigen, dass C. elegans entwickeln können Ethanol-Toleranz ein Ergebnis, das zeigt nicht nur das Verhalten Plastizität der Würmer, aber das zeigt auch, dass die Würmer kann sehr nützlich sein bei der Untersuchung der Abhängigkeit von Alkohol in Menschen 3. Assays wurden auch entwickelt, um die Fähigkeit zu demonstrieren C. elegans zu speichern kurz-und langfristigen Speicher durch die zeigen, dass Verbände von den Würmern zwischen Lockstoffe und Nahrungsmittel (OP50) 7 gemacht werden. Darüber hinaus die umfangreichen derzeit verfügbaren Informationen über die C gegeben elegans Genoms, die chemotaxis Verhalten von C. elegans wurde mehrfach durch Mutationen induzieren 1,8 verändert. Dies ermöglicht viele spannende Möglichkeiten Engineering, wie die Entwicklung von C. elegans als bioremediation Tool. So, da die anfängliche Entwicklung des Chemotaxis-Assay im Jahr 1973 hat es sich häufig verändert und verwendet, um Geheimnisse in einer Vielzahl von Disziplinen aufzuklären. Bestimmte Tests zum Ziel, die spezifische Route von den Würmern zu einem Ziel gemacht zu entdecken. Die prototypische Assay dieser Art wurde von Ward 5 entwickelt. Drei Würmer wurden am geschmolzene Agar für 15 min platziert. Ihre Bewegungen wurden durch den Aufdruck sie bleiben, wie sie von der Peripherie der Platte bis zu einer Steigung ein Lockmittel in der Mitte der Platte reiste zurückverfolgt. Alle Würmer auf der Platte wurden verhaftet mit Chloroform am Ende jeder Studie. Ein Nachkomme dieser Methode platziert einen einzigen Wurm in der Mitte der Platte mit dem Lockstoff und der Kontrolle einert gleich und entgegengesetzt Abstände vom Ursprung 2. Pierce-Shimomura et al. entwickelte einen Test, um die genaue Art der Bewegung in Chemotaxis 9 beteiligt beobachten. Einzelne Würmer wurden in 9 cm Petrischalen entweder mit einer einheitlichen Konzentration der Lockstoff oder einer radialen geformten Verlauf angeordnet ist, die ihren Höhepunkt in der Quelle der Lockstoff. Ein Computer-Software-Programm, das die Schnecke erkannt wurde verwendet, um das beobachtete Verhalten aufzuzeichnen. Ein Video-Kamera, die an einem Mikroskop gearbeitet in Verbindung mit der Stufe, um die Petrischale automatisch als der Test lief, um sicherzustellen, die Schnecke blieb im Blickfeld. Daraus wurde mehr detaillierte Informationen über die Ursache entdeckt Pirouetten von C. angezeigt elegans. Andere Tests, ähnlich wie die hier beschriebenen, testeten die Reaktion von einer großen Population von Würmern zu testen Verbindungen. Zwei-Quadranten-Chemotaxis-Assays wurdenverwendet werden, um die Rollen zu erforschen, die verschiedenen Neuronen, Rezeptoren und Signaltransduktionsmoleküle wenn C gespielt elegans wurde verschiedenen Verbindungen 1 ausgesetzt. 20-50 gewaschenen Würmer in der Nähe der Mitte der Platte mit einem Lockstoff und eine Steuereinheit an polaren Enden zusammen mit dem Anästhetikum, Natriumazid (NaN 3) angeordnet ist. Nach 60 min wurde eine chemotaktischen Index mit Werten von -1,0 bis +1,0 der Grundlage der Differenz zwischen dem, wie viele Würmer wurden dem Lockstoff oder der Steuerung befestigt erzeugt. Eine ähnliche chemotaktischen Index wurde in dem Assay in diesem Artikel berichtet verwendet, obwohl die zuvor Assay nicht streng bewerten unbewegliche Würmer. Dieser Assay wurde dann weiter auf das Testen der Wirkungen von neuronalen Ablation auf die Chemotaxis aufgebracht. Eine weitere Variante des vorstehend genannten Assay wurde durchgeführt, wobei 100-200 Würmer in der Mitte einer Platte mit vier Quadranten 3 angeordnet wurden. Benachbarten Quadranten enthalten entweder den Test oderKontrollsubstanz. Wie in früheren Untersuchungen wurden die Würmer durch Einwirkung von Natriumazid bevor erzielt immobilisiert. Ein ähnliches Verfahren wird hier als eine Möglichkeit der Auswertung der Reaktion von C beschrieben elegans, um verschiedene Verbindungen. Jedoch hat das Verfahren unter den zusätzlichen Vorteil, nur die Bewertung Würmer, die einen Schwellenwert trennende Abstand von unbeweglichen Würmer mobilen bestanden haben. Andere Tests haben ähnliche Richtlinien zu ignorieren immobile Würmer eingearbeitet. Frøkjær-Jensen et al. entwickelten ein vielseitiges Assay, der zum Testen sowohl flüchtige als auch wasserlösliche Verbindungen 10 werden kann. Eine Petrischale wurde in vier Quadranten unterteilt. Die oberen und unteren Quadranten nicht enthalten Lösungsmittel. Die linken Quadranten enthalten Wasser und die rechte enthielt das Lockmittel. Beim Testen flüchtige Riechstoffe wurde der Analyt auf dem Deckel der Schale angeordnet ist, über den entsprechenden Quadranten, während wasserlösliche Verbindungen wurden direkt am aga platziertr. Die Verfahren, die derzeit existieren für die Bewertung der chemotaktischen Reaktion von C. elegans werden ständig verfeinert, um ihre Benutzerfreundlichkeit, Effizienz und Genauigkeit zu optimieren. Also, während der Test hier beschrieben hat die Fähigkeit zur Beurteilung der größten Anzahl von Würmern (maximaler Durchsatz:. 250 Würmer / Stunde pro Platte, etwas größer als der Durchsatz von Lee et al 3 gezeigt), die wahre Stärke dieser Methode ist die prägnanten Höhepunkt von vielen der Attribute der früheren Assays (Tabelle 1).

<table><tbody><tr><td>S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 liter.] Autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PicoFuge</td><td>Stratagene</td><td>400552</td><td></td></tr><tr><td>Microscopes</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P10 Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Sodium Azide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol/Distilled Water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bio-Rad</td><td>166-0600</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Amresco</td><td>CA97062-046</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>VWR</td><td>CA12001-120</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH</td><td>BDH</td><td>CABDH8641-2</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531</td><td></td></tr></tbody></table>

c. elegans chemotaxis assay

Viele Organismen verwenden Chemotaxis zu suchen, Nahrungsquellen, vermeiden Schadstoffe und finden mates. Caenorhabditis elegans hat eine beeindruckende Chemotaxis Verhalten. Die Prämisse Prüfung des Ansprechens die Würmer zu einem Duftstoff ist, sie in einem Bereich zu platzieren und beobachten die Bewegung in Reaktion auf einen Geruchsstoff hervorgerufen. Auch mit den vielen verfügbaren Assays optimieren Wurm Ausgangsposition relativ zu sowohl der Steuer-und Testflächen, bei gleichzeitiger Minimierung der Interaktion von Würmern mit einander, während eine signifikante Stichprobengröße bleibt ein work in progress 1-10. Die hier beschriebene Methode zielt darauf ab, diese Probleme durch Änderung der Assay durch Bargmann et al. 1 entwickelt anzugehen. Eine Petrischale in vier Quadranten unterteilt ist, sind zwei gegenüberliegende Quadranten mit der Aufschrift &quot;Test&quot; und zwei &quot;Control&quot; bezeichnet. Betäubungsmittel wird in allen Test-und Kontrollgruppe Websites platziert. Die Würmer sind in der Mitte der Platte mit einem circl platzierte um den Ursprung markiert, um sicherzustellen, dass unbewegliche Würmer werden ignoriert. Mit Hilfe eines Vier-Quadranten-System anstatt einer 2 oder zwei 1 eliminiert Verzerrungen bei der Bewegung der Würmer, da sie gleich weit von Test-und Kontrollproben sind, unabhängig davon, auf welcher Seite des Ursprungs sie begann. Dies umgeht das Problem der Würmer ist gezwungen, durch ein Cluster von anderen Würmern zu reisen, um zu einem Geruchsstoff, die Würmer verzögern können oder sie zu zwingen, einen Umweg zu nehmen, was zu einer falschen Interpretation ihrer vorgesehenen Weg zu reagieren. Diese Methode zeigt auch praktische Vorteile durch einen größeren Stichprobenumfang und so der Forscher, um die Assay unbeaufsichtigt laufen und schießen die Würmer, wenn die Redezeit ist abgelaufen.

Vergleich Wildtyp (N2) C. elegans zur odr-10 (KY10)-Mutante. Wir verwendeten Diacetyl, eine bekannte C. elegans Lockstoff, um Wildtyp-Würmern der einer Mutante, die den Rezeptor für Diacetyl 1,12 fehlt vergleichen. Für Wildtyp (N2) Würmer die chemotaktische Index war 0,100 ± 0,066 zu Ethanol und 0,839 ± 0,031 bis 0,5% Diacetyl. Wie erwartet, löst Diacetyl einen signifikanten chemoattractive Antwort von Wildtyp-Würmer (P &lt;0,003). Dagegen ...

Watch this Scientific Journal Video about C. elegans Chemotaxis Assay at JoVE.com

C. elegans Chemotaxis Assay

Verfahren zur quantitativen Bewertung der chemotaktischen Reaktion von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Beschrieben. A chemotaktischen Index (CI) wurde als eine Möglichkeit, genau zu ermitteln Reaktion von Würmern zu bestimmten Zielen und als Plattform des Vergleichs zwischen Stämmen und Verbindungen von Interesse verwendet.

C. elegans Chemotaxis-Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Research

JoVE Journal

Biology

C. elegans Chemotaxis Assay

45.6K Aufrufe.  Queen's University. Verfahren zur quantitativen Bewertung der chemotaktischen Reaktion von Caenorhabditis elegans Beschrieben. A chemotaktischen Index (CI) wurde als eine Möglichkeit, genau zu ermitteln Reaktion von Würmern zu bestimmten Zielen und als Plattform des Vergleichs zwischen Stämmen und Verbindungen von Interesse verwendet.

Serie: C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

C. elegans Positive Butanone Learning, kurzfristige und langfristige Assoziative Speicher Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

Forschung

Neurowissenschaften

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Mikrofluidik-basierten electrotaxis für On-Demand-Quantitative Analyse von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Biotechnik

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

Automatisierte Analyse eines Nematoden-Populations-basierten Chemosensorischen Präferenzassays

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Verhalten

<meta charset="utf8"></head><body>Extraktion und Quantifizierung flüchtiger Sexualpheromonantworten in C. elegans

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and computations governing these signals remains an active area of research. The nematode Caenorhabditis elegans provides a powerful model for studying these processes as it produces a volatile sex pheromone. This pheromone is synthesized by virgin females or sperm-depleted hermaphrodites and serves as an attractant for males.
This protocol describes a detailed method for isolating the volatile sex pheromone from several C. elegans strains (WT strain N2, daf-22, and fog-2) and C. remanei. We also provide a protocol for quantifying the male chemotaxis response to the volatile sex pheromone. Our analysis utilizes measurements such as chemotaxis index (C.I.), arrival time (A.T.), and a trajectory plot to compare male responses under various conditions accurately. This method allows for robust comparisons between males of different genetic backgrounds or developmental stages. Furthermore, the experimental setup outlined here is adaptable to investigating other chemoattraction chemicals.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Untersuchung des Einflusses flüchtiger Sexualpheromone auf das Verhalten männlicher C. elegans

This protocol establishes methods for extracting and quantifying responses to the volatile sex pheromone in C. elegans, providing tools to study chemical communication and navigation trajectory.

Extraktion von flüchtigen Sexualpheromonen und Chemoattraction-Assay bei Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

Messung zellulärer Chemotaxis mit ECIS / Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Biologie

Aversive Associative Learning and Memory Formation by Pairing Two Chemicals in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an attractive model organism to study learning and memory at molecular and cellular levels because of the simplicity of its nervous system, whose chemical and electrical wiring diagrams were completely reconstructed from serial electron micrographs of thin sections. Here, we describe detailed protocols for the conditioning of C. elegans by massed and spaced training for the formation of short-term memory (STM) and long-term memory (LTM), respectively. By pairing 1-propanol and hydrochloric acid as conditioned and unconditioned stimuli, respectively, C. elegans was successfully trained to form aversive associative STM and LTM. While na&#239;ve animals were attracted to 1-propanol, the trained animals were no longer or very weakly attracted to 1-propanol. Like in other organisms such as Aplysia and Drosophila, "learning and memory genes" play essential roles in memory formation. Particularly, NMDA-type glutamate receptors, expressed in only six pairs of interneurons in C. elegans, are required for the formation of both STM and LTM, possibly as a coincidence factor. Therefore, the memory trace may reside among the interneurons.

Aversive Associative Learning and Memory Formation by Pairing Two Chemicals in Caenorhabditis elegans

We have previously developed protocols for Caenorhabditis elegans to form short- and long-term associative memories by massed and spaced training, respectively. Here, detailed protocols are described for the conditioning of C. elegans by pairing 1-propanol and hydrochloric acid as conditioned and unconditioned stimuli, respectively, to form aversive associative memory.

Aversives assoziatives Lernen und Gedächtnisbildung durch Paarung zweier Chemikalien in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an attractive model organism to study learning and memory at molecular and cellular levels because of the ...

Chemotaxis is a process in which cells or organisms move in response to a chemical stimulus. In nature, chemotaxis is important for organisms to sense and move toward food sources and move away from stimuli that may be toxic or harmful. Chemotaxis is also important at the cellular level. For example, chemotaxis is required for the movement of sperm toward an egg prior to fertilization. In the lab, chemotaxis is frequently examined in the nematode, C. elegans, which is known to migrate towards food sources in soil, but away from toxins such as heavy metals, substances with a low pH, and detergents. This video demonstrates how to perform a chemotaxis assay, which includes preparing the chemotaxis plates and the worms, running the assay, and analyzing the data. Then, we discuss examples of how chemotaxis assays can be used in C. elegans as a tool to understand learning and memory, olfactory adaptation, and neurological disease such as Alzheimer&quot;s disease. Chemotaxis experiments in C. elegans have near-limitless possibilities for learning more about the cellular and genetic mechanisms of many biological processes, and may lead to a greater understanding of human biology, development, and disease.

Chemotaxis Assay in Caenorhabditis elegans

Chemotaxis-Versuche in C. elegans

Chemotaxis is a process in which cells or organisms move in response to a chemical stimulus. In nature, chemotaxis is important for organisms to sense and ...

Lehre

JoVE Science Education

Grundlegende Biologie

Modellorganismen I: Hefe, Drosophila und C. elegans

C. elegans Survival Assay: A Short-Term Toxicity Test

Source: Possik, E. and Pause, A. <a href="https://www.jove.com/video/2496/measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-96-well-microtiter">Measuring Oxidative Stress Resistance of&#160;Caenorhabditis elegans&#160;in 96-well Microtiter Plates.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015).
This video introduces a short-term survival assay that tests a treatment for acute toxicity or tests a genetic strain for resistance to a toxic condition.&#160; The example protocol shows an example survival assay in which worms are tested for their ability to&#160; resist oxidative stress induced by paraquat (PQ).

C. elegans Überlebenstest: Ein Kurzzeittoxizitätstest

Source: Possik, E. and Pause, A. Measuring Oxidative Stress Resistance of&#160;Caenorhabditis elegans&#160;in 96-well Microtiter Plates.&#160;J. Vis. Exp. ...

C. elegans Chemotaxis-Assay

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

C. elegans Positive Butanone Learning, kurzfristige und langfristige Assoziative Speicher Assays

Mikrofluidik-basierten electrotaxis für On-Demand-Quantitative Analyse von

Automatisierte Analyse eines Nematoden-Populations-basierten Chemosensorischen Präferenzassays

Extraktion von flüchtigen Sexualpheromonen und Chemoattraction-Assay bei Caenorhabditis elegans

Extraktion von flüchtigen Sexualpheromonen und Chemoattraction-Assay bei Caenorhabditis elegans

Extraktion von flüchtigen Sexualpheromonen und Chemoattraction-Assay bei Caenorhabditis elegans

Messung zellulärer Chemotaxis mit ECIS / Taxis

Aversives assoziatives Lernen und Gedächtnisbildung durch Paarung zweier Chemikalien in Caenorhabditis elegans

Chemotaxis-Versuche in C. elegans

C. elegans Überlebenstest: Ein Kurzzeittoxizitätstest