Abbildungen 1 und 2 wurden früher in Free Radical Biology &amp; Medicine (Queliconi et al. 5) veröffentlicht und sind mit einem Kopierschutz von Elsevier statt. Diese Arbeit wurde durch die unterstützte Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), das Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Processos Redox em Biomedicina, die Núcleo de Apoio à Pesquisa de Processos Redox em Biomedicina, USPHS NS064945 (KN) und USPHS GM087483 (KN ). BBQ ist ein Doktorand von einem FAPESP Gemeinschaft unterstützt.

1. C elegans Wachstum <ol><li> Bereiten 35 mm Nematode Growth Medien (NGM)-Agar-Platten mit OP50 Bakterien geimpft, nach Norm Anbaumethoden ein. </li><li> Synchronisieren von C. elegans, indem 6 schwangeren Erwachsenen auf eine Platte ausgesät NGM. Entfernen Sie die Erwachsenen nach ~ 100 Eier gelegt (~ 3 h). </li><li> Die Inkubation für 3 Tage bei 20 ° C, an welchem ​​Punkt die Würmer zu jungen erwachsenen Stadium entwickelt und sind optimal für dieses Experiment. Alternative Protokolle C. synchronisieren elegans sind an anderer Stelle 10 beschrieben. </li></ol> 2. Materialien für AS <ol><li> M9-Puffer (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na 2 HPO 4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO 4) sollte von Sauerstoff durch Äquilibrieren mit N 2 gespült werden vor dem Experiment (Argon können ebenfalls verwendet werden) während 30 min gehalten und umgeben von Eis. </li><li> Machen Sie ein kleines Loch (3 mmbreit) in dem Deckel von 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, in dem die Würmer während AS gelegt werden. Das Loch für den Gasaustausch ermöglicht, ohne den Deckel offen halten, da dies zu übermäßiger Verdunstung Medien führen. </li></ol> 3. Anoxia / Starvation <ol><li> Führen Sie alle Experimente mindestens in dreifacher Ausfertigung. </li><li> 1 ml der RT, sauerstoff M9-Puffer zu jedem 35 mm-Platte mit jungen erwachsenen Würmer gewachsen wie oben beschrieben. Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden, Entfernung von Bakterien von der Platte (Add M9 an den Rändern, wo Bakterien wurden nicht geimpft). Nach ca. 1 min sollte die Würmer schwimmen in der M9. </li><li> Mantel einer 1 ml Pipettenspitze mit BSA durch Pipettieren und Ausstoßen eines sterilen 1% BSA-Lösung. </li><li> Die Platte mit den Würmern in M9-Puffer vorsichtig neigen, entfernen Sie die M9 aus dem gleichen Ort, wo es aufgenommen wurde, und legen Sie die Suspension in die vorbereiteten Mikrozentrifugenröhrchen. Ruhen lassen, auf Eis bis die Würmer zu der Unterseite der Rohre fallen gelassen (~ 1-2 Min). </li><li> Entfernen Sie die maximale Höhe der M9 möglich, ohne die Würmer aus der Röhre zu stören (Abfahrt ca. 100 ul), 1 ml des Sauerstoff gespült und vereist M9 und das Reagenzglas auf Eis, bis die Würmer wieder setzen sich am Boden. Wiederholen Sie den letzten Schritt 3x. In der letzten Waschung, entfernen Sie die M9 bis ~ 100 ul in der Röhre bleibt. </li><li> Die Röhrchen mit den Würmern in sauerstoffarmes M9 innerhalb einer anoxischen / hypoxischen Kammer (siehe Anleitung unten, Abschnitt 3.6.1) oder alternativ in einem benutzerdefinierten verschlossenen Behälter (siehe unten Anleitungen, Abschnitt 3.6.2). <ol><li> Wenn ein Handels anoxischen / hypoxischen Kammer verwendet werden soll, verlassen einige gespült M9 in der Kammer, bevor Schritt 3.5 und 3.5 wiederholen Schritt, wenn die Würmer sind in der Kammer. </li><li> Wenn eine benutzerdefinierte Kammer verwendet werden soll, ist eine detaillierte Beschreibung, wie man eine Low-Cost-Gerät zu erstellen am Ende dieses Protokolls vorgestellt und wurde von einer anderen Gruppe zuvor 11 beschrieben. Kurz: <ol&gt; <li> Machen Sie zwei Löcher in einem 250 ml Tupperware-Typ Behälterdeckel und fügen Rohrverbinder zu ihnen. Einer wird verwendet, um das Gasgemisch zu injizieren, während die andere wird der Gasaustritt in ein Wasserbad sein. </li><li> Zeigen die Würmer in die Kammer und Abdichten der Kammer mit dem Deckel. </li><li> Gas mit konstantem N 2 Fluss (100 ml / min). </li><li> Stellen Sie den Behälter in einem Wasserbad bei 26 ° C Sicherzustellen, dass das Ausgangsrohr ist in Wasser eingetaucht, so dass keine Luft zurückkehrt und dass keine Lecks in dem System (scheinbare durch Blasen aus der Kammer selbst). </li></ol></li></ol></li><li> Die Würmer Inkubieren bei 26 ° C für 20 Stunden. </li></ol> 4. Simulierte Reperfusion <ol><li> Nach 20 Stunden unter AS Bedingungen in der Raumluft entfernen Sie die Rohre aus dem Brutraum. </li><li> Pipette C. elegans mit einer BSA-beschichtete Spitze (wie in Schritt 3.3) auf ein OP50 ausgesät 35 mm NGM Platte. Die Inkubation bei 20 ° C für 24 Stunden.Danach werden die Würmer bereit, erzielt werden kann. </li></ol> 5. Identifizieren Toten Versus Live-Worms <ol><li> Mit einem Platin-Pick, leicht berühren, die oben auf dem Kopf des Wurms. Live-Würmer werden nach berührt rückwärts bewegen. Wenn die Würmer nicht reagierender, zu zählen, wie tot ist. Gelegentlich wird ein Wurm nicht rückwärts bewegen, aber eine leichte Seite-an-Seite Kopfbewegung zu zeigen. Obwohl technisch nicht tot ist, sind diese Würmer fast sicher, innerhalb von Stunden ablaufen und sollte als tot gewertet. Wenn man zu lange, um die Würmer Tor wartet, können interne Schlüpfen der Nachkommen auftreten und diese &quot;Taschen-of-Würmer&quot; reißen können, was Erfassung der Tierkörper sehr schwierig. </li><li> Entfernen Sie die beiden lebenden und toten Würmer von der Platte, wie sie gezählt werden, um doppelte Zählungen zu vermeiden. Die Live-Würmer können auf einer separaten Platte bewegt, um Verhaltenstests durchzuführen. Die Menge an lebenden Würmer bezogen auf das Gesamt als% der überlebenden Schnecken dargestellt (Figur 1A </strong&gt;). </li></ol> 6. Touch Response Assay <ol><li> Eine ausführliche Beschreibung dieses Protokolls ist in Hart, Anne C., Hrsg. vorgestellt. Verhalten (3. Juli 2006), WormBook, hrsg. Die C. elegans Forschungsgemeinschaft, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org. <ol><li> Um Touch-Reaktion zählen, identifizieren Würmer, die sich bewegen und berühren Sie leicht die Seite der Kopf des Wurms (in der Nähe des mittleren Teil des Rachens) mit einem Wimpern Pick (Abbildung 3). </li><li> Wenn der Wurm sich rückwärts bewegt, Partitur so reagieren, wenn nicht, schieße so nonresponsive (Abbildung 1B). Wiederholen Sie diesen Schritt 10-15x für jeden Wurm mit 10 Sekunden-Intervallen. Sonde mindestens 10 Würmer in jeder Gruppe, um genaue Daten haben. Der gleiche Test kann verwendet folgende leichte Berührung mit der hinteren Körperwand nach vorne zu beurteilen Bewegungs Veränderungen werden. Achten Sie darauf, den Kopf oder Schwanz der Wurm nicht zu berühren, da dies einen deutlichen Verhalten stimuliert. </li><li> Schließlich wird inUnternehmens genetische Kontrollstämme [N2 Bristol-Wildtyp-positiv, mec (mechanosensorischen) für negative Mutante - zB CB1338 mec-3 (e1338) IV], um die Kraft, mit der die Würmer berühren kalibrieren. Zu hart eines Stimulations eine Verhaltensreaktion in mec Mutanten zu entlocken, zu wenig wird eine Wirkung in Wildtyp N2 Kontrollen nicht zu entlocken. </li></ol></li></ol> 7. Neuronale Änderungen <ol><li> Um nach AS neuronalen Veränderungen sichtbar zu machen, verwenden Sie einen Stamm, der GFP in den Touch-Neuronen reagieren mec 4,5 ausdrückt. Diese Neuronen haben lange Prozesse, die an der Körperwand laufen und sind leicht für morphologische Auffälligkeiten erzielt. Darüber hinaus kann die morphologische Information mit Verhaltensmaßnahmen der neuronalen Funktion integriert werden, wie oben beschrieben. Ein Stamm, der für diesen Zweck verwendet werden kann, ist TU2583, die erhältlich ist von der C elegans Genetics Center und enthält die uIs25 integrierte Transgen exprimieren GFP herm die mec-18-Promotor, oder alternativ TU2562, die eine integrierte mec-3 :: GFP-Fusions enthält. </li><li> Bereiten Sie eine Agarose-Pad. <ol><li> Melt 2% Agarose in Wasser, bringen M9 mit einem 10fach-1x und Wartung der Lösung bei 70 ° C </li><li> Einen Tropfen (~ 20 &amp;mgr; l) dieser Lösung auf einen Objektträger (25 mm x 75 mm), die zwischen zwei anderen Folien, von denen jede ein einziges Stück Klebeband auf ihrer Unterseite platziert ist. </li><li> Legen Sie eine abschließende Glasobjektträger senkrecht zu der ersten auf dem 2% igen Lösung, und lassen Sie es bei Raumtemperatur abkühlen. Dies sollte eine Unterlage, die die Dicke des Bandes zu bilden. </li><li> Entfernen Sie die obere Folie und fügen Sie 10 ul der M9 mit 0,1% Tetramisol, die die Würmer zu immobilisieren wird. </li></ol></li><li> Bewegen Sie einige (~ 10) leben Würmer auf den 2% igen Rutsche. Legen Sie ein Deckglas über sie und visualisieren GFP mit einem Fluoreszenzmikroskop unter einem 100X Ziel mit der entsprechenden Beleuchtung. </li><li> BeschädigtNeuronen eine cytosolische Membranperlenmuster in den Prozessen von mehreren punctum (2A) besteht, und / oder Anomalien, wo die Prozesse scheinen gebrochen zu werden (2B) zu zeigen. Zählen Punctum und Anomalien in beiden Neuronen für jede Schnecke, unter Verwendung von insgesamt mindestens 10 Würmer. </li></ol> 8. Lab hergestellt Hypoxic Kammer <ol><li> Eine Tupperware-Stil, siegelfähige, luftdichten Behälter kann als anoxischen Kammer nachgerüstet werden. Achten Sie darauf, einen Behälter, der so klein wie möglich ist, zu wählen. Ein kleiner Behälter erzeugt eine hypoxische Umgebung schneller und einfacher ist, im Wasserbad (Abbildung 4) passen. </li><li> Machen Sie zwei Löcher auf dem Deckel (kann mit einem Schraubendreher oder durch Erhitzen Pinzette und zwingt in den Deckel gemacht werden) und legen Sie eine Kunststoff-oder Metallstecker, die den Schlauch (5A) passt. Benutzen Sie Klebstoff, die unter Wasser gesetzt werden kann, und wird hart nach dem Trocknen zu vermeiden Bewegung auchder Stecker und damit die Möglichkeit einer Leckage (Fig. 5B) verringert wird. </li><li> Der Behälter sollte in das Wasserbad gestellt werden, so dass sie vollständig (Fig. 4) eingetaucht. Um den Behälter eintauchen, mit einem Flaschengewicht oder ein Tauchgewicht. </li><li> Einer der Rohrverbindungen werden verwendet, um eine Gasmischung einzuführen und die andere Röhre wird als Überdruck wirken, daher sollte es unter Wasser gelassen, so dass der Behälter von der äußeren Umgebung (4) abgedichtet werden. </li><li> Die Luftzusammensetzung kann durch maßgeschneiderte Gas, Massendurchflussregler oder ein Gerät, das die gewünschten Gase mischt moduliert werden. Der Gasfluss sollte kontrolliert werden, da hohe Strömungs können übermäßige Verdunstung erstellen. Beispielsweise in einem 250 ml-Behälter mit 100 ml / min Gas gute Raum für die Würmer und einen geeigneten Fluß bereitzustellen. </li><li> Die Länge der Rohrleitung auf einem Minimum gehalten werden, da sie durchlässig für Gas, eine sein kann,llowing der Eingang von O 2. Es ist wichtig, zu vermeiden, mit Silikon, Tygon-Röhren als diese Materialien sind durchlässig für den Gasaustausch. Wir bevorzugen Polypropylen oder Nylon Rohre. Glas-oder Metallrohre halten die Gase gut, sind aber auch schwieriger zu verarbeiten. </li></ol>

<ol>
	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Maine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+gene+function+in+Caenorhabditis+elegans+using+RNA-mediated+interference.">Studying gene function in Caenorhabditis elegans using RNA-mediated interference.</a> Briefings Funct. Genom. Proteom. 7 (3), 184-194 (2008).</li><li>Vanden Hoek, ., L, T., Shao, Z., Li, C., Zak, R., Schumacker, P. T., Becker, L. 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S., Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLO-2+is+cytoprotective+and+contributes+to+mitochondrial+potassium+transport.">SLO-2 is cytoprotective and contributes to mitochondrial potassium transport.</a> PloS One. 6 (12), e28287 (2011).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).</li><li>Fawcett, E. M., Horsman, J. W., Miller, D. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+age-dependent+reversal+in+the+protective+capacities+of+JNK+signaling+shortens+Caenorhabditis+elegans+lifespan.">An age-dependent reversal in the protective capacities of JNK signaling shortens Caenorhabditis elegans lifespan.</a> Aging Cell. 11 (4), 659-667 (2012).</li><li>Wang, Y., Chen, J., Wei, G., He, H., Zhu, X., Xiao, T., Yuan, J., Dong, B., He, S. S. k. o. g. e. r. b. &. #. 2. 4. 8. ;. G., Chen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+intermediate-size+transcriptome+shows+high+degree+of+stage-specific+expression.">The Caenorhabditis elegans intermediate-size transcriptome shows high degree of stage-specific expression.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 5203-5214 (2011).</li><li>Perry, C. 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Biol. Chem. 278 (45), 44657-44666 (1074).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

AS wurde häufig in C verwendet elegans IR Verletzungen zu modellieren. Einige wichtige Punkte sollten für dieses Protokoll hervorgehoben werden: C. elegans sind beständig gegen eine Vielzahl von Verletzungen, die die Notwendigkeit für 3 gleichzeitige Beleidigungen (Hitze, Hunger und Sauerstoffmangel) zu Tode mit diesem System zu erreichen. Anoxia allein nicht den Würmern in diesem Zeitfenster 14 zu töten. Darüber hinaus ist ein zusätzlicher Temperaturanstieg Stress, so ist es wichtig, genau zu überwachen. Streng genommen ist Hunger nicht signifikant den Grad der Mortalität beobachtet 7, per se, aber es scheint, um die Variabilität unter den Experimentwiederholungen zu verringern. Da es können erhebliche Variabilität von Tag zu Tag, ist es äußerst wichtig, die Vergleichsproben laufen direkt parallel und Experimente über mehrere Tage wiederholt. Im Allgemeinen sind die Ergebnisse für drei getrennte Platten von 50-100 Würmer / experimentellen Bedingungen gemessen und das sind dien gemittelt und als eine einzige Versuchs Replikat betrachtet. Im Allgemeinen scheinen zwischen sieben und neun Wiederholungen aus, um zu erreichen oder auszuschließen statistische Signifikanz zu sein. Das Entwicklungsstadium der in dem Experiment verwendet Würmer muss auch sorgfältig wie die Anfälligkeit der verschiedenen Stufen zu überwachenden Schäden erheblich variiert 15,16. Der Einsatz von jungen Erwachsenen ist Standard, und Larvenstadium (L3 und L4) Würmer zu sein scheinen resistent gegen die schädlichen Auswirkungen von AS (unveröffentlichte Daten). Dieses Protokoll stellt zwei Möglichkeiten, um die Experimente durchzuführen, eine mit einer im Labor hergestellten Geräten (mit Tupperware-Behälter Typ-und Gaseingang 11) und andere mit einer handelsüblichen 4,6 hypoxischen Kammer. Anoxie durch andere Mittel, die den Sauerstoffverbrauch erzielt werden, wie an anderer Stelle beschrieben 13,17. Der Einsatz von alternativen Techniken, um eine hypoxische Umgebung erstellen kann den AS Inkubationszeit Bedarf ändernum die gewünschte Menge des Todes zu erstellen. Targeting ~ 20% Überlebensrate ist ein idealer Ausgangspunkt für die Untersuchung Schutzmaßnahmen, während 80% ist ebenso ideal für Interventionen, die die nachteiligen Wirkungen von AS verschärfen. Eine weitere wichtige Einschränkung ist, der Zeitpunkt, zu dem die Beobachter Partituren tot / lebendig Würmer. Wenn die Zeit für die Analyse wird über 24 h verlängert, können die Daten irreführend sein, da tote Würmer zunehmend schwieriger zu identifizieren. Dies kann aufgrund Wurm Kadaver immer über die Zeit relativ transparent, dass befruchtete Embryonen können innerhalb der Schlachtkörper in Post-mortem-Nachkommen zu entwickeln und zu stören, wie sie entstehen, aber auch. Die Analyse der neuronalen Morphologie kann modifiziert werden, um Proteinexpressionsmuster 18, Kernfragmentierung 4 und andere Parameter 19 durch ein Wurmstamm, der die entsprechende genetisch codierten Markierung exprimiert Substitution aussehen. Eine letzte Einschränkung ist, dass die Visualisierung derneuronale Prozesse sollte weniger als 30 min nach Einsetzen der Würmer auf der Folie durchgeführt werden. Tiere unter Narkose gehalten auf Objektträger für längere Zeit kann AS-unabhängigen Schäden aufweisen. Passen Sie die Menge der Tiere pro Folie nach der benötigten Zeit zu verfolgen und zu analysieren.

C. elegans ist ein Fadenwurm, die weithin als eines vielzelligen eukaryontischen Modellorganismus seit der Einführung von Brenner 1 angenommen. Es ist eine billige, einfache und vielseitiges Modell, das einfach Verbindungen zwischen genetischen Veränderungen und phänotypische ändert 2 ermöglicht. Ischämie wird durch einen Mangel an Nährstoffen und Sauerstoffversorgung eines Gewebes, gefolgt von Reperfusion, wenn ein Burst von reaktiven Sauerstoffspezies erzeugt wird, 3 und das meiste Schaden entsteht dadurch. Im Jahr 2002, ein Modell der Ischämie / Reperfusion (IR) in C. elegans entwickelt 4 mit der Abgabe der ganze Wurm zu Sauerstoffmangel, Nährstoffmangel und Hitzestress für ca. 20 Stunden, gefolgt von 24 Stunden unter normalen Bedingungen. Obwohl dieses Modell ist technisch eine Sauerstoffmangel-Hunger (AS) Zustand tritt Zelltod durch Mechanismen, die bei Säugetieren konserviert sind, einschließlich der Schäden durch Oxidationsmittel während der Reperfusion induzierte &lt;sup&gt; 5. Außerdem ähnlich Säugetier IR, Schäden, die durch AS in C induziert elegans kann durch ischämische Präkonditionierung 6,7 oder 8,9 Betäubung Vorbehandlung verhindert werden. Die folgenden Protokolle zeigen, wie man in C IR imitieren elegans mit dem AS-Modell, wie man morphologische und Verhaltensauffälligkeiten, die von AS führen punkten, und wie das Protokoll in einer Weise, die das Experiment mit einer niedrigeren Anfangsinvestitionen mit einem maßgeschneiderten, leicht konstruiert Kammer Alternative durchgeführt werden können anpassen .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1146">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">N2&#160; strain</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:453px;">Wild type strain</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;">TU2583</td>
			<td style="width:453px;">integrated fluorescent transgene used to label touch neurons</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CB1338 mec-3 (e1338)IV</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;">CB1338</td>
			<td style="width:453px;">canonical mec-3 mutant that is touch insensitive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:269px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:208px;">0030 120.086</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Nikon Eclipse TE2000-U Microscope&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Nikon USA</td>
			<td style="width:208px;">TE2000-U</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Low Temperature Incubator</td>
			<td style="width:269px;">Sheldon Manufacturing Inc.</td>
			<td style="width:208px;">Model 2005</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Eyelash Pick</td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:453px;">An eyelash pick can be prepared by attaching&#160; an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Hypoxic Chamber</td>
			<td style="width:269px;">Coy</td>
			<td style="width:208px;">8307030</td>
			<td>Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an anoxia-starvation model for ischemia/reperfusion in c. elegans

Protokolle für Anoxie / Hunger in der genetischen Modellorganismus C. elegans simulieren Ischämie / Reperfusion. Würmer sind aus Bakterien Nahrung für 20 Stunden (simulierten Ischämie) abgetrennt und unter Sauerstoffmangel angeordnet ist, und anschließend zu einer normalen Atmosphäre mit Lebensmitteln (simulierte Reperfusion) bewegt. Diese experimentelle Paradigma führt zu einer erhöhten neuronalen Schäden und Tod und Techniken werden vorgestellt, um die Lebensfähigkeit der Organismen, Änderungen der Morphologie von Touch-Neuron Prozesse sowie Berührungsempfindlichkeit, die die Verhaltensleistung von neuronalen Funktion stellt beurteilen. Schließlich wird ein Verfahren zur Konstruktion hypoxischen Inkubatoren mit Gemeinschaftsküche Lagerbehälter beschrieben. Der Zusatz eines Massenstrom-Steuereinheit ermöglicht Änderungen an dem Gasgemisch in den benutzerdefinierten Inkubatoren hergestellt werden, und ein zirkulierendes Wasserbad ermöglicht sowohl Temperatursteuerung und macht es leicht, Lecks zu identifizieren. Dieses Verfahren stellt eine kostengünstige Alternative handelsverfügbaren Einheiten.

Unterziehen C. elegans zu 20 Stunden von AS bei 26 ° C in einem benutzerdefinierten Labor hergestellten Brutraum, wie beschrieben (Abschnitt 3.6.2) führte zu einer signifikanten Mortalität (Abbildung 1A) 5. Anschließende Fluoreszenzabbildung von Punctum und Brüche in den GFP-markierten neuronalen Prozesse von Überlebenden bestätigte die Anwesenheit von morphologischen Veränderungen (Abbildung 2). Die Überlebenden reagiert auch schlecht auf die Lichtkörperwand touch (Abbildung 1B). Dieses Modell wurde von mehreren Gruppen verwendet worden, um zu untersuchen, wie genetische Veranlagung, pharmazeutische Interventionen und metabolische Plastizität betrifft AS abhängig Ergebnisse 4-6,8,9,12,13. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1.jpg" /> 1. C elegans Überleben und die Touch-Reaktion nachAS. A) Prozentualer Anteil der Würmer, die 24 Stunden nach der AS Überleben zeigen. Die N2-Stamm der Wildtyp genetischen Hintergrund und KWN85 enthält eine integrierte Transgen, das mec Neuronen mit GFP. B-Etiketten) Reaktion auf Reize des Lebens berühren C. elegans (N2-Stamm) nach AS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2.jpg" /> 2. Berühren Neuron Änderungen, die nach AS. Touch-Neuron (PLML und PLMR) Anomalien wie verschlungenen Prozesse und Pausen (A) oder die Ansammlung von GFP-Aggregate in den Prozessen (B) wurden in überlebenden überwacht betäubt C. eleg<html> ans nach AS. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3.jpg" /> 3. Wimper-Pick. Eine montierte Wimpern Pick. Der Einschub, ein Detail der Wimper geklebt, um die Zahnstocher Holz. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4.jpg" /> 4. Lab hergestellt hypoxischen Kammer im Inneren des Wasserbades. Ein geschlossener Behälter bereit, das Experiment zu starten. Die Pfeile zeigen die Gas-und Ausfahrt und die Flasche Gewicht verwendet, um es von schwimm halten. 231fig5.jpg &quot;/&gt; 5. Details der inneren und äußeren Seite des Behälterdeckels. A) Außenseite der Behälterdeckel, die die Röhre und dem Anschluss an die bisherigen Loch. B) Außenseite des Behälterdeckels, auf der der Rohrstutzen auf die bisherigen Loch befestigt.

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An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Ein Protokoll beschrieben, das Anoxie / Hunger in C verwendet elegans zu modellieren Ischämie / Reperfusion. Funktionelle Ergebnisse sind eine erhöhte Sterblichkeit, sichtbare Veränderungen in GFP-markierten neuronalen Prozesse und die Beeinträchtigung der Verhaltensreaktionen, die neuronale Funktion benötigen.

Ein Anoxia-Hunger-Modell für Ischämie / Reperfusion in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

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Research

JoVE Journal

Biology

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

9.8K Aufrufe.  Universidade de São Paulo.  Ein Protokoll beschrieben, das Anoxie / Hunger in C verwendet elegans zu modellieren Ischämie / Reperfusion. Funktionelle Ergebnisse sind eine erhöhte Sterblichkeit, sichtbare Veränderungen in GFP-markierten neuronalen Prozesse und die Beeinträchtigung der Verhaltensreaktionen, die neuronale Funktion benötigen. 

Serie: An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imaging C. elegans Embryos mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop und Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Forschung

Biologie

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Chemotaxis-Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Ein Verfahren zur Kultivierung von embryonalen<em&gt; C. elegans</em&gt; Zellen

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Antikörperfärbung in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Mit der &quot;Freeze--Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Verfahren zur Haut Verwundung und Assays für Wound Antworten in<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Methoden zur subzellulärer Kompartimente der Muskel in Beurteilen<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Untersuchung der Verbreitung und Toxizität von Prion-ähnlichen Proteine ​​Mit dem Metazoan Modellorganismus<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Tracking und Quantifizierung von Entwicklungsprozessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Verwendung von Open-Source-Werkzeuge

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

Messung physiologischer Stressreaktionen in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...