We greatly acknowledge financial support by NIH R01 CA123495, U01 CA151815, R01 CA136841, grants from the Department of Neurosurgery at Cedars-Cedars Medical Center and Arrogene Technology Inc.

Alle Experimente mit amtlichen Tier Vorschriften, einschließlich chirurgischen und nicht-chirurgischen Verfahren in vivo durchgeführt und sind in voller Übereinstimmung mit IACUC Protokolle erfüllen. 1. Bioproduktion von Polyäpfelsäure <ol><li> Wachsen Sie eine Vorkultur von Kügelchen auf Agar und übertragen Plasmodien auf 100 ml Kulturmedium mit einer 25 ° C Thermo genannten Inkubator und basalen Kulturmedium 8,9. </li><li> Produzieren einen Betrag von Schwerkraft-verpackt 500 ml Mikro Plasmodien unter Ausschluss von Licht, um die Sporenbildung zu vermeiden. </li><li> Bereiten Sie in 80 L 8 Basismedium in 10-l-Bioreaktor suspendiert g CaCO3. Übertragen Sie die 500 ml verpackt Mikro Plasmodien in das Reaktionsgefäß montiert und ermöglichen die Bioprozess für 75 Stunden bei 25 ° C, 10 l / min Volumenstrom gefilterter Luft und 150 rpm Rühren mit einem Rührer Segment. </li><li> Zu beenden, wenn die Kulturbrühe hat pH 4,8, der das Ende der Produktion von PMLA und messen PMLA Inhalt von ter Hydroxamat / Fe (III)-Assay. </li><li> Kühlen Sie die Brühe auf 17 ° C und lassen Zellen durch die Schwerkraft zu begleichen. </li><li> Abkühlen auf 4 ° C und auf pH 7,5, 2 M NaOH zu verwenden. Pumpe den Überstand durch ein mit 1,5 l DEAE-Cellulose in der Richtung von unten nach oben (Grobkorn DEAE, mit 20 mM Tris-HCl pH 7,5 bei 5 ° C äquilibriert) gefüllte Säule. </li><li> Wäscht mit 3 Säulen-Puffer, enthaltend 0,3 M NaCl nach dem Ändern der Richtung von oben nach unten und eluieren PMLA in Gegenwart von 0,7 M NaCl. </li><li> Passen auf 0,1 M CaCl 2 und fällt PMLA-Calcium mit 80% eiskaltem Ethanol. Fraktionierung über Sephadex G25 in PMLA-Kalzium von 80 bis 300 kDa, 50-80 kDa und 10-50 kDa, verwenden Sie Wasser in Abwesenheit von Puffer und Salz. </li><li> Führen Sie jede Fraktion über eine Amberlite IR 120H + Spalte und sofort frieren die Durchfluss Polyäpfelsäure in flüssigem Stickstoff für die Lyophilisation. </li><li> Lösen Sie in trockenem Aceton. Nach der Filtration wird das Lösungsmittel entferntin trockenen Luftstrom, lyophilisiere und lagern bei minus 20 ° C </li></ol> 2. Synthese von Polyäpfelsäure-basierten Nano Drug <ol><li> Aktivieren Carboxylgruppen PMLA (P) durch Mischen 116 mg (1 mmol Malyl Einheiten) PMLA-H in 1 ml wasserfreiem Aceton und 1 mmol N-Hydroxysuccinimid und 1 mmol Dicyclohexyl Carbodiimid in 2 ml Dimethylformamid (DMF). Rühren bei 20 ° C für 3 Stunden. Hinzufügen 0,05 mmol mPEG 5000-NH 2 (0,05 Mol-% Einheiten Malyl) in 1 ml DMF, gefolgt von 0,05 mmol Triethylamin (TEA). </li><li> In DMF tropfenweise 0,4 mmol leucinethylester (Loet) (40 Mol-% Einheiten Malyl), gelöst mit 0,1 mmol 2-thiol-1-ethylamin (2-MEA) (10 Mol-% der Einheiten Malyl) und 0,5 mmol TEA, Alle in DMF gelöst. Nach jeder Zugabe 1 h ermöglichen und überprüfen Abschluss der Reaktion durch negative Ninhydrin-Reaktion (Dünnschicht-Chromatographie, DC). </li><li> Entfernen übrig gebliebenen NHS-Ester, der durch spontane Hydrolyse mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (30 min, pH 6,8). Desalt über PD-10 Spalte erhalten &quot;preconjugate&quot; als weißes Pulver lyophilisiert. Trocken lagern bei minus 20 ° C </li><li> Man löst 30 mg Antikörper (mAb, IgG2a-κ) in 4,5 ml 100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 5,5. </li><li> Reduzieren Disulfidbindungen mit 5 mM Tris (2-carboxy-ethyl)-phosphin-hydrochlorid 30 min bei 20 ° C und Reinigung über PD-10-Säule. </li><li> Auflösen Mal-PEG 3400-Mal in 2 ml des gleichen Puffers und fügen reduziert mAb an Endvolumen von 10 ml zugegeben und über Nacht bei 4 ° C. Konzentrieren Sie sich auf 2,5 ml über Vivaspin 20, Ausschluss 30 kD und reinigte über Sephadex G75. Überprüfen Produkts über SEC-HPLC und messen Menge photometrisch bei 280 nm Wellenlänge. </li><li> Befestigen Mal-PEG-Mal-mAb &quot;preconjugate&quot; Thiole Erhalten P / PEG 5000 (5%) / Loet (40%) / mAb (0,2%) / 2-MEA (10%). Dies geschieht durch Mischen von 5 ml von 200 nmol mAb-PEG 3400-Mal um 50 mg (P / mPEG 5000 / LOEt/2-MEA) in dem obigen Puffer, pH 5,5, einzustellen Konzentration sulfhyDryl bis 2 mM und Inkubation bei 20 ° C für 3 Stunden (Ausbeute 98%). </li><li> Solubilisierung 3&#39;-H 2 N-AON in DMF / PBS (pH 7,2) und reagieren mit N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionat (SPDP) in (1:1 v / v) DMF / Methanol (Ninhydrin-Test ) und zu reinigen, AON-PDP über Sephadex-LH20 in Methanol, dann in Wasser und lyophilisiere. </li><li> Inkubieren 800 nmol aktiviert AONs in der pH 5,5-Puffer mit der oben hergestellten Mal-PEG 3400-Mal-mAb-preconjugate über Nacht, bis der Disulfid-Austauschreaktion wird beendet. </li><li> Integrieren fluoreszierenden Alexa Fluor 680-Maleimid bilden Thioether mit Polymer-2-MEA-SH. Blockieren Über Sulfhydryle mit 3-pyridyldithio-propionat (PDP) und zu reinigen, über Sephadex G75. Lagerung bei 4 ° C oder Schnapp bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung eingefroren. </li></ol> 3. Assays und Eigenschaften <ol><li> Führen Prüfungen auf Reinheit und Stabilität in Serum und PBS bei 4 ° C und 37 ° C durch SEC-HPLC-Analyse. Verwenden Polystyrensulfonat als Moledere Gewichtsstandards. Messen Nanogrößenverteilung und Zeta-Potentiale. Verwenden kommerzielle Systeme. </li><li> In den 320 &amp;mgr; l-Probe 160 ul 10% (w / v) Hydroxylammoniumchlorid und 160 ul 10% (w / v) NaOH. Nach 10-15 min mischen mit 160 ul 5% (w / v) Fe (III) Cl 3 in 12% (v / v) HCl und lesen 540 Hydroxamat / Fe (III). Berechnet unter der Annahme PMLA 1 mg / ml PMLA entspricht 2,5 A 540. </li><li> Hydrolysieren die Nano Medikament über Nacht in 2 M HCl bei 110 ° C und Assay-Äpfelsäure auf Reversed Phase Chromatographie mit Bezug auf Proben gespickt mit Apfelsäure-Standards. Spalten das Medikament nano mit 100 mM Dithiothreitol und messen Morpholino-AON durch quantitative Umkehrphasen-HPLC gegen Morpholino AON-Standards. </li><li> Nehmen Sie nano Medikament ohne Spaltung und messen mit Hilfe eines Antikörper-Protein-Assay-Kit. Quantifizieren mPEG, indem die Reaktion mit Ammonium ferrothiocyanate, extrahieren Sie dann mit Chloroform und Extinktion bei 510 nm Wellenlänge 10 </sup&gt;. </li><li> Führen ELISA mit 5 ul von Nano-Arzneimittel (1-10 ug mAb) pro Bohrlochtests und Antikörperaktivität Colligation. Verwenden Sie 0,5 ug / Well Transferrin-Rezeptor und HER2 jeweils als Platte beschichtete Antigene und Peroxidase-gekoppelten Sekundärantikörper. </li><li> Berechnung erzielt% für AON, MPEG und mAb hinsichtlich Äpfelsäure (100%) und Vergleichen mit dem% nach Design bestimmt (siehe Beispiele Tabelle 1 und Tabelle 2). </li></ol> 4. In-vitro-Tests <ol><li> Inkubieren Sie die nano Medikament mit kultivierten Krebszellen und Maßnahme überlebenden Zellen im Laufe der Zeit durch ihre Tätigkeit auf gelb Reagenz [3 reduzieren - (4,5-2-yl) -5 - (3-Carboxymethoxyphenyl) -2 - (4-Sulfophenylgruppe )-2H-Tetrazolium, inneres Salz] (MTS) zu einem blauen Farbstoff und lesen relativer Absorption mit einem Photometer. Folgen Sie den Anweisungen von der Ausrüster. </li><li> Bereiten Zellextrakten in vitro oder ex vivo für Western-Blot. Verwenden eiskalten Extraktions bUffer, die SDS und Protease-Inhibitor-Cocktail enthält. Getrennte Proteine ​​durch reduzierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. </li><li> Tun Western Blotting von Proteinen von Interesse in der Probenextrakte. Verwenden Sekundärantikörper konjugiert an alkalische Phosphatase. </li><li> Verwenden Sie die konfokale Mikroskopie, um die Zellaufnahme und Co-Lokalisation von Nano-Arzneimittelpolymerplattform, AON und Endosomen demonstrieren mit Fluoreszenzmarkierung. Bringen Alexa Fluor 680 in den Nano-Konjugat-Plattform-und Lissamin zu AON als Fluoreszenzmarkierungen. Verwenden Sie ein Mikroskop 5X spektrale Scanner und lebenden Krebszellen, um die Verteilung der markierten Moleküle sichtbar </li><li> Stain Endosomen-Membranen mit Styryl Red Fluoreszenzfarbstoff und zeigen Endosomen Kolokalisation oder Freigabe. </li></ol> 5. In-vivo-Tests <ol><li> Bereiten Sie den menschlichen HER2-positiven Brustkrebs-Mausmodell (Nacktmaus-Tac: Cr: (MCR)-Foxnnm). Legen Sie eine 0,72 mg 17β-Estradiol-freisetzenden Pellets (90-Tage Mitteilung) subcutaneously in den Hals einer jeden Maus. </li><li> Dann spritzen 1 x 10 7 BT-474 Tumorzellen subkutan in die rechte Flanke und ließ den Tumor wachsen. </li><li> Beginn der Behandlung, wenn die Tumore 120 mm 3 in der Größe durch Injektion in die Schwanzvene 150 &amp;mgr; l Konjugat Nano enthaltend 2,5 mg / kg AON-und / oder 4,5 mg / kg von jedem Antikörper. Für die Behandlung spritzen zweimal pro Woche, insgesamt sechs mal. </li><li> Messen der Tumorgröße mit Sättel zweimal die Schwachen und Volumen berechnen mit Hilfe der Formel (Länge x Tiefe x Breite) x (π / 6). Euthanize Tieren 2 Wochen nach der letzten Injektion und nach Sedierung mit einer Lösung von Ketamin und Dexmedetomidin durch Genickbruch folgte. </li><li> Isolieren Tumoren und Fleck Abschnitte mit H &amp; E für die morphologische Beurteilung. </li><li> Zur Beurteilung der Verteilung von Medikamenten an einem Tier Skala, mit einem Fluoreszenz-Imaging-System. Spritzen Sie die Alexa Fluor 680 markiert nano Drogen-und Bild 24 und 48 Stunden. </li><li> Euthanize das Tier und erfassen die Fluorescence in isolierten und perfundierten Tumoren und Organen. </li></ol>

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Die Autoren Julia Y. Ljubimova, Keith L. Schwarz, und Eggehard Holler sind Aktionäre der Arrogene Technology Inc.

Die experimentelle Weg zur Herstellung von Nano Medikamente aus einem biologisch abbaubaren natürlichen Polymeren vorgestellt, die bei der Synthese der personalisierte Medizin verwendet werden kann. Die Beschreibung beginnt mit der kontrollierten Produktion und Reinigung von Polyäpfelsäure, die eine vielseitige Plattform für Nano-Wirkstoffsynthese ist. Verwendung reproduzierbaren Verfahren wird das Polymer mit hohem Molekulargewicht und in extremen Reinheit für pharmazeutische Synthesen erhalten. Die Synthese wird zur Nano-Medikament, das gezeigt wird HER2-positiven Brustkrebs effizient behandeln beschrieben. Die Beschreibung kann in den meisten anderen Synthesen von Nano Arzneimittel für die Behandlung von Krebs übersetzt werden. Targeting beinhaltet Antikörper wie Herceptin, die ein tumorspezifisches Antigen, wie HER2-Protein oder andere Tumormarker, die effizient internalisiert binden. Die Nano Medikament liefert eine Auswahl von Antisense-Oligonukleotiden und Chemotherapeutika, die wirksam das Wachstum des Krebses zu inhibieren unter treatment. Im Beispiel Herceptin Bindung an HER2 und spezifische Antisense-Oligonukleotid Glühen mit HER2-kodierende mRNA führte zu anhaltenden Sperrung des HER2-Signalgebung und starken Reduzierung von HER2-positivem Brustkrebs. Basierend auf dem Prinzip der Tumor-Targeting und Hemmung der Genexpression durch Antisense-Oligonukleotide, haben wir aktuell mehrere andere nano Drogen und erfolgreich gehemmt präklinischen menschlichen Glioblastom-und triple-negativen Brustkrebs 11,14-18 synthetisiert. Das synthetische Arbeit beginnt mit der Herstellung von hochreinem nano Drogen Plattform, die Polyäpfelsäure aus dem Kulturüberstand von Physarum polycephalum (eine Art der &quot;Schleimpilz&quot;-Familie) ist. Die Herstellung betont hohen Molekulargewichten des Polymers im Prinzip die Anbringung zahlreicher Antikörpern, Peptiden, Oligonukleotiden und anderen Molekülen funktioniert im aktiven Arzneimittelabgabe und Hemmung des Tumorwachstums. Following der kontrollierten Kultivierung und Reinigung hat reproduzierbare Qualität des Polymers in vorhersehbare Erträge produziert. Das Polymer wird unter angenehmen Bedingungen für alle Zeit gespeichert. Die Synthese der Konjugate PMLA Nano beginnend mit der chemischen Aktivierung der Polymer-Anhänger Carboxylate erfolgt in wenigen Syntheseschritten durchgeführt. Zwischen den Schritten kann die Synthese gegebenenfalls auf Eis ermöglicht Herstellung von beliebigen Mengen von Zwischenprodukten angeordnet werden und somit kann in bis Skalierung verwendet werden. Der Fortschritt der Synthese wird durch TLC und HPLC-sec, und sowohl der Zusammensetzung und Aktivität der Nano Arzneimittel durch gruppenspezifische quantitative chemische Assays, ELISA und einer Vielzahl von physikalischen Messungen gesteuert. Unsere Erfahrung ist, dass diese Synthesen reibungslos und reproduzierbar mit sehr guten Ausbeuten und Reinheit fortgeschritten ist. Durch die Wahl der Spezifität der Antikörper und Antisense-Oligonukleotide jede Variante des Nano Medikament positiv synthetisiert, wie in pe benötigtrsonalized Medizin. Die Modalitäten für die erfolgreiche Behandlung von menschlichen HER2-positiven Brustkrebs sind gültig Vertreter für die Vorbereitung der Maus Krebsmodellen, die Anwendung von Nano-Medikamente, Imaging und Analyse des Tumorwachstums. Die Ergebnisse der in-vitro-Vitalitätstests sind nützlich bei der Auswahl der Zelllinie und die führende Medikament im Tierversuch eingesetzt werden. In-vivo-Bildgebung Xenogens bestätigt, dass die Nano-Medikament ist in der Tat in den Tumor geliefert. Ergebnisse der Western-Blot zeigt, ob das Niveau von bestimmten Proteinen reagierte in der vorhergesagten Weise während der Krebsbehandlung. Die Messung der Tumorgröße informiert über den Erfolg der Behandlung, dh eine Hemmung, Rezession oder Regression. Das beschriebene Beispiel spiegelt unsere Erfahrungen mit anderen Polyäpfelsäure-basierten Nano Drogen, die einen hohen Grad an Vorhersagbarkeit, Reproduzierbarkeit und bemerkenswerte Abwesenheit von Toxizität. Neuere Ergebnisse über die Toxizität und Wirksamkeit von mehreren targeted Polyäpfelsäure Konjugate für triple-negativen Brustkrebs-Behandlung sind in starke Unterstützung dieses Begriffs 18. Ein wesentliches Merkmal ist, dass unsere nano Medikament ist in der Lage, Bio-Barrieren durchdringen: die endotheliale Barriere durch Extravasation in den Tumor interstitielle, die Tumorzelle Membran durch Endosomen Aufnahme und Endosommembran Störung durch die Wirkung der Leucin-Ethylester oder Trileucin Gruppen. Extravasation und Endosomen-Aufnahme werden zuverlässig durch die spezifischen Antikörper in den Nano-Medikament befestigt erreicht. Anti-Maus-Antikörper, Transferrin-Rezeptor vermittelt effiziente Zustrom in den Tumor transzytotisch, wahrscheinlich, weil der Rezeptor auf den meisten Tumorgefäßsystem überexprimiert. Eine andere Antikörper auf den gleichen nano Konjugatmolekül Funktionen speziell die Leitung der Nano Medikament in den Empfänger Tumorzelle angebracht. Die Anwesenheit beider Antikörper, der eine für Transzytose und die andere für Endosom Aufnahme, die für eine optimale Funktion. Quantitative Analyse von malic Säure und Antikörper wird empfohlen, um die optimale Zusammensetzung der Nanodrogenkontrolle empfohlen. Abschließend sei darauf hingewiesen, dass die all-in-one kovalente Nano Droge liefert Medikament in Form chemisch gebunden auf dem Weg über den Host-Gefäßsystem in den Empfänger Tumorzelle werden. Chemische Anbindung macht die meisten Medikamente inaktiv (Prodrugs), bis sie als freie Arzneimittel durch Spaltung aus dem nano-Konjugat-Plattform an der Zielstelle rekonstituiert werden. Dies ist wichtig, weil die Reaktivierung Modalität bietet ein hohes Maß an Sicherheit bei der Lieferung und eine minimale Chance, um schädliche Nebenwirkungen hervorzurufen. Vielseitigkeit, Wirksamkeit und Sicherheit sind unverzichtbare Attribute des guten personalisierten Medizin.

In der post-genomischen Ära, in der Genome von Krebs wurden aufgeklärt (National Center for Biotechnology und The Cancer Genome Atlas), zukünftige Behandlung von Krebs wird für die genetische Vielfalt von Tumoren oft innerhalb der gleichen Tumor 4.1 zu berücksichtigen. Bioinformatik und schnell, nicht teuer DNA-Sequenzierung ermöglicht die Erfassung von malignen Gene / Mutationen auf einer persönlichen Ebene 2,4,5. Sobald die Gene identifiziert wurden, werden die Patienten mit der personalisierten Medizin zu ändern oder zu Schweigen ihrer Expression von Genen malignen 6 behandelt werden. Die Notwendigkeit, die gezielt Krebszellen und liefern Medikamente in diese Zellen fordert polyfunktionellen Delivery-Systeme. Offensichtlich kann diese Anforderung nano Drogen 7 erfüllen. In einer wogenden Welle von Entdeckungen haben Nanopartikel geeignet, Nutzlasten von Chemotherapeutika, Proteinen und / oder genetisch aktives Material, um Krebszellen zu bringen bewährt. Bleiben jedoch negative Auswirkungen auf die Anzeige seingekleidet. Einer von ihnen auf die Abwesenheit der biologischen Abbaubarkeit Zusammenhang kann die Abscheidung von Material in gesunden Geweben und Organen verursachen, die Wahrscheinlichkeit zu Krankheiten hervorrufen. Um die Abscheidung zu minimieren, haben wir nicht toxisch und nicht immunogen Polyäpfelsäure, die mikrobiellen Ursprungs und biologisch abbaubar ist, um H 2 O und CO 2 8. Wir verwenden das Polymer, All-in-One-kovalente Art von Nanodrogen synthetisieren. Es enthält chemisch gebunden Chemotherapeutika wie Temozolomid, Doxorubicin oder Antisense-Oligonukleotide und Funktionsgruppen dienen Extravasation, Gewebe-Targeting, endosomolytischen Lieferung. Die Medikamente sind untrennbar von der Nano-Plattform gespalten, als sie ankamen in der gezielten Tumorzelle, wodurch ihre volle pharmazeutische Aktivität regenerieren. Wir beschreiben das Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Polymernano Plattform, ihre Reinigung und die chemische Synthese eines Nano Medikament, Trastuzumab (Herceptin) für Krebs enthältTargeting und ein Antisense-Oligonukleotid zur Hemmung von HER2 Über. Bei der Anwendung der Nano-Medikament zur xenogenen menschlichen Her2-positivem Brustkrebs auf Nacktmäuse zeigen wir, eine hohe Wirksamkeit der Krebsbehandlung. Die Prinzipien der Tumor Targeting-und Gen-Silencing für Polyäpfelsäure Nano Drogen hier eingeführt wird, kann in der Behandlung von anderen Krebserkrankungen eingesetzt werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="935">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:263px;">Company</td>
			<td style="width:187px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:79px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercapto-1-ethylamine (Cysteamine (2MEA)</td>
			<td style="width:263px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:187px;">30078-25G</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td colspan="2">Vector Laboratories, Burlingame, CA</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">90-Day release 17&#946;-estradiol pellet&#160;</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 680 C2 maleimide</td>
			<td style="width:263px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:187px;">A20344</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amberlite IR 120H</td>
			<td style="width:263px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:187px;">6428</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">Antifoam Y-30 Emulsion</td>
			<td style="width:263px;">Sigam-Aldrich</td>
			<td style="width:187px;">A5758</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">Anti-laminin-411 chain mAbs</td>
			<td style="width:263px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:187px;">SC-59980</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">Anti-pAkt mAb</td>
			<td style="width:263px;">Cell Signalling</td>
			<td style="width:187px;">9271S</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">Anti-PARB mAb</td>
			<td style="width:263px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:187px;">556494</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-von Willebrand Factor antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:187px;">AB6994</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">Bacto Yeast Extract</td>
			<td style="width:263px;">Bacto, Dickinson/Sparks, MD</td>
			<td style="width:187px;">212720</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beta-actin</td>
			<td style="width:263px;">Cell Signalling</td>
			<td style="width:187px;">3700</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BT-474&#160;</td>
			<td style="width:263px;">ATCC</td>
			<td style="width:187px;">HTB-20</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">Calcium Carbonate</td>
			<td style="width:263px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:187px;">36337</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Proliferation Assay kit</td>
			<td>Promega, Madison, WI, USA</td>
			<td>PR-G3580</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centriplus 100&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:187px;">4414</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dicyclohexylcarbodimide</td>
			<td style="width:263px;">Fluka</td>
			<td style="width:187px;">36650</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:263px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:187px;">D5796</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eosin</td>
			<td style="width:263px;">Cardinal Health</td>
			<td style="width:187px;">S7439-4</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Galardin (MMP-inhibitors)&#160;</td>
			<td style="width:263px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:187px;">SC-994</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GAPDH</td>
			<td style="width:263px;">Cell Signalling&#160;</td>
			<td style="width:187px;">2118</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hematoxilin</td>
			<td style="width:263px;">Cardinal Health</td>
			<td style="width:187px;">S7439-3</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">Hemin from porcine</td>
			<td style="width:263px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:187px;">51280</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">Herceptin</td>
			<td style="width:263px;">Genentech</td>
			<td style="width:187px;">15534</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">Herceptin (Western blotting)</td>
			<td style="width:263px;">Cell Signalling</td>
			<td style="width:187px;">2165S</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">IgG2a-kappa murine malignoma</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">M77695X5m</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immun-Star AP Substrate Pack</td>
			<td style="width:263px;">Biorad</td>
			<td style="width:187px;">170-5012</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immun-StarTM AP Substrate Pack&#160;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-5012</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">LAL Reagent water&#160;</td>
			<td style="width:263px;">Lonza, MD</td>
			<td style="width:187px;">W50-1000</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin-411 mAbs</td>
			<td style="width:263px;">Abcam</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leucine ethyl ester (LOEt)</td>
			<td style="width:263px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:187px;">61850-10G-F</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Limulus Amebocyte Lysate (LAL) PYROGENT-5000 tests</td>
			<td style="width:263px;">Cambrex BioScience</td>
			<td style="width:187px;">N384</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">Lissamin-Morpholino AON</td>
			<td style="width:263px;">Gene Tools</td>
			<td style="width:187px;">Custom made</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-malic acid&#160;</td>
			<td style="width:263px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:187px;">M6413</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Malate dehydrogenase&#160;</td>
			<td style="width:263px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:187px;">M2634</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mal-PEG-Mal</td>
			<td style="width:263px;">Laysan</td>
			<td style="width:187px;">mal-PEG-mal-3400</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td style="width:187px;">354248</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Milk, nonfat powdered&#160;</td>
			<td style="width:263px;">Proteomics</td>
			<td>M203-10G</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Morpholino oligonucleotides&#160;</td>
			<td style="width:263px;">GeneTools</td>
			<td style="width:187px;">custom made</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">mPEG5000</td>
			<td style="width:263px;">Lysan</td>
			<td style="width:187px;">mPEG-NH2-5000</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-hydroxysuccinimde (NHS)&#160;</td>
			<td style="width:263px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:187px;">15727100</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">Ninhydrin</td>
			<td style="width:263px;">Merck</td>
			<td style="width:187px;">1.06762.0100</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC2001</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich, 0.45 &#181;m&#160;</td>
			<td style="width:263px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:187px;">LC2001</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Novex &#174; Tris-Glycine Transfer Buffer (25X)&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC3675</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Nude Mice [Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm]&#160;</td>
			<td>Taconic</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">PBS pH 7.2 10x</td>
			<td style="width:263px;">Gibco</td>
			<td style="width:187px;">10010-49</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">PBS pH 7.2 1x</td>
			<td style="width:263px;">Gibco</td>
			<td style="width:187px;">70013</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD-10 desalting columns</td>
			<td style="width:263px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:187px;">17-0851</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Physarum polycephalum M3CVII</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>204388</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pierce BCA protein assay&#160;</td>
			<td style="width:263px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:187px;">23225</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:263px;">Roche</td>
			<td style="width:187px;">1.18362E+11</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein Detector ELISA Kit</td>
			<td style="width:263px;">KPL</td>
			<td style="width:187px;">54-62-18</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sephadex G-25 superfine</td>
			<td style="width:263px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:187px;">17-0031</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sephadex G-75&#160;</td>
			<td style="width:263px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:187px;">17-0050</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sephadex-LH20&#160;</td>
			<td style="width:263px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:187px;">17-0090</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SKBR-3&#160;</td>
			<td style="width:263px;">ATCC</td>
			<td style="width:187px;">HTB-30</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPDP</td>
			<td style="width:263px;">Proteochem&#160;</td>
			<td style="width:187px;">C1116</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streamline-DEAE</td>
			<td style="width:263px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:187px;">17-0994</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Styryl Red FM 1-43&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:187px;">T-3163</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TBS 10x</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6435</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCEP</td>
			<td style="width:263px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:187px;">C4706-2G</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TLC, silica coated aluminia sheets</td>
			<td style="width:263px;">Merck, Darmstadt, DE</td>
			<td style="width:187px;">60F254</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trileucine (LLL)</td>
			<td style="width:263px;">Bachem</td>
			<td style="width:187px;">H-3915</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-114&#160;</td>
			<td style="width:263px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:187px;">X114</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween&#174;20&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vivaspin 20&#160;</td>
			<td style="width:263px;">VWR</td>
			<td style="width:187px;">14005-302</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:407px;">DAPI</td>
			<td style="width:263px;">Vector Laboratories, Burlingame, CA</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dexmedetomidine</td>
			<td style="width:263px;">Pfizer</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Atipamezole</td>
			<td style="width:263px;">Pfizer</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carprofen</td>
			<td style="width:263px;">Pfizer</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Betadine</td>
			<td style="width:263px;">Foster and Smith, Wisconsin</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polymalic acid-based nano biopolymers for targeting of multiple tumor markers: an opportunity for personalized medicine?

Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this diversity, personalized medicine is developed for silencing malignancy associated genes. Nano drugs fit these needs by targeting tumor and delivering antisense oligonucleotides for silencing of genes. As drugs for the treatment are often administered repeatedly, absence of toxicity and negligible immune response are desirable. In the example presented here, a nano medicine is synthesized from the biodegradable, non-toxic and non-immunogenic platform polymalic acid by controlled chemical ligation of antisense oligonucleotides and tumor targeting molecules. The synthesis and treatment is exemplified for human Her2-positive breast cancer using an experimental mouse model. The case can be translated towards synthesis and treatment of other tumors.

Die Hemmung des menschlichen HER2-positivem Brustkrebs durch Schweigen HER2-Rezeptor-Expression und Sperr HER2-Signalgebung 12 Strategie Unter den verschiedenen Formen von menschlichem Brustkrebs, HER2-positiven Tumoren haben die schlechtesten klinischen Ergebnis. Wir präsentieren die erfolgreiche Behandlung von HER2-Überexpression menschlichen Brustkrebs in der Nacktmaus-Modell. Die Strategie beinhaltet die Nano Droge sowohl in der unmittelbaren Silencing des HER2-Signalweg Einsatz Herceptin und HER2-spezifischen AON zum Blockieren des HER2-mRNA-Synthese in Abhängigkeit des Rezeptors (Abbildung 1) aktiv. Die Bleinano Konjugat, das Herceptin und Anti-HER2 AON enthält, ist in Fig. 3 zusammen mit zwei Kontrollen, die frei von entweder Herceptin oder AON gezeigt. Die Bleiverbindung enthalten anti-MsTfRmAb aktive Extravasation transzytotisch thro erreichenugh Bindung an TfR der Tumorgefäße Endothelzellen. Viel geringer Aufnahme in den Tumor wurde in Abwesenheit des Antikörpers wurde notiert und die Tumor abhängig EPR-Effekt 13 zurückzuführen. Leuchtstoffversionen der Nano Konjugate, die Alexa Fluor 680 wurden für die bildgebenden Studien synthetisiert. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50668/50668fig1highres.jpg" width="500" /> . Abbildung 1 Mechanismus der AON Lieferung in HER2-positiven Brustkrebszellen und Tumorwachstumshemmung Linke obere Ecke:. Nano-Konjugat aus 3 angepasst. Linke untere Ecke: Maus exprimieren Tumorgefäße TfR auf der Oberfläche. Die Nano Medikament an den Rezeptor bindet und in den Tumor durch Transzytose. Darüber hinaus ist ein gewisser Grad von Zugriff auf den Tumor durch die ungeordneten Schichten Endothelzellen, die in Tumor teilnehmen abhängig wodurch die Aufnahme und retenti möglichauf (EPR) 13. Weiter bindet das nanodrug HER2 exprimiert auf den menschlichen Krebszellen und in frühe Endosomen internalisiert. Binding blockiert auch HER2-Signalweg. Nach der Reifung der Endosomen und ihre Versauerung wird die Endosomen Escape-Mechanismus der Nano Medikament aktiviert. Nanodrug in das Zytoplasma von Nano Plattform durch reduktive Spaltung der Disulfid-Abstands freigesetzt und bindet an HER2-mRNA blockieren HER2-Synthese. Blockierung der Synthese erstreckt Sperrung von HER2-Signalgebung und induziert Hemmung des Tumorwachstums. Mikrobielle Produktion der Polyäpfelsäure Plattform Die Nano-Konjugat-Plattform, Polyäpfelsäure (PMLA) wurde durch kultivierte microplasmodia von Physarum polycephalum und aus der Brühe nach dem Protokoll beschrieben und in Fig. 2 dargestellt gereinigten hergestellt. Herstellung und Reinigung waren glatt und reproduzierbar. Es war wichtig, cont<html> rol Zeit, pH-Wert und Temperatur auf die spontane Spaltung des Polymers zu vermeiden. Sorgfältiges Waschen und Elution der DEAE-Säule, um die DNA, Kohlenhydrate, Toxine und farbigen Materials zu entfernen empfohlen. Extreme Reinheit wurde nach Lösen in wasserfreiem Aceton und Entfernen von unlöslichen Material erhalten. Gesamtbetrag der produzierten PMLA war 5 ± 1 g pro Kampagne. Mengen von 1,5 ± 0,5 g hochgereinigten PMPLA von M w 80.000-100.000 wurden reproduzierbar, wenn Sie die 10-l-Bioreaktor erreicht. SEC-HPLC-Elutionsprofile waren symmetrisch. Dynamische Lichtstreuungsanalyse nach Anzahlverteilung zeigte einen einzelnen Peak, der einem hydrodynamischen Durchmesser von 8 ± 1 nm und einem Polydispersitätsindex PDI = 0,10 ± 0,02, von der Gerätesoftware übernommen für kugelförmige Partikel berechnet wird. Zetapotential betrug -22 ± 2 mV (pH 7.5). / 50668/50668fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; 2. Herstellung und Reinigung von Polymaleinsäure aus kultivierten Mikro Plasmodien von Physarum polycephalum (von Lee et al. 9 angepasst). Polyäpfelsäure (PMLA) von Plasmodien Physarum polycephalum in einem Bioreaktor hergestellt und aus dem Kulturüberstand durch Bindung an Anionenaustauscher (DEAE) gesammelt. Das Elutionsmittel wird als Calciumsalz in Ethanol ausgefällt. Lösungen des Calciumsalzes sind über Sephadex-G25-Mw fraktioniert. PMLA haltigen Fraktionen werden aus dem Ca-Salz in die Säure über Amberlite IR-120H + umgewandelt. Die kostenlose PMLA schließlich gefriergetrocknet, um trockenes, weißes Pulver erhalten. Chemische Synthese des Leiternano Konjugat P / mPEG 5000 (5%) / Loet (40%) / AON (2,5%) / Herceptin (0,2%) / a<html> nti-MsTfRmAb (0,2%) Die schematischen Strukturen des Leiternano Medikament und von zwei Vorläufer nano-Konjugate sind in Abbildung 3 dargestellt. Das Blei enthält alle Bestandteile, während die Vorläufer wurden entwickelt, um entweder AON HER2 oder den Antikörper Herceptin fehlt. Neben AON und mAbs, die Verbindungen enthalten Polyethylenglykol, mPEG 5000, Bindung an Plasmaproteinen zu minimieren, Freigabe durch die retikuloendothelialen Systems (RES) und dem Abbau durch enzymatische Spaltung. Das Antisense-Sequenz 5&#39;-CAT-GGT-GCT-CAC-TGC-GGC-TCC-GGC-3 &#39;war komplementär zu mRNA Her2 und wurde sorgfältig in vitro auf mehreren HER2-exprimierenden Zelllinien getestet, um eine hohe Spezifität zu blockieren HER2 erhalten Synthese und nicht zeigen, Off-Target-Effekte. 8/50668fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Abbildung 3. Nano-Konjugate für die menschliche Behandlung von HER2-positivem Brustkrebs zu behandeln. Führende Drogen nano (oben Struktur) enthält zwei Medikamente (Herceptin, AON HER2). Versionen 2 und 3 enthalten nur eines der Medikamente. Aufnahme von 1 und 2 in menschlichen HER2-überexprimierende Tumorzellen wird durch die Bindung von Herceptin verwaltet. Nano-Konjugat 3, die nicht Herceptin enthält, erhalten Anti-HuTfRmAb für Endosomen Aufnahme durch die menschlichen Zellen. Die Konjugation mit Alexa Fluor 680 war optional zur Bildgebung. Der rote Balken stellt die Nano Konjugat-Plattform-PMLA / Loet (40%). % Gibt den Anteil der Äpfelsäurereste an der Bindung der angegebenen Liganden (Gesamtmenge der Äpfelsäurereste in der nanodrug = 100%) verzehrt. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50668/50668fig4highres.jpg" width="500" /> 4. Chemische Synthese von NanoKonjugate P / Loet / AON HER2 / anti-MsTfR/Herceptin Von oben nach unten: Synthese von PMLA-N-Hydroxy succinimidylester (PMLA-NHS) der Anhänger Carboxylate (chemische Aktivierung).. Ersatz von NHS durch Amidbildung mit 2-Mercapto-1-Aminoethan (2-MEA), Methyl-PEG 5000-Amin (mPEG 5000-NH 2), Trileucin (LLL) oder Leucin ethylester (Loet). Diese &quot;preconjugate&quot; legt mAb-Mal-PEG-Mal durch Thioether Bildung und AON durch Bildung von Disulfidbrücken spaltbar. Leftover 2-MEA wird verschlossen Bildung amidoethyl-Dithio-Propionsäure. Nur Anbringung eines einzigen mAb gezeigt. Mehrere Anhänge werden durch Verwendung von Mischungen von mAb verwaltet. Prozentual% bedeutet Fraktionen von Carboxylaten zu verschiedenen Liganden (100% kostenlos PMLA) gebunden. Die Nano-Konjugate wurden synthetisiert, wie in Abbildung 4 dargestellt. Das berechnete Molekulargewicht des LeitungsKonjugat war 719.000. Die Gesamtausbeute der Synthese betrug 45 ± 5% bezüglich der Äpfelsäure-Gehalt. Im Durchschnitt der 862 Malyl Einheiten (= 100%) der 100 kDa PMLA Plattform ausgeführt Loet 40%, 5% mPEG, 2% AON 2%, 0,2% und 0,2% Herceptin Anti MsTfR mAb. Die Menge für jeden Antikörper entsprach durchschnittlich 1,7 Moleküle pro Molekül des PMLA Plattform. Die% ausgelegt und die% von Gruppe-Analyse verifiziert waren die gleichen, innerhalb von ± 5%. Ein Beispiel ist die in Tabelle 1 für die Berechnung der experimentellen Gehalt an Äpfelsäure, AON-mAb und MPEG 5000 und in Tabelle 2 zeigt den Vergleich mit dem Inhalt von Auslegungsfall. Die hohe Reinheit nach den Kriterien in Abschnitt 3 wurde auf der Grundlage der hohen Reaktionsausbeuten und effiziente Trennung durch Größenausschluss (z. B. freie mAb und mAb-nanoconjugate werden von 1 min auf s-HPLC) und selektive Löslichkeit in Lösungsmitteln gelöst. Die Aktivität der monoklonalen Antikörper war<html> gezeigt, während Nanowirkstoffsynthese zurückgehalten werden, und es wurde bestätigt, dass die beiden Arten von Antikörpern sind auf dem gleichen Polymerplattform montiert. Das Ergebnis der atypischen ELISA-Experiment ist in Abbildung 5 dargestellt. Im Allgemeinen waren die Assays für die quantitative Analyse Gruppe Äpfelsäure, AON, Protein und PEG für ELISA robust, wodurch reproduzierbare Ergebnisse, wenn sie von unterschiedlichem Personal und Instrumente nicht nur im Fall der beschriebene Synthese durchgeführt wird, sondern auch, wenn für die Analyse verwendet andere Nanokonjugate synthetisiert. <img alt="Tabelle 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50668/50668table1.jpg" width="600" /> Tabelle 1. Berechnung der nanodrug Zusammensetzung mit Bezug zu Apfelsäuregehalt. 668table2.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Tabelle 2. Vergleich von experimentellen Nano-Wirkstoffzusammensetzung mit entworfen Zusammensetzung. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50668/50668fig5highres.jpg" width="500" /> Figur 5 ELISA. Zur Messung der Antikörperaffinität nach der chemischen Synthese, und zur Demonstration der Bindung von mehreren verschiedenen Antikörpern. Die Nano Medikament enthält Antikörper mAb (A) und dem Antikörper mAb (B) gegen die Antigene A und B sind. ELISA-Platten mit Antigen (A) beschichtet. Kostenlose mAb (A), freie mAb (B), und Nanodrogen werden ELISA-Platten aufgebracht. Nach dem Waschen werden die sekundären Antikörper mit Peroxidase-gekoppelten mAb spezifisch für entweder (A) oder mAb (B)-Antikörper getestet, und nur mAb (A) wird an das Antigen (A) gebunden. Es ist ersichtlich, dass der freie und Nano Arzneimittel konjugiert mit mAb (A) und indirekt konjugierten mAb (B) der gleichen nano Wirkstoffmolekül, aber nicht frei mAb (B), Auf der Platte gehalten. Die Konzentrationsabhängigkeit zeigt vergleichbare Bindungsaffinitäten für freie und konjugierte mAb (A), was darauf hinweist, dass die chemische Konjugation hatte keinen Einfluss auf Antikörper-Bindungsaktivität. Auch die Co-Ligation von mAb (B) mit mAb (A) auf der gleichen physischen Einheit (Nano-Plattform) zu Antikörper mAb (B) Detektion. Die hier gezeigten Versuchsergebnisse beziehen sich auf Anti-Human TfRmAb (A) und anti-Maus-TfRmAb (B). Ähnliche Ergebnisse wurden für andere Antikörper-Paare getestet, wie Anti MsTfR mAb und Anti-HER2-mAb (Herceptin) gezeigt. Die physikalisch-chemischen Untersuchung zeigte hydrodynamischen Durchmesser von 22,1 ± 2,3 nm für P / mPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / Herceptin (0,2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) (Blei, das Zwei Arzneimittel-Version), 20,1 ± 2,4 nm für P / mPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) / anti-HuTfRmAb (0,2%) (der AON Medikament Version) , und 15,1 ± 1,2 nm für P / mPEG (5%) / Loet (40%) / Herceptin (0,2%) (die Droge Herceptin Version). Zeta-Potential bei pH 70,5 waren in dieser Reihenfolge -5,2 ± 0,4 mV, -5,7 ± 0,6 mV und -4,1 ± 0,4 mV. Es sollte erwähnt werden, dass der gemessene hydrodynamischen Durchmesser von Nano-Konjugate nicht folgen Additivität der Durchmesser für freie Komponenten gemessen. Lieferung von Nano-Arzneimittel durch die Tumor Zellmembran und Freisetzung in das Zytoplasma nach 0 h und 3 h r Die Lieferung von Nano Arzneimittels durch die Zellmembran durch Endosom Aufnahme ist in Abbildung 6 gezeigt, nach 0 Stunden und 3 Stunden. Fluoreszenz-Etiketten werden in den Nano-Wirkstoffplattform (Alexa Fluor 680, grün) und AON (Lissamin, rot) angebracht. Deren Überlagerung in Platten D und L zusammen mit der Fluoreszenz des markierten Endosomen (blau) in Platten G &amp; O. gezeigten Pearson-Korrelationskoeffizienten (R (r) wurden von den Bildern über die Co-Lokalisierung der Plattform / Endosomen, AON / Endosomen-Plattform / AON für 0 h und 3 Stunden. T berechneter 3 Stunden angegeben Bildmitteilung von Endosomen in das Zytoplasma und Dissoziation von AON von der Nano-Medikament von Glutathion-abhängigen Disulfid-Spaltung im Zytoplasma. <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50668/50668fig6highres.jpg" width="500" /> Abbildung 6. Konfokale Mikroskopie für Nano-Konjugat-Aufnahme durch die Zielzellen (von Ding et al. 11 angepasst). Zellen wurden 30 min bei 37 ° C mit Nano Medikament, wurde doppelt mit Alexa Fluor 680 (grün) in der Polymerplattform und mit Lissamine (rot) markiert AON angebracht war, inkubiert. Darüber hinaus wurden Endosomen mit FM1-43 (blau) gefärbt. Der Ort ist nach 0 h (A) und 3 h (B) Inkubation gezeigt. Felder A, ab, &amp; B, ij Show Färbung durch die Nano-Konjugat Fluorophore allein, undihre Co-Lokalisation in A, cd &amp; B, kl. Zusätzlich wird Färbung von Endosomen in den Feldern A, E &amp; B, m und die Co-Lokalisation von Nano-Konjugat und endosomesin Platten A, gezeigt fg &amp; B, nein. Panels A, h &amp; B, S. Show Phasenkontrast für die jeweiligen Panels. (C) Pearson-Korrelationskoeffizienten R (r) für die Co-Lokalisation von Plattform-Endosomen, AON-Endosomen, Plattform-AON für 0 h und 3 h berechnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50668/50668fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Hemmung der humanen Brustkrebs in vitro und in vivo In-vitro-Wachstumshemmung von HER2-Überexpression Zelllinie BT-474 in comVergleich mit niedrig exprimierenden Zelllinie MDA-MB-231 ist in Abbildung 7 dargestellt. Grad der Hemmung 50% und 30%, bzw. von der Leitung Nano Konjugat P / MPEG / Loet / AON HER2 / Herceptin / Anti MsTfRmAb. Inhibition von anderen Verbindungen weniger, aber höher für BT-474 als für MDA-MB-231-Zellen. BT-474-Zelllinie wurde für die Behandlung von Brustkrebs xenogenen Maus gewählt. <img alt="Fig. 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50668/50668fig7highres.jpg" width="500" /> Figur 7. In vitro Wachstumshemmung von HER2-überexprimierenden BT-474-Brustkrebszellen und niedrig exprimierenden MDA-MB-231-Zellen. Vergleich der Wachstumshemmung für HER2 überexprimieren, BT-474-Brustkrebszelllinie (von Inoue et al. 12 angepasst) ( links) und von HER2 exprimieren niedrige Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 (rechts). TfR (n) bezeichnet Anti-MsTfRmAb und TfR (Hu / Frau) bezeichnet Anti-HuTfRmAb &amp; Anti-MsTfRmAb. Das Blei nano Droge, P / MPEG / Loet / AON HER2 / Herceptin / TfR (Ms) und nano frei von Drogen entweder Herceptin oder AON HER2 werden mit PBS, Herceptin und AON HER2 verglichen. In Abwesenheit von Herceptin, Anti MsTfRmAb wurde konjugiert an Endosom Aufnahme durch die Tumorzellen bereitzustellen. Konzentrationen waren 40 ug / ml im Hinblick auf Antikörper, 4 &amp;mgr; M im Hinblick auf die AON HER2, 4 uM endoporter (Anwendung von AON). Bedeutung von * bezeichnet, P &lt;0,05: ** p &lt;0,02: *** p &lt;0,003 im Vergleich mit PBS. Die Ergebnisse der in vivo-Behandlung in 8 Mäusen, die für BT-474 Her2-überexprimierenden humanen Brustkrebs dargestellt. Das Wachstum wurde durch die Führung nanodrug enthält Herceptin und HER2-spezifischen AON im Vergleich zu Kontrollen nur mit PBS (Abb. Abbildung 8) behandelt gehemmt&gt; 95%. Hemmung60% oder weniger mit Herceptin allein, P / MPEG / Loet / Herceptin oder P / MPEG / Loet / AON / anti-MsTfRmAb / anti-HuTfRmAb. Western-Blot-Analyse von Tumorextrakten zeigte Hemmung sowohl HER2-Synthese und Akt Phosphorylierung, aber keine Änderung der Gesamt Akt und Hauswirtschaft Enzym GAPDH. PARP wurde in Übereinstimmung mit einem erhöhten Niveau der Apoptose gespalten. Bilder von Tumor nach der Behandlung und Gewebeschnitte mit H &amp; E-gefärbten Tumorregression Veranschaulichung sind in Abb. Abbildung 9 dargestellt. <img alt="Fig. 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50668/50668fig8highres.jpg" width="500" /> Figur 8. Tumorgröße und Proteine ​​während der Behandlung mit Blei-und Vorläufernano Drogen (von Inoue et al. 12 angepasst). A. Tumorgröße für die verschiedenen Behandlungen (Tag 21 bis Tag 42, insgesamt 8 Injektionen). Die Balken zeigen StandardAbweichungen vom Mittelwert. Das Blei mit Anti-Her2 AON und Herceptin konjugiert überlegen war, entweder allein oder Herceptin einziges Medikament mit Nano-Konjugate. B. Wirkung der verschiedenen Behandlungen auf die Expression von HER2, phosphoryliert Akt, Gesamt Akt, PARB, gespalten PARB und GAPDH durch Western-Blot gezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50668/50668fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50668/50668fig9highres.jpg" width="500" /> Abbildung 9. Behandlung von HER2-positivem BT-474 menschlichen Brustkrebs auf Nacktmäusen. Tumorrückbildung und Nekrose / Apoptose in Gewebeschnitten (von Ionue et al. 12 angepasst). Obermaterial: Schrumpfung des Tumors (rote Pfeile). Anzeige der Östrogen-Pellet, das Tumorwachstum (blauer Pfeil) unterstützen. Lower: Hämatoxilin &amp; Eosin (H &amp; E)-Färbung von Tumorschnitte. Proliferierende Tumor wird durch die dichte Packung von Tumorzellen gezeigt. Nekrotischen Gewebes ist zu sehen, wo Tumorzellen eliminiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50668/50668fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Polymalic Acid-based Nano Biopolymers for Targeting of Multiple Tumor Markers: An Opportunity for Personalized Medicine?

Ein Beispiel für ein Medikament, das auf Nano Polymaleinsäure ist auf das rationale Design personalisierte Medizin, die für Krebs ist dargestellt. Es beschreibt die Synthese von Nano Medikament Her2-positiven menschlichen Brustkrebs in einer Nacktmaus zu behandeln.

Polyäpfelsäure-basierten Nano Biopolymere für Targeting mehrerer Tumormarker: Eine Chance für die personalisierte Medizin?

Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

16.5K Aufrufe.  Cedars-Sinai Medical Center.  Ein Beispiel für ein Medikament, das auf Nano Polymaleinsäure ist auf das rationale Design personalisierte Medizin, die für Krebs ist dargestellt. Es beschreibt die Synthese von Nano Medikament Her2-positiven menschlichen Brustkrebs in einer Nacktmaus zu behandeln. 

Serie: Polymalic Acid-based Nano Biopolymers for Targeting of Multiple Tumor Markers: An Opportunity for Personalized Medicine?

Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and extracellular events. Many pathological conditions, notably cancer, affect gene expression, which can in turn deregulate the relative abundance and activity levels of glycoside hydrolase and glycosyltransferase enzymes. Unique aberrant whole glycans resulting from deregulated glycosyltransferase(s) are often present in trace quantities within complex biofluids, making their detection difficult and sometimes stochastic. However, with proper sample preparation, one of the oldest forms of mass spectrometry (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) can routinely detect the collection of branch-point and linkage-specific monosaccharides ("glycan nodes") present in complex biofluids. Complementary to traditional top-down glycomics techniques, the approach discussed herein involves the collection and condensation of each constituent glycan node in a sample into a single independent analytical signal, which provides detailed structural and quantitative information about changes to the glycome as a whole and reveals potentially deregulated glycosyltransferases. Improvements to the permethylation and subsequent liquid/liquid extraction stages provided herein enhance reproducibility and overall yield by facilitating minimal exposure of permethylated glycans to alkaline aqueous conditions. Modifications to the acetylation stage further increase the extent of reaction and overall yield. Despite their reproducibility, the overall yields of N-acetylhexosamine (HexNAc) partially permethylated alditol acetates (PMAAs) are shown to be inherently lower than their expected theoretical value relative to hexose PMAAs. Calculating the ratio of the area under the extracted ion chromatogram (XIC) for each individual hexose PMAA (or HexNAc PMAA) to the sum of such XIC areas for all hexoses (or HexNAcs) provides a new normalization method that facilitates relative quantification of individual glycan nodes in a sample. Although presently constrained in terms of its absolute limits of detection, this method expedites the analysis of clinical biofluids and shows considerable promise as a complementary approach to traditional top-down glycomics.

This article presents an enhanced form of a novel bottom-up glycomics technique designed to analyze the pooled compositional profile of glycans in unfractionated biofluids through the chemical breakdown of glycans into their constituent linkage-specific monosaccharides for detection by GC-MS. Potential applications include early detection of cancer and other glycan-affective disorders.

Glycan Knoten Analyse: Ein Bottom-up-Ansatz Glycomics

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and ...

Forschung

Chemie

Highly Stable, Functional Hairy Nanoparticles and Biopolymers from Wood Fibers: Towards Sustainable Nanotechnology

Nanoparticles, as one of the key materials in nanotechnology and nanomedicine, have gained significant importance during the past decade. While metal-based nanoparticles are associated with synthetic and environmental hassles, cellulose introduces a green, sustainable alternative for nanoparticle synthesis. Here, we present the chemical synthesis and separation procedures to produce new classes of hairy nanoparticles (bearing both amorphous and crystalline regions) and biopolymers based on wood fibers. Through periodate oxidation of soft wood pulp, the glucose ring of cellulose is opened at the C2-C3 bond to form 2,3-dialdehyde groups. Further heating of the partially oxidized fibers (e.g., T = 80 &#176;C) results in three products, namely fibrous oxidized cellulose, sterically stabilized nanocrystalline cellulose (SNCC), and dissolved dialdehyde modified cellulose (DAMC), which are well separated by intermittent centrifugation and co-solvent addition. The partially oxidized fibers (without heating) were used as a highly reactive intermediate to react with chlorite for converting almost all aldehyde to carboxyl groups. Co-solvent precipitation and centrifugation resulted in electrosterically stabilized nanocrystalline cellulose (ENCC) and dicarboxylated cellulose (DCC). The aldehyde content of SNCC and consequently surface charge of ENCC (carboxyl content) were precisely controlled by controlling the periodate oxidation reaction time, resulting in highly stable nanoparticles bearing more than 7 mmol functional groups per gram of nanoparticles (e.g., as compared to conventional NCC bearing &#60;&#60; 1 mmol functional group/g). Atomic force microscopy (AFM), transmission electron microscopy (TEM), and scanning electron microscopy (SEM) attested to the rod-like morphology. Conductometric titration, Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), nuclear magnetic resonance (NMR), dynamic light scattering (DLS), electrokinetic-sonic-amplitude (ESA) and acoustic attenuation spectroscopy shed light on the superior properties of these nanomaterials.

Synthesis schemes to prepare highly stable wood fiber-based hairy nanoparticles and functional cellulose-based biopolymers have been detailed.

Hochstabile, funktionelle Hairy Nanopartikel und Biopolymere aus Holzfasern für eine nachhaltige Nanotechnologie

Nanoparticles, as one of the key materials in nanotechnology and nanomedicine, have gained significant importance during the past decade. While ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Synthese von Protein Biokonjugate<em&gt; über</em&gt; Cystein-maleimid Chemie

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Low-energy Cathodoluminescence for (Oxy)Nitride Phosphors

Nitride and oxynitride (Sialon) phosphors are good candidates for the ultraviolet and visible emission applications. High performance, good stability and flexibility of their emission properties can be achieved by controlling their composition and dopants. However, a lot of work is still required to improve their properties and to reduce the production cost. A possible approach is to correlate the luminescence properties of the Sialon particles with their local structural and chemical environment in order to optimize their growth parameters and find novel phosphors. For such a purpose, the low-voltage cathodoluminescence (CL) microscopy is a powerful technique. The use of electron as an excitation source allows detecting most of the luminescence centers, revealing their luminescence distribution spatially and in depth, directly comparing CL results with the other electron-based techniques, and investigating the stability of their luminescence properties under stress. Such advantages for phosphors characterization will be highlighted through examples of investigation on several Sialon phosphors by low-energy CL.

Low-energy Cathodoluminescence for OxyNitride Phosphors

An excellent chemical and luminescence stabilities of (oxy)nitride phosphors present it as an promising alternative to currently used sulfide and oxide phosphors. In this paper, we present the way to investigate its local luminescence properties using low-energy cathodoluminescence (CL).

Niederenergetische Kathodolumineszenz für (Oxy) Nitride Phosphore

Nitride and oxynitride (Sialon) phosphors are good candidates for the ultraviolet and visible emission applications. High performance, good stability and ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

Herstellung und Auswertung der<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-markierte Dreizähnige Chelate für Pre-Targeting Bioorthogonale Chemie

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...

An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III)

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples of gadolinium-based contrast agents as a result of incomplete reactions between the ligand and the ion, or as a dissociation product. Since the ion is toxic, its detection is of critical importance. Herein, the design and usage of an aptamer-based sensor (Gd-sensor) for Gd3+ are described. The sensor produces a fluorescence change in response to increasing concentrations of the ion, and has a limit of detection in the nanomolar range (~100 nM with a signal-to-noise ratio of 3). The assay may be run in an aqueous buffer at ambient pH (~7 - 7.4) in a 384-well microplate. The sensor is relatively unreactive toward other physiologically relevant metal ions such as sodium, potassium, and calcium ions, although it is not specific for Gd3+ over other trivalent lanthanides such as europium(III) and terbium(III). Nevertheless, the lanthanides are not commonly found in contrast agents or the biological systems, and the sensor may therefore be used to selectively determine unchelated Gd3+ in aqueous conditions.

An Aptamer-based Sensor for Unchelated GadoliniumIII

The use of polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) molecules for sensing unchelated gadolinium(III) ion in an aqueous solution is described. The presence of the ion is detected via an increase in the fluorescence emission of the sensor.

Ein Aptamer-basierten Sensor für unchelatisierte Gadolinium (III)

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples ...

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control cellular functions. The reversal of DNA methylation, or DNA demethylation, is mediated by the ten-eleven translocation (TET) protein family of dioxygenases. Although it has been widely reported that aberrant DNA methylation and demethylation are associated with developmental defects and cancer, how these epigenetic changes directly contribute to the subsequent alteration in gene expression or disease progression remains unclear, largely owing to the lack of reliable tools to accurately add or remove DNA modifications in the genome at defined temporal and spatial resolution. To overcome this hurdle, we designed a split-TET2 enzyme to enable temporal control of 5-methylcytosine (5mC) oxidation and subsequent remodeling of epigenetic states in mammalian cells by simply adding chemicals. Here, we describe methods for introducing a chemical-inducible epigenome remodeling tool (CiDER), based on an engineered split-TET2 enzyme, into mammalian cells and quantifying the chemical inducible production of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) with immunostaining, flow cytometry or a dot-blot assay. This chemical-inducible epigenome remodeling tool will find broad use in interrogating cellular systems without altering the genetic code, as well as in probing the epigenotype&#8722;phenotype relations in various biological systems.

Detailed protocols for introducing an engineered split-TET2 enzyme (CiDER) into mammalian cells for chemical inducible DNA hydroxymethylation and epigenetic remodeling are presented.

Ein veränderter Split-TET2 Enzym für chemische-induzierbaren DNA Hydroxymethylation und epigenetische Umbau

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent proteins and generation of fluorescent fusion proteins have been wildly used as an effective tool to directly visualize the protein localization and dynamics in cells. It is especially useful to compare them with well-known organelle markers after co-expression with the protein of interest. Nevertheless, classical approaches for protein co-expression in plants usually involve multiple independent expression plasmids, and therefore have drawbacks that include low co-expression efficiency, expression-level variation, and high time expenditure in genetic crossing and screening. In this study, we describe a robust and novel method for co-expression of multiple chimeric fluorescent proteins in plants. It overcomes the limitations of the conventional methods by using a single expression vector that is composed of multiple semi-independent expressing cassettes. Each protein expression cassette contains its own functional protein expression elements, and therefore it can be flexibly adjusted to meet diverse expression demand. Also, it is easy and convenient to perform the assembly and manipulation of DNA fragments in the expression plasmid by using an optimized one-step reaction without additional digestion and ligation steps. Furthermore, it is fully compatible with current fluorescent protein derived bio-imaging technologies and applications, such as FRET and BiFC. As a validation of the method, we employed this new system to co-express fluorescently fused vacuolar sorting receptor and secretory carrier membrane proteins. The results show that their perspective subcellular localizations are the same as in previous studies by both transient expression and genetic transformation in plants.

We have developed a novel method for co-expressing multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants to overcome the difficulties of conventional methods. It takes advantage of using a single expression plasmid that contains multiple functionally independent protein expressing cassettes to achieve protein co-expression.

Co Ausdruck von mehreren Chimären fluoreszierende Fusionsproteinen in effizienter Weise in Pflanzen

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Iron Nanowire Fabrication by Nano-Porous Anodized Aluminum and its Characterization

Magnetic nanowires possess unique properties that have attracted the interest of different fields of research, including basic physics, biomedicine, and data storage. We demonstrate a fabrication method for iron (Fe) nanowires&#160;via electrochemical deposition into anodic&#160;alumina oxide (AAO) templates. The templates are fabricated by anodization of aluminum (Al) discs, and the pore length and diameter are controlled by changing the anodizing conditions. Pores with an average diameter of around 120 nm are created using oxalic acid as the electrolyte. Using this method, cylindrical nanowires are synthesized, which are released by dissolving the alumina using a selective chemical etchant.

In this work, we describe a&#160;protocol to fabricate iron nanowires, including the formation of the porous alumina membrane that is used as the template, electrodeposition into templates using electrolyte solution, and the release of the nanowires into the solution.

Eisen-Nanodraht-Fertigung durch nanoporöses eloxiertes Aluminium und seine Charakterisierung

Magnetic nanowires possess unique properties that have attracted the interest of different fields of research, including basic physics, biomedicine, and ...

Organic Structure-directing Agent-free Synthesis for *BEA-type Zeolite Membrane

Membrane separation has drawn attention as a novel-energy saving separation process. Zeolite membranes have great potential for hydrocarbon separation in petroleum and petrochemical fields because of their high thermal, chemical, and mechanical strength. A *BEA-type zeolite is an interesting membrane material because of its large pore size and wide Si/Al range. This manuscript presents a protocol for *BEA membrane preparation by a secondary growth method that does not use an organic structure-directing agent (OSDA). The preparation protocol consists of four steps: pretreatment of support, seed preparation, dip-coating, and membrane crystallization. First, the *BEA seed crystal is prepared by conventional hydrothermal synthesis using OSDA. The synthesized seed crystal is loaded on the outer surface of a 3 cm long tubular &#945;-Al2O3 support by a dip-coating method. The loaded seed layer is prepared with the secondary growth method using a hydrothermal treatment at 393 K for 7 days without using OSDA. A *BEA membrane having very few defects is successfully obtained. The seed preparation and dip-coating steps strongly affect the membrane quality.

A *BEA seed crystal was loaded on a porous &#945;-Al2O3 support by the dip-coating method, and hydrothermally grown without using an organic structure-directing agent. A *BEA-type zeolite membrane having very few defects was successfully prepared by the secondary growth method.

Organische Struktur-regiende agentenfreie Synthese für *BEA-Typ Zeolith Membran

Membrane separation has drawn attention as a novel-energy saving separation process. Zeolite membranes have great potential for hydrocarbon separation in ...