Diese Studie wurde durch ein Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Ro2327 / 6-1), um CRR Die Autoren möchten Durry S. und C. Rodrigo für kompetente technische Unterstützung, und M. Dübbert (Elektronik-Labor, Zoologisches Institut danken unterstützt , Universität zu Köln, Deutschland) um Hilfe bei der Umsetzung der Pockels-Zelle-Controller und die HF-Schalter.

<ol>
	<li>Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+Na++imaging+in+spines+and+fine+dendrites+of+central+neurons.">Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons.</a> Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).</li><li>Rose, C. R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+Na++signals+in+spines+and+dendrites.">NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites.</a> J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).</li><li>Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+new+fluorescent+Na++indicator+CoroNa+Green:+comparison+with+SBFI+and+confocal+Na++imaging.">Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging.</a> J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).</li><li>Lamy, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probing+of+sodium+dynamics+in+neurons+and+astrocytes.">Optical probing of sodium dynamics in neurons and astrocytes.</a> NeuroImage. 58, 572-578 (2011).</li><li>Lasser-Ross, N., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+voltage+and+synaptically+activated+sodium+transients+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Imaging voltage and synaptically activated sodium transients in cerebellar Purkinje cells.</a> Proc. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 247, 35-39 (1992).</li><li>Bennay, M., Langer, J., Meier, S. D., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+signals+in+cerebellar+Purkinje+neurons+and+Bergmann+glial+cells+evoked+by+glutamatergic+synaptic+transmission.">Sodium signals in cerebellar Purkinje neurons and Bergmann glial cells evoked by glutamatergic synaptic transmission.</a> Glia. 56, 1138-1149 (2008).</li><li>Baranauskas, G., David, Y., Fleidervish, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mismatch+between+the+Na++flux+and+spike+initiation+in+axon+initial+segment.">Spatial mismatch between the Na+ flux and spike initiation in axon initial segment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 4051-4056 (2013).</li><li>Fleidervish, I., Lasser-Ross, N., Gutnick, M., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na++imaging+reveals+little+difference+in+action+potential-evoked+Na++influx+between+axon+and+soma.">Na+ imaging reveals little difference in action potential-evoked Na+ influx between axon and soma.</a> Nat. Neurosci. , 852-860 (2010).</li><li>Denk, W., Piston, D., Webb, W., Pawley, J. 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Exp. , (2011).</li><li>Ikrar, T., Olivas, N., Shi, Y., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+inhibitory+neuronal+circuits+by+laser+scanning+photostimulation.">Mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Pannasch, U., Sibille, J., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+electrophysiological+recordings+of+synaptically-evoked+astroglial+and+neuronal+responses+in+acute+hippocampal+slices.">Dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Minta, A., Tsien, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium.">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J. Biol. Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li><li>Kuruma, A., Inoue, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Ca(2+)+and+Na(+)+in+the+dendrites+of+mouse+cerebellar+Purkinje+cells+evoked+by+parallel+fibre+stimulation.">Dynamics of Ca(2+) and Na(+) in the dendrites of mouse cerebellar Purkinje cells evoked by parallel fibre stimulation.</a> Eur. J. Neurosci. 18, 2677-2689 (2003).</li><li>Despa, S., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na/K+pump+current+and+[Na](i)+in+rabbit+ventricular+myocytes:+Local+[Na](i)+depletion+and+Na+buffering.">Na/K pump current and [Na](i) in rabbit ventricular myocytes: Local [Na](i) depletion and Na buffering.</a> Biophys. 84, 4157-4166 (2003).</li><li>Regehr, W., Tank, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+concentration+dynamics+produced+by+synaptic+activation+of+CA1+hippocampal+pyramidal+cells.">Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells.</a> J. Neurosci. 12, 4202-4223 (1992).</li><li>Kushmerick, M. J., Podolsky, R. 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Neurosci. Meth. 180, 9-21 (2009).</li><li>Nikolenko, V., Peterka, D., Araya, R., Woodruff, A., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+light+modulator+microscopy.">Spatial light modulator microscopy.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 1132-1141 (2013).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine Interessenkonflikte. Die Autoren erhielten finanzielle Unterstützung ermöglicht Open Access-Veröffentlichung von Rapp OptoElektronik (Wedel, Deutschland), die ein Instrument in der Video-Artikel verwendet wird, erzeugt. Das Unternehmen war in den Experimenten noch in der Datenverarbeitung noch in der Handschrift weder schriftlich beteiligt.

Die vorliegende Studie zeigt, dass SBFI ist für Zwei-Photonen-Imaging von intrazellulären Natrium-Transienten in kleinen zellulären Kompartimenten gut geeignet. Es muss berücksichtigt werden, jedoch, dass die Quanteneffizienz der SBFI eher gering 15 und relative Veränderungen in der Natriumkonzentration ziemlich klein mit physiologischer Aktivität. So ist hochauflösenden Messung von Na +-Transienten in feinen Prozesse eine relativ langwierige Aufgabe, und Binning-oder Mittelwertbildung aus mehreren Studien notwendig sein, um zufrieden stellende Signale zu erhalten. Außerdem ist die Kinetik der Natrium Transienten raschend langsam, was es obligatorisch, für längere Zeitperioden aufzuzeichnen. Diese Beobachtung entspricht den in früheren Studien, in denen monoexponentiellen Natrium Transienten in neuronalen Dendriten und in Astrozyten durch große Zerfallszeitkonstanten im Bereich von 10 sec bei Raumtemperatur 1,2,6 gekennzeichnet. Natrium Transienten scheinen somit einen viel langsameren Zeit Co ausübenUrse und viel größer Abklingzeitkonstanten im Vergleich zu Kalzium-Transienten 16. Beiseite, diese Nachteile zu setzen, erweist sich Natrium-Bildgebung ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der physiologischen Eigenschaften der neuronalen Subdomains sein. So kann beispielsweise Natrium-Bildgebung dienen erregenden synaptischen Aktivität auf oder in der Nähe von aktiven Synapsen überwachen. Da Natrium im wesentlichen nicht gepuffert 8,17, sind Aktivität induzierte Natrium Transienten linear auf einer breiten Palette von synaptischen Glutamatfreisetzung bezogene oder exogen Glutamat. Sie repräsentieren somit direkten und unvoreingenommene Indikatoren neuronaler glutamatergen Aktivität. Außerdem Natriumindikatorfarbstoffe zeichnen sich durch hohe K d &#39;s (SBFI K d im Bereich von 25 mm 1). Selbst bei den verwendeten, um eine ausreichende Helligkeit zu erreichen relativ hohe intrazelluläre Farbstoffkonzentrationen (in der Regel 0,5 bis 1 mm), der hohe K d &#39;s bedeuten, daß die Farbstoffe selbst nicht als Puffer für S handelnOdium. Folglich haben sie nicht die Amplitude noch zeitliche Verlauf der Natrium-Transienten verzerren, das ist immer ein Problem, wenn Calcium-sensitiven Farbstoffe werden in die Zellen 18 eingeführt. Es kann somit davon ausgegangen werden, dass die erfassten Signale stellen ein gutes Maß für die &quot;echten&quot; Änderungen der intrazellulären Natrium. Ihre langsame zeitliche Verlauf bedeutet dann, dass die Geschwindigkeit für die intrazelluläre Diffusions Natrium in Neuronen ist viel kleiner als bisher angenommen 19. Eine entscheidende Voraussetzung für die erfolgreiche Durchführung von Experimenten der Bewältigung der Eigenschaften von erregenden synaptischen Übertragung und Natrium-Influx Wege in Stacheln und Dendriten ist die Induktion einer schnellen und stark lokalisierte Aktivierung der postsynaptischen Strukturen. Dies kann durch schnelle und lokale Applikation von Glutamat oder Glutamat-Agonisten in der unmittelbaren Umgebung einer Wirbelsäule oder einem Dendriten durch den Blitz-Photolyse von caged Verbindungen erhalten werden. Blitzphotolyse nicht mechanisch damage das Gewebe, ist frei von Bewegungsartefakten und ist gut für die Untersuchung der damit verbundenen Fragen etabliert (zB lokale Calcium-Signal). Der Durchmesser des Uncaging Stelle betrug 1,5 um in der xy-Ebene. Uncaging fast eine stachelige Dendriten induzierte Natrium-Signale in beiden Stacheln und die Mutter Dendriten. Während die Signale eher größte in Stacheln am nächsten an der Uncaging Ort zu sein, waren die Amplituden in der übergeordneten Dendriten und Dornen weiter weg noch recht ähnlich zu denen in unmittelbarer Nähe des Uncaging Ort. Uncaging wurde für 300 ms, während der innere Ströme in Amplitude erhöht geführt. Uncaged Glutamat könnte im Gewebe während der gleichen Zeitperiode diffundiert sind, Aktivierung ionotropen Glutamat-Rezeptoren und Natrium-Influx auf dendritische Dornen Regionen und weiter weg von der Uncaging Ort. Eine intrinsische Problem, das bei der Verwendung eines UV-Laser für die Photolyse von caged Verbindungen durch die Zelle Badelösung verabreicht trittist &quot;innere Filter &#39;. Aufgrund der hohen Absorptionsrate des Käfigs wird UV-Licht stark entlang dem Weg von dem Ziel zu der Stimulationsstelle 20,21 gedämpft. Ein möglicher Weg, um dies zu vermeiden ist die lokale Perfusion mit dem Käfig, der nur an der Stimulationsstelle, die außerdem verringert die Menge der Caged Compound auf ein Minimum beschränkt ist erforderlich. Im Vergleich zu UV-Laser-Scanning-vermittelte Uncaging, nahen Infrarot-Zwei-Photonen-Uncaging 22 ist räumlich präzise, ​​vor allem, weil die Genauigkeit der Stimulation in der z-Achse erhöht. Auf der anderen Seite, aufgrund der kleinen Querschnitt von allgemein verwendeten Käfige für längere Wellenlängen wie bei der Zweiphotonenanregung verwendet wird, entweder eine hohe Konzentration des photoaktivierbaren Verbindung oder sehr hoch ist, potentiell phototoxischen Lichtintensitäten erforderlich sind. Auch Zwei-Photonen-Photofreisetzung erfordert eine viel höhere Investitionen in die Ausrüstung; unter anderem eine zusätzliche IR-Laser sowie die erforderlichen optischen Komponenten benötigt werden. Sowohl SBFI und MNI-Glutamat sind erregbar in der identischen Wellenlängenbereich. Dies kann zu einer ungewollten Wechselwirkungen von UV-Laser und Uncaging SBFI oder IR-Imaging und Laser-MNI-Glutamat führen, was in der Bleich SBFI vom Uncaging Flash und / oder einer kontinuierlichen Uncaging von Glutamat durch die IR-Strahl. Wie in 6C gezeigt, weder eine UV-Blitz selbst noch die Mehrphotonenabbildungs ​​verursacht jedoch solche Wechselwirkungen unter unseren experimentellen Bedingungen. UV-Blitzsysteme ähnlich dem hier beschriebenen werden routinemäßig in vielen Laboratorien und relativ einfach in bestehende Multi-Photonen-Imaging-Mikroskop aufgenommen werden. Es bietet den Vorteil, dass der Laserstrahl für die Photolyse frei im Blickfeld befinden. Darüber hinaus ermöglicht das System eine schnelle und automatische Neupositionierung des Laserstrahls und die Freisetzung Volumen bzw. in das Blickfeld während eines Experiments. Our Änderung vereinfacht und verbessert die genaue Positionierung des Uncaging Ort, so dass die Rahmen der Imaging-Software kann auf Bildgebung und Uncaging Rahmen deckungsgleich einstellen zu dienen. Zusammengenommen Ganzzell Patch-Clamp-und Multi-Photonen-Natrium-Bildgebung in Dendriten und Dornen des zentralen Neuronen, verbunden mit einem modifizierten Verfahren für UV-Licht induzierte Photofreisetzung von Glutamat, eine zuverlässige und Brenn Aktivierung von Glutamat-Rezeptoren im Gewebe. Es kann somit dazu dienen, die Eigenschaften der exzitatorischen synaptischen Transmission und postsynaptischer Natrium Signale in Neuronen im intakten Gewebe zu analysieren.

Jüngste Verbesserungen in der lichtmikroskopischen Techniken wie Multi-Photonen-Mikroskopie wurden die Untersuchung der morphologischen und physiologischen Parametern von Hirnzellen in das intakte Gewebe mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ermöglicht. In Kombination mit der Elektrophysiologie werden diese Techniken, die heute häufig verwendet, um leistungsbezogenen elektrischen Signale auf Neuronen sowie gleichzeitige Calciumsignale in kleinen Zellkompartimenten zu analysieren, und zwar in feinen Dendriten und Dendriten. Neben Calcium Transienten induziert synaptische Aktivität auch Natrium-Signale in Dendriten und Dornen, sind die Eigenschaften, die weitgehend unerforscht. Solche Signale können durch Zwei-Photonen-Bildgebung von intrazellulären Natrium ([Na +] i), die die Online-Messung von [Na +] i-Transienten über längere Zeiträume ohne nennenswerte Farbbleich-oder Foto-Beschädigung 1,2 können analysiert werden. Für die Bildgebung von [Na +] i </sub&gt;, sind nur ein paar chemische Indikatorfarbstoffe zur Verfügung, zB Corona Grün oder Grün Asante Natrium 3,4. Die am häufigsten verwendeten fluoreszierenden Sonde für Na + Abbildungs ​​Natrium-bindenden benzofuran-isophthalat (SBFI). Es ist eine ratiometrische, UV-angeregten Farbstoff ähnlich dem bekannten Calcium-sensitiven Farbstoffs Fura-2 und hat für konventionelle Na +-Bildgebung in vielen Zelltypen eingesetzt worden (zB 5,6). Es gibt verschiedene Möglichkeiten der Anregung des Farbstoffs und das Sammeln ihrer Fluoreszenz. Wenn hohe zeitliche Auflösung (dh eine hohe Abbildungsbildrate) wird in Kombination mit räumlichen Informationen benötigt, kann SBFI aufgeregt mit einer Xenon-Bogenlampe oder einer Hochleistungsleuchtdiode (LED) Gerät und seine Emission mit einem High-Speed-Ladung festgestellt werden -gekoppelten Vorrichtung (CCD-Kamera) 7,8. Für maximale räumliche Auflösung tief im Gewebe, ist Multi-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie die Methode der Wahl 9. Die relativ niedrige Quanten efficiency von SBFI erfordert relativ hohe Farbstoffkonzentrationen (0,5-2 mm) und Direktbeladung der Membran-undurchlässig Form SBFI über einen scharfen Mikroelektroden 10 oder Patch-Pipette 1. Mit SBFI, früheren Arbeiten in akuten Gewebeschnitten der Nagetier-Hippocampus durchgeführt demonstriert tätigkeitsbezogene Natrium Transienten in Dendriten und Stacheln von CA1 Pyramidenzellen, die vor allem durch Einstrom von Natrium durch ionotropen NMDA-Rezeptoren verursacht werden 1,2. Für die Untersuchung der Eigenschaften derartiger lokaler Natrium Signale genauer ist eine spezifische Aktivierung von postsynaptischen Rezeptoren durch Anwendung der Rezeptoragonisten eine gut geeignete Methode der Wahl. Um präsynaptischen Aktivität und Transmitterfreisetzung zu imitieren, sollte die Anwendung relativ kurz sein und konzentrierte sich auf lokale Stimulation ermöglichen. Dies erweist sich jedoch als ziemlich schwierig in der intakten Gewebe sein. Lokale Anwendung von Druck-Rezeptor-Agonisten mit einem spitzen Pipette ermöglicht eine sehr Brenn apdung, beherbergt aber das potenzielle Risiko für die Herstellung von Bewegung der Struktur von Interesse (zB wie einem Dendriten oder dendritischen Dornen) und damit behindert hochauflösende Bildgebung. Die Eignung der Iontophorese von neuroaktiven Substanzen hängt von ihrer elektrischen Eigenschaften und die hohe Stromamplituden zellulären Artefakte auch zu produzieren. Ein Weg, um diese Hindernisse zu umgehen ist der Einsatz von Photo-aktivierten Verbindungen und ihre Blitzphotolyse. Grundsätzlich werden zwei verschiedene Prinzipien für Foto-Aktivierung von caged Substanzen verwendet: I) Weitwinkel-Blitzphotolyse 11 und II) Brenn Uncaging Einsatz Scanmodule in Kombination mit Lasern 12. Während Weitfeld Blitzphotolyse wird verwendet, um größere Bereiche von Interesse zu aktivieren, zB eine gesamte Zelle, die Brenn Uncaging wird eingesetzt, um gezielt zu stimulieren kleinen zellulären Kompartimenten. In der vorliegenden Studie wurde ein Verfahren zur Ganzzell-Patch-Clamp-und Multi-p zeigen wir,hoton Natrium Bildgebung in Dendriten und Dornen des zentralen Neuronen, verbunden mit einem modifizierten Verfahren für UV-Licht induzierte Photofreisetzung von Glutamat, die zuverlässig und Brenn Aktivierung von Glutamat-Rezeptoren im Gewebe ermöglicht.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1138">
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:239px;">Hadrware/Software Component</td>
			<td style="width:231px;">Manufacturer</td>
			<td style="width:183px;">Type</td>
			<td style="width:487px;">Comment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Borosilicate-glass capillaries</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>1405059</td>
			<td>75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Camera</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>ProgRes MF</td>
			<td>IR-DIC compatible camera</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Deconvolution software</td>
			<td>SVI</td>
			<td>Huygens Pofessional X11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Fiber optic spectrometer</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>USB 4000</td>
			<td>Miniature fiber optic spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Filter tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cenrifugal filter, 0.2 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Imaging software</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>Flowview Ver 5.0c, Tiempo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR beam power controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td>Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR laser</td>
			<td>SpectraPhysics</td>
			<td>Mai-Tai VF-N1S</td>
			<td>fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710-990 nm); CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR power monitor</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Micromanipulator</td>
			<td>Burleigh</td>
			<td>PCS 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Microscope/Imaging System</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>BX51WI/FV300</td>
			<td>Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">ND filter wheel</td>
			<td>Newport</td>
			<td>50Q04AV.2</td>
			<td>UV fused silica, optical density 0.05-2.0</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Objective</td>
			<td>Nikon Instruments Europe</td>
			<td>NIR Apo 60x/1.0w</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Patch clamp amplifier</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pipette puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Model PP-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pneumatic drug ejection system</td>
			<td>NPI Electronic</td>
			<td>PDES-DXH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>350-80 LA-BK</td>
			<td>EOM, used as fast switch and for power adjustment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell driver</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>M302-RM</td>
			<td>High voltage differential amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>LS6ZM2</td>
			<td>ALMgF2-coated BeCu blades</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter driver</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>Uniblitz VCM D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Slicer / Vibratome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Uncaging software</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA40 1.1.2.6 + NetCam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser&#160;</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>DL-355/10</td>
			<td>cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser scanning system</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA 40</td>
			<td>Galvanometric scanning system</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Name of Compound</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td></td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CNQX</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-127</td>
			<td>AMPA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">DL-AP5</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64210</td>
			<td>NMDA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">SBFI K+ Salt</td>
			<td>Teflabs</td>
			<td>OO32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">TTX</td>
			<td>Ascent Scientific</td>
			<td>Asc-055</td>
			<td>Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">NMI-caged-L-Glutamate</td>
			<td>Torcis</td>
			<td>1490</td>
			<td>Caged glutamatereleased upon UV absobtion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-photon intracellular sodium imaging combined with uv-mediated focal uncaging of glutamate in ca1 pyramidal neurons

Multi-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie wurde die Analyse von morphologischen und physiologischen Parametern von Hirnzellen in das intakte Gewebe mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ermöglicht. In Kombination mit der Elektrophysiologie, wird häufig verwendet, um aktivitätsbezogenen Calciumsignale in kleinen subzellulären Kompartimente wie Dendriten und dendritischen Dornen studieren. Neben Calcium Transienten induziert synaptische Aktivität auch postsynaptische Natriumsignale, deren Eigenschaften nur unwesentlich verstanden. Hier beschreiben wir ein Verfahren für die kombinierte Ganzzell-Patch-Clamp-und Multi-Photonen-Natrium-Bildgebung in der zellulären Mikrodomänen von zentralen Neuronen. Darüber hinaus führen wir eine modifizierte Verfahren für ultra-violetten (UV)-light-induzierte Uncaging von Glutamat, die eine zuverlässige und Schwer Aktivierung von Glutamat-Rezeptoren im Gewebe ermöglicht. Zu diesem Zweck wurden Ganzzell-Aufzeichnungen auf Ammonshorn Teilung 1 (CA1) Pyramidenzellen bei akuter Gewebeschnitt der durchgeführtenMaus Hippocampus. Neuronen wurden mit Natrium-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff SBFI durch die Patch-Pipette gefüllt ist, und Multi-Photonen-Anregung von SBFI aktiviert die Visualisierung von Dendriten und benachbarten Dornen. Um die UV-induzierte Brenn Uncaging zu schaffen, wurden mehrere Parameter, einschließlich der Lichtintensität, Volumen durch die UV-Strahlen Uncaging betroffen, Positionierung des Strahls sowie Konzentration der Käfigverbindung getestet und optimiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die lokale Perfusion mit geschütztem Glutamat (MNI-Glutamat) und ihre Brenn UV-Uncaging Ergebnis in Einwärtsströme und Natrium Transienten in Dendriten und Dornen. Zeitverlauf und die Amplitude der beiden Ströme nach innen und Natrium Signale korreliert mit der Dauer des Impulses Uncaging. Darüber hinaus zeigen unsere Ergebnisse, dass die intrazelluläre Natrium Signale werden in Gegenwart Blocker ionotropen Glutamat-Rezeptoren blockiert, was zeigt, dass sie von Natrium-Influx obwohl dieser Weg vermittelt. Zusammenfassend stellt unser Verfahren ein zuverlässiges Werkzeug für dieUntersuchung der intrazellulären Natrium-Signale durch fokale Rezeptor-Aktivierung in intakten Hirngewebe induziert.

In der vorliegenden Studie zeigen wir, ein Verfahren für die Multi-Photonen-Mikroskopie von zellulären Natrium Dynamik mit den natriumabhängigen Fluoreszenzfarbstoff SBFI in CA1-Pyramidenneuronen des Hippocampus der Maus akuten Gewebeschnitten. Darüber hinaus zeigen wir, wie man diese bildgebenden Verfahren mit Laser-Scanning-basierte Uncaging neuroaktiven Verbindungen (zB geschütztes Glutamat) und die präzisen Targeting, um zelluläre Mikrodomänen kombinieren. Laden Neuronen mit SBFI durch die Patch-Pipette aktiviert die Visualisierung der gesamten Zelle mit feinen Dendriten und benachbarten Stacheln durch Verwendung Multi-Photonen-Anregung (6A, B, D und 7A). <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500" /> Abbildung 6. Sodium Signale und synaptische Ströme durch Flash-Photolyse von caged Glutamat induziert. (A) Maximal Projektionsbild eines CA1 Pyramidenzelle über die Patch-Pipette (PP) mit SBFI geladen. Der Kasten zeigt das gezeigte in B. LP vergrößert Bereich zeigt die Position und Orientierung der Pipette für die lokale Durchblutung geschütztes Glutamat. (B) Hochleistungsmaximum Projektion von einem Stapel von optischen Schnitten eines Dendriten mit angrenzenden dendritischen Dornen. Die Stapel optischer Schnitte unter z-Ausrichtung und Entfaltung. Das rote Kreuz zeigt die Zielregion des Uncaging Strahl. Die orange gepunktete Linie umreißt den Bereich von Interesse, von dem die Fluoreszenzemission aufgezeichnet. Die Box gibt den dargestellten Bereich in D. (C) vergrößert Links: Sodium-Signal (obere Reihe) und somatische innen Strom (untere Reihe) durch Flash-Photolyse von caged Glutamat (von gelber Blitz gekennzeichnet) induziert. Die rote Linie stellt eine Anpassung der experimentellen Daten. Der graue Bereich stellt die Periode, in der die Uncaging Blitz (300msec) behindert die Abbildung der Fluoreszenz SBFI. Rechts: Ohne Vor-Perfusion mit geschütztem Glutamat, das gleiche UV-Blitz weder evozierte eine Änderung in SBFI Emissions, noch einen nach innen gerichteten Strom (D) Links:. Hohe Leistungs Bild des Dendriten und den angrenzenden Stacheln wie in B abgegrenzt Daneben das gleiche Bild mit umgekehrten Grauwerte. Die gepunkteten Linien zeigen die Bereiche von Interesse, bei denen die Fluoreszenzemission aufgezeichnet. Das rote Kreuz zeigt die Lokalisierung der Uncaging Strahl. Rechts: Sodium Transienten, die durch UV-Flash-Photolyse von caged Glutamat induziert. Blaue Kurve: Natrium-Signale in Dendriten; rote Spur: Mittelwert der Reaktion von drei Stacheln neben dem Uncaging Ort; grüne Spur: Mittelwert der Reaktion von drei entfernten Stacheln. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a> Nach lokalen Perfusion mit CagedGlutamat, Aufbringen eines UV-Blitzes in der Nähe eines Dendriten in Folge einer vorübergehenden Abnahme der Fluoreszenzemission von SBFI, was eine Zunahme der intrazellulären Natriumkonzentration (6C, D und 7B). Zur gleichen Zeit wurde ein Einstrom im Soma (6C und 7B) aufgezeichnet. Erhöhen der Dauer der UV-Blitz Folge zunehmenden Amplituden sowohl der nach innen hervorgerufenen Ströme und die Natriumsignale (Daten nicht gezeigt), was darauf hinweist, dass das System gut innerhalb seines Dynamikbereichs und weder Uncaging oder zellulären Reaktionen wurden gesättigt. Aufbringen einer UV-Blitz gleicher oder längerer Dauer, um Scheiben, die nicht mit geschütztem Glutamat vorge perfundiert waren, nie ausgelöst Änderungen SBFI Fluoreszenz noch Einwärtsströme, was anzeigt, daß diese Signale durch die Demaskierung Glutamat (Figur 6c). Darüber hinaus zeigen diese Ergebnisse, dass keine gegenseitige Abhängigkeit der Patientenlagerungs- und Uncaging Komponenten u beobachtetnder unseren experimentellen Bedingungen. Natrium-Signale auch in dendritischen Dornen (6D) detektiert werden. Während wir nicht versuchen, der Stimulation eines einzelnen Wirbelsäule nur mit Glutamat Uncaging erreichen, tendenziell Spitzenamplituden zu sein in der Nähe der Stacheln Uncaging Stelle etwas höher, während weiter entfernt Stacheln zeigten nahezu identische Fluoreszenzänderungen als Mutter Dendriten (6D). Schließlich untersuchten wir den Weg für Natrium-Einstrom in Dendriten und Dornen in Reaktion auf Uncaging von Glutamat. Zu diesem Zweck verwendeten wir CNQX und APV, die selektive Blocker für die Natrium-permeable, ionotropen Glutamat-Rezeptoren des AMPA- und NMDA-Subtyps bzw. sind. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Glutamat-induzierte intrazelluläre Natriumsignale und die hervorgerufene Körperströme wurden in der Gegenwart dieser Blocker (7B) weggelassen. Nach Auswaschen der Blocker, werden die Signale wieder. Dies zeigt, that Uncaging von Glutamat aktiviert ionotropen Glutamat-Rezeptoren auf CA1-Pyramidenneuronen, die den Einstrom von Natrium in Dendriten und Dornen zu vermitteln, was in der intrazellulären Natrium-Transienten und Einwärtsströme. <img alt="Figur 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600" /> Abbildung 7. pharmakologische Profil von Natrium evozierte Signale und Einwärtsströme. (A) SBFI gefüllten CA1 Pyramidenzelle mit Patch-Pipette (PP) mit dem Soma befestigt (B) Links:. Sodium vorübergehend und somatischen Strom, der durch Photoaktivierung von geschütztem Glutamat in einem Dendriten induziert und befestigt Stacheln Center:. Perfusion mit der ionotropen Glutamatrezeptorblocker CNQX und APV hemmt sowohl die Natrium-Signal und die nach innen gerichteten Strom von Photofreisetzung induzierten. Rechts: Nach dem Auswaschen der Blocker die Signale wiederhergestellt werden. Die rote Linie repräsents eine Anpassung der experimentellen Daten. Der graue Bereich stellt die Periode, in der die Uncaging Blitz (300 ms) behindert die Abbildung SBFI Fluoreszenz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Wir beschreiben die Kombination von Brenn UV-induzierten Photoaktivierung von neuro-Wirkstoffe mit Ganzzell Patch-Clamp-und Multi-Photonen-Imaging von intrazellulären Natrium-Transienten in Dendriten und Dornen von Neuronen im Hippocampus bei akuten Gewebeschnitten von Mausgehirn.

Multi-Photonen-Intrazelluläre Sodium Imaging Kombination mit UV-vermittelten Brenn Uncaging von Glutamat in CA1 Pyramidenzellen

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

multi-photon-intracellular-sodium-imaging-combined-with-uv-mediated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.9K Aufrufe.  Heinrich Heine University Düsseldorf.  Wir beschreiben die Kombination von Brenn UV-induzierten Photoaktivierung von neuro-Wirkstoffe mit Ganzzell Patch-Clamp-und Multi-Photonen-Imaging von intrazellulären Natrium-Transienten in Dendriten und Dornen von Neuronen im Hippocampus bei akuten Gewebeschnitten von Mausgehirn. 

Serie: Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous activity of participating neurons leads to the emergence of the integral functionality of the network. Here we present the methodology of application of this technique to identified pattern generating neurons in the crab stomatogastric ganglion. We demonstrate the loading of these neurons with the fluorescent voltage-sensitive dye Di-8-ANEPPQ and we show how to image the activity of dye loaded neurons using the MiCAM02 high speed and high resolution CCD camera imaging system. We demonstrate the analysis of the recorded imaging data using the BVAna imaging software associated with the MiCAM02 imaging system. The simultaneous voltage-sensitive dye imaging of the detailed activity of multiple neurons in the crab stomatogastric ganglion applied together with traditional electrophysiology techniques (intracellular and extracellular recordings) opens radically new opportunities for the understanding of how central pattern generator neural networks work.

Here we present the methodology for fast and high resolution fluorescent voltage-sensitive dye imaging of detailed activity of neurons in the crab stomatogastric ganglion.

Optical Imaging von Neuronen im Crab stomatogastrischen Ganglion mit spannungsabhängigen Farbstoffen

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Forschung

Neurowissenschaften

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Eine Methode zur High Fidelity optogenetische Kontrolle der Einzelpyramidenzellen<em&gt; In-vivo-</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

Die intrazelluläre Aufnahme, Sinnes Field Mapping und Kultivierung identifizierten Neuronen in der Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Die Ableitung der zeitliche Verlauf der Glutamate Ausverkauf mit Dekonvolutionsanalyse von Astrozytäre Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Funktionelle Abfrage der Erotik Hypothalamus Neurogenese mit Brennradiologische Hemmung

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

Riechzellen durch nasale Biopsie Combined Erhalten mit Laser-Mikrodissektion: Ein möglicher Ansatz zum Behandlungserfolg bei Mental Disorders Studieren

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma establishes a lifelong persistent infection in the brain. While this brain infection is asymptomatic in most immunocompetent people, in the developing fetus or immunocompromised individuals such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients, this predilection for and persistence in the brain can lead to devastating neurologic disease. Thus, it is clear that the brain-Toxoplasma interaction is critical to the symptomatic disease produced by Toxoplasma, yet we have little understanding of the cellular or molecular interaction between cells of the central nervous system (CNS) and the parasite. In the mouse model of CNS toxoplasmosis it has been known for over 30 years that neurons are the cells in which the parasite persists, but little information is available about which part of the neuron is generally infected (soma, dendrite, axon) and if this cellular relationship changes between strains. In part, this lack is secondary to the difficulty of imaging and visualizing whole infected neurons from an animal. Such images would typically require serial sectioning and stitching of tissue imaged by electron microscopy or confocal microscopy after immunostaining. By combining several techniques, the method described here enables the use of thick sections (160 &#181;m) to identify and image whole cells that contain cysts, allowing three-dimensional visualization and analysis of individual, chronically infected neurons without the need for immunostaining, electron microscopy, or serial sectioning and stitching. Using this technique, we can begin to understand the cellular relationship between the parasite and the infected neuron.

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Using this protocol, we were able to image 160 &#181;m thick brain sections from mice infected with the parasite Toxoplasma gondii, which enables visualization and analysis of the spatial relationship between the encysting parasite and the infected neuron.

3-D-Bildgebung und Analyse von Neuronen Infizierte<em&gt; In-vivo-</em&gt; Mit<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to study the molecular composition of membranes produced a significant decline in its use. Recently, there has been a major revival in freeze-fracture electron microscopy thanks to the development of effective ways to reveal integral membrane proteins by immunogold labeling. One of these methods is known as detergent-solubilized Freeze-fracture Replica Immunolabeling (FRIL).
The combination of the FRIL technique with optogenetics allows a correlated analysis of the structural and functional properties of central synapses. Using this approach it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their respective expression of a tagged channelrhodopsin and specific molecular markers. The distinctive appearance of the postsynaptic membrane specialization of glutamatergic synapses further allows, upon labeling of ionotropic glutamate receptors, to quantify and analyze the intrasynaptic distribution of these receptors. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to prepare paired replicas and how to immunolabel them. We will also discuss the caveats and limitations of the FRIL technique, in particular those associated with potential sampling biases. The high reproducibility and versatility of the FRIL technique, when combined with optogenetics, offers a very powerful approach for the characterization of different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.
Here, we provide an example how this approach was used to gain insights into structure-function relationships of excitatory synapses at neurons of the intercalated cell masses of the mouse amygdala. In particular, we have investigated the expression of ionotropic glutamate receptors at identified inputs originated from the thalamic posterior intralaminar and medial geniculate nuclei. These synapses were shown to relay sensory information relevant for fear learning and to undergo plastic changes upon fear conditioning.

This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

Kombinierte optogenetische und Gefrierbruch Replica Immunmarkierung Eingang spezifische Anordnung der Glutamate Receptors in der Maus Amygdala zu untersuchen

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

Ballistische Kennzeichnung von Pyramidal neurons in Gehirnscheiben und in der primären Zellkultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...