Die hochauflösende Bildgebung einzelner Synapsen, die einen schnellen Glutamatsensor ausdrücken, ermöglicht die Erkennung lokaler Diskrepanzen zwischen Senderfreigabe und Aufnahme. Im Falle einer Krankheit kann diese Methode verwendet werden, um dysfunktionale Synapsen zu identifizieren. Zur Autofluoreszenzkorrektur legen Sie zunächst eine Gehirnscheibe aus der Maus von Interesse in die Aufnahmekammer eines Ein-Photonenmikroskops.
Tauchen Sie die Scheibe in sauerstoffhaltige, künstliche Zerebrospinalflüssigkeit und verwenden Sie das 20x Wasser-Immersion-Objektiv, um das dorsale Striatum zu lokalisieren. Befestigen Sie die Scheiben mit einem Nylongitter auf einer Platinharfe, um die Gewebebewegung zu minimieren, und wechseln Sie zum 63-fachen Wasser-Immersion-Objektiv. Mit einem Hochpassfilter bei 510 Nanometern können Sie ein Bild der autofluoreszierenden und glutamatsensorpositiven positiven Strukturen zusammen erfassen.
Mit einem Hochpassfilter bei 600 Nanometern können Sie ein zweites Bild der autofluoreszierenden Strukturen allein erfassen. Um den Bereich zu definieren, verwenden Sie die mittleren Intensitäten der 10 hellsten und 10 dunkelsten Pixel, um die roten und gelben Bilder zu skalieren. Führen Sie dann eine Subtraktion des gelben Minus-Rot-Bildes durch, und skalieren Sie das subtrahierte Bild neu, um eine standardmäßige 8-Bit-TIFF-Datei zu generieren, um die Interessensentwicklung bequem zu visualisierungen.
Um nach reaktionsschnellen Boutons zu suchen, benötigen Sie eine geeignete Glas-Mikropipette für die elektrische Stimulation. Verwenden Sie einen Mikropipette-Puller, um Stimulationspipetten aus Borosilikatglaskapillaren mit innenliegenden Spitzendurchmessern von etwa einem Mikrometer herzustellen. Um eine mögliche abhängige Freisetzung von Glutamat aus einer Reihe von Kandidaten-Boutons zu untersuchen, wählen Sie eine 63-fache Vergrößerung und einen 510-Nanometer-Emissionsfilter aus.
Laden Sie das subtrahierte Bild, um die Platzierung einer Glasstimulationselektrode neben einer fluoreszierenden Varikosität zu ermöglichen, wodurch die Nähe zusätzlicher Axone vermieden wird. In welchen Varikositäten mit einer maximalen Bifurkation oder Zuordnung innerhalb eines tieferen Teils des Segments verbunden sind. Platzieren Sie die Stimulationselektrode in der Nähe des Interessenss und schalten Sie das Licht aus, da die Aufnahmen in völliger Dunkelheit durchgeführt werden müssen.
Schalten Sie dann das Mehrkanal-Bad-Anwendungssystem ein, wobei ein Kanal die Standard-Badlösung und die anderen Kanäle die notwendigen Blocker der Ionenkanäle, Transporter oder Membranrezeptoren liefern, einschließlich Tetrototoxin, um die Mögliche Erzeugung zu blockieren. Steuern Sie den Durchfluss an der Aufnahmestelle und schalten Sie den Stimulator ein, um depolarisierende Stromimpulse von zwei bis zehn Mikroampere an die Stimulationspipette zu liefern. Die Freisetzung wird nun durch direkten Kalziumzufluss durch spannungsverkabelte Kanäle aktiviert.
Um die Glutamatfreisetzung im Freiraum zu visualisieren, platzieren Sie den getesteten Glutamatsensor mit Hilfe des Mikroskops X, Y-Antriebe in der Nähe des Sichtfeldzentrums. Nachdem Sie die Erfassung beendet haben, klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Bild, um die X-, Y-Position des ruhenden Bouton-Centers zu bestimmen. Die X-, Y-Koordinaten des eingestellten Cursors werden angezeigt.
Berechnen Sie anhand der Kalibrierdaten die Koordinaten des Ortes, an dem der Laserstrahl zur Anregung des Glutamatsensors fluoreszenz gesendet werden soll, wobei die angegebenen Formeln verwendet werden. Um eine Ein-Punkt-Sequenz in der Lasersteuerungssoftware zu erstellen, wählen Sie Punkt im Feld Zum Sequenz hinzufügen auf der Sequenzseite der Lasersteuerungssoftware aus, und legen Sie die Durchläufe und die Ausführungsverzögerung auf Null und die Sequenz für tLL fest. Klicken Sie dann auf Startsequenz.
Wählen Sie in der Kamerasteuerungssoftware die entsprechenden Bildparameter aus und wählen Sie den externen Start für den Triggermodus aus. Klicken Sie auf Aufnahmesignal in der Kamerasteuerungssoftware. Starten Sie dann das für das Triggergerät festgelegte Versuchsprotokoll und führen sie die experimentelle Protokollstudie mit der entsprechenden Zeitachse durch, so dass die Kamera während einer Testzeit 400 Frames mit einer Frequenz von 2,48 Kilohertz mit einer Wiederholungsfrequenz von 0,1 Hertz oder weniger erfasst.
Um pathologische Synapsen zu identifizieren, aktivieren Sie die Höhenroutinen und berechnen die Fluoreszenzintensität, den Mittelwert und die Standardabweichung für den ausgewählten Bereich, in dem sie ruhen. Bestimmen und boxen Sie den von Pixeln belegten Bereich mit einer ruhenden Fluoreszenzintensität, die größer ist als der Mittelwert plus drei Standardabweichungen, und bestimmen Sie einen virtuellen Durchmesser in Mikrometern, wobei eine kreisförmige Form des Supraschwellenbereichs angenommen wird. Plotten Sie die Fluoreszenzintensität gegen die Zeit, als die Differenz zwischen dem tatsächlichen Fluoreszenzintensitätswert und dem fluoreszenz-Intensitätswert im Ruhezustand geteilt durch den ruhenden Fluoreszenzintensitätswert.
Bestimmen Sie die Maximale Amplitude der Fluoreszenzreaktion. Führen Sie eine monoexponentiale Anpassung für den Zerfall vom Höhepunkt der Fluoreszenzreaktion durch, und bestimmen Sie die Zeitkonstante des Zerfalls, TauD. Um die maximale Amplitude an einer bestimmten Synapse zu schätzen, wählen Sie das Pixel mit der höchsten Änderung der Fluoreszenzintensität aus, das der beste Indikator für die Glutamatlast ist, die der Clearance-Maschinerie der Synapse angezeigt wird.
Einzelne Synapsen-Bildgebung kann verwendet werden, um zwei Klassen von korticostriatalen Synapsen mit der Größe und gepaarten Pulsverhältnis-Kriterien zu identifizieren. In Stimulusintervallen von 20 bis 50 Millisekunden sind die kleineren interenterochephalic-Klemmen anfällig für gepaarte Pulsdepressionen, während die größeren Pyramidal-Trakt-Klemmen eine gepaarte Pulserleichterung zeigten. Tests über das motorische Verhalten, die an Wildtypmäusen und Mäusen durchgeführt wurden, die einen Huntington-Phänotyp exdrückten, zeigen eine signifikante positive Kobeziehung zwischen den Ergebnissen, die für den gesamten Pfadlauf im offenen Feld erzielt wurden, und dem Schritt über die Latenz.
Darüber hinaus zeigt die einzelseitige Synapseglutamat-Bildgebung, dass symptomatische Huntington-Mäuse ein Defizit in der Geschwindigkeit des juxtasynpatischen Glutamatzerfalls aufwiesen, wie sich in den TauD-Werten der Glutamatreaktionen auf eine einzelne Synapsenstimulation widerspiegelt. Bei Wildtieren wurde eine solche Verlängerung erst nach der Anwendung eines selektiven, nicht transportablen Inhibitors der Glutamataufnahme beobachtet. Die Auswertung der Wahrscheinlichkeit des Auftretens eines bestimmten TauD-Wertes in Scheiben von Wildtyp-Mäusen und Mäusen, die die Symptome der Huntington-Krankheit exdrückten, ergab, dass TauD bei Wildtiertieren nie mehr als 15 Millisekunden beträgt.
Bei der symptomatischen Huntington-Krankheit weisen jedoch 40% der Synapsen TauD-Werte zwischen 16 und 58 Millisekunden auf, trotz einer Tendenz zur Verringerung der Menge an freigesetztem Glutamat. Daher könnte TauD als Biomarker für dysfunktionale Synapsen bei der Huntington-Krankheit angesehen werden und kann weiter verwendet werden, um die funktionelle Erholung in Experimenten zu verifizieren, die auf den astrozytischen Glutamattransport abzielen. Dieses Protokoll zur Glutamatüberwachung an einzelnen kortikostriatalen Synapsen kann dazu beitragen, die Rolle des Glutamataufnahmemangels bei der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen zu klären.
Einzelne Synapsen-Bildgebung ist besonders nützlich für die Erforschung vorsynaptischer Standorte von exzitatorischen Synapsen.
