Wir danken Dr. Agnes Viale und die MSKCC Genomics Core-Labor für technische Hilfe. Dieses Protokoll wurde mit Unterstützung der Geoffrey Beene Krebsforschungszentrum und dem Farmer-Familien-Basis entwickelt.

1. DNA und Vorbereitung der Reagenzien Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die gleichzeitige Aufbereitung und Analyse von 24 Proben (zB 12 Tumor / Normalpaare), kann aber bei kleineren und größeren Chargen angepasst werden. DNA-Proben können von FFPE oder gefrorenem Frischgewebe, zytologischen Proben, oder Blut abzuleiten. Typischerweise werden sowohl Tumor und normalem Gewebe des gleichen Patienten zusammen, um somatische Mutationen von Polymorphismen zu unterscheiden geerbt profiliert werden. Das Protokoll beginnt unmittelbar nach der DNA-Extraktion. <ol><li> 50-250 ng Aliquot (250 ng) empfohlen extrahierten DNA pro Probe, in 1x Tris-EDTA verdünnt (pH 8,0)-Puffer auf ein Endvolumen von 50 ul, in getrennte Covaris Rundbodenröhrchen. </li><li> Scheren die DNA auf der Covaris E220 Instrument bei den folgenden Einstellungen Scher: 360 s bei 10 Tastverhältnis, 175 PIP und 200 Zyklen pro Burst. </li><li> Auftauen AMPure XP Perlen (Tabelle 2) auf Raumtemperatur. Tauen Sie alle buob bietet und Enzyme auf Eis vor dem entsprechenden Schritt. </li></ol> 2. Bibliothek Vorbereitung - End Repair-Modul <ol><li> Bereiten Sie das Ende Reparatur Master-Mix in einer sterilen Mikrozentrifugenröhrchen mit den folgenden Bänden pro Probe: 10 ul 10x NEBNext End Repair Reaktionspuffer (Tabelle 2), 5 ul NEBNext End Reparatur-Enzym-Mix (Tabelle 2), 35 ul sterile nucleasefreiem H 2 O. </li><li> Aliquoter Teil, der 50 &amp;mgr; l jeder gescherte DNA in einzelne Wells einer 96-Well-Platte. In 50 ul der vorbereiteten Ende Reparatur Master Mix zu jeder Reaktion. Inkubiere in einem Thermozykler für 30 min bei 20 ° C. </li></ol> 3. Beitrag End Repair Aufräum <ol><li> In 2x Volumen (200 ul) AMPure XP Perlen (Tabelle 2) zu jeder Probe und vorsichtig pipettieren, das gesamte Volumen auf und ab 10x mit einer Mehrkanalpipette. Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 min. </li><li> Legen Sie auf dem Magnetständer (Tabelle 2 </strong&gt;) bei RT für 15 Minuten, bis die Probe klar erscheint. </li><li> Vorsichtig entfernen und entsorgen Sie klare Überstand kümmert sich nicht um Perlen zu stören. Einige Flüssigkeit kann in den Vertiefungen bleibt. </li><li> Rohre mit auf dem Stand sanft mit 200 ul frisch hergestellte 80% igem Ethanol zu jeder Probe und inkubiere Platte bei Raumtemperatur für 30 Sekunden. Vorsichtig entfernen Ethanol durch Pipette. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5 für insgesamt 2 Ethanol wäscht. Stellen Sie sicher, alle Ethanol wurde entfernt. Aus dem Magnetständer nehmen und lassen bei RT trocken für 5 min. </li><li> Resuspendieren getrocknet Perlen mit 44,5 ul sterilem H 2 O. Sanft, Pipetten gesamte Volumen auf und ab 10x Durchmischung. Sicherzustellen Perlen sind nicht mehr auf der Seite der Wanne angebracht ist. </li><li> Inkubieren resuspendierten Perlen bei RT für 2 min. Zeigen auf Magnetständer für 5 Minuten, bis die Probe klar erscheint. </li><li> Vorsichtig über 42 ul der klare Überstand, der die Probe auf einen neuen Brunnen. Das Verfahren kann sicher in diesem st gestoppt werdenep und die Proben bei -20 ° C für bis zu 7 Tage gelagert. Um neu zu starten, Auftauen gefrorenen Proben auf Eis, bevor Sie fortfahren. </li></ol> 4. Bibliothek Vorbereitung - dA-Tailing-Modul <ol><li> Bereiten Sie die dA-Tailing Master-Mix in einer sterilen Mikrozentrifugenröhrchen mit den folgenden Bänden pro Probe: 5 ul 10x NEBNext dA-Tailing Reaktionspuffer (Tabelle 2), 3 ul (3&#39;-5&#39;-Exo-) Klenow Fragment (Tabelle 2 ). </li><li> In 8 ul der vorbereiteten dA-Tailing Master-Mix in jede Vertiefung mit 42 ul von End-DNA repariert. Inkubiere in einem Thermozykler für 30 min bei 37 ° C. </li><li> Führen Sie einen Beitrag dA-Tailing clean-up: Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.8 mit 2x Volumen (100 ul) von Perlen, aber resuspendieren in sterilem H 2 O auf ein Gesamtvolumen von 33,75 ul. Das Verfahren kann ohne Bedenken bei diesem Schritt und die Proben bei -20 ° C für bis zu 7 Tage gelagert gestoppt werden. Um neu zu starten, Auftauen gefrorenen Proben auf Eis, bevor Sie fortfahren. &lt;/ Li&gt; </ol> 5. Bibliothek Vorbereitung - Adapter Ligation-Modul <ol><li> Bereiten Sie die Ligation Master-Mix in einer sterilen Mikrozentrifugenröhrchen mit den folgenden Bänden pro Probe: 10 ul 5x NEBNext Ligation Schnellreaktionspuffer (New England Biolabs, Tabelle 2), 5 ul Schnell T4 DNA Ligase (Tabelle 2). </li><li> In 15 ul der Ligation Master-Mix in jede Vertiefung, die das dA-Schwanz-DNA. </li><li> In 1,25 ul der entsprechenden 25 uM NEXTflex Barcode-Adapter (Tabelle 2) in jede Vertiefung. Jede Probe sollte eine separate Barcode-Adapter zu erhalten. Inkubiere in einem Thermozykler für 15 min bei 20 ° C. </li><li> Führen Sie einen Beitrag Adaptorligation clean-up: Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.8 mit 1x Volumen (50 ul) von Perlen, aber resuspendieren in sterilem H 2 O auf ein Gesamtvolumen von 50 pl. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.8 für eine zweite 1x Volumen (50 ul) clean-up, aber resuspendieren in sterilem H 2 O, um eineEndvolumen von 23 ul. Das Verfahren kann ohne Bedenken bei diesem Schritt und die Proben bei -20 ° C für bis zu 7 Tage gelagert gestoppt werden. Um neu zu starten, Auftauen gefrorenen Proben auf Eis, bevor Sie fortfahren. </li></ol> 6. Bibliothek Amplification <ol><li> Bereiten Sie die KAPA HiFi Master-Mix in einer sterilen Mikrozentrifugenröhrchen mit den folgenden Bänden pro Probe: 25 ul 2x KAPA HiFi HS RM (Tabelle 2), 1 ul von jeweils 100 uM Primer 1 und Primer 2 (Tabelle 3). </li><li> In 27 ul des Master-Mix in jede Vertiefung, die das Ligationsprodukt. Stellen Pipette pipettieren und 50 ul das gesamte Volumen auf und ab 10x sanft. </li><li> Legen im Thermocycler für folgende PCR-Zyklen: anfängliche Denaturierung 45 s bei 98 ° C, 10 Zyklen von 15 sec bei 98 ° C, 30 sec bei 60 ° C, 30 sec bei 72 ° C und abschließende Extension von 1 min bei 72 ° C. </li><li> Führen Sie einen Beitrag Verstärkung clean-up: Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.8 mit1x Volumen (50 ul) AMPure XP Perlen und Resuspension in sterilem Wasser bis zu einem Endvolumen von 30 &amp;mgr; l. </li><li> Quantifizierung der Konzentration von jeder Bibliothek mit Qubit Breite Palette Assay (Life Technologies, Tabelle 2) nach der Anleitung des Herstellers. </li></ol> 7. Roche NimbleGen SeqCap EZ Bibliothek Hybridisierung, Waschen und Verstärkung <ol><li> Tauwetter universelle und Index-Oligonukleotid-Blocker (Tabelle 3), SeqCap EZ Library und Nimblegen Capture-Komponenten (COT DNA, 2x Hybridisierungspuffer und die Hybridisierung Komponente A, Tabelle 2) auf Eis. Alle Oligonukleotid-Blocker werden in Arbeits Aktien von 1 mM gespeichert. Unsere SeqCap EZ Library ist eine maßgeschneiderte Pool von Capture-Sonden, die alle Protein-kodierenden Exons von 279 Krebs-assoziierte Gene, obwohl auch andere kundenspezifische Designs und Katalog verwendet werden. </li><li> Bereiten Sie eine 1 mM Pool von Index-Oligonukleotid-Blocker entsprechend der spezifischen Barcode-AnzeigeAptor Sequenzen in der Bibliothek der Herstellung verwendet. Kombinieren Sie 1 ul jeder Blocker und Wirbel. </li><li> In einer neuen sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen werden 5 ul 1mg/ml COT-DNA, 2 ul 1 mM Universal-Blocker und 2 ul der 1 mM Pool von Index-Oligonukleotid-Blocker. </li><li> Schwimmbad 24 Barcode-Bibliotheken in einer einzigen Reaktion. In insgesamt 1-3 ug vereinigt, Barcode-Sequenz-Bibliothek (oben hergestellt) an die Capture-Mischung. Für 24 Proben wird 100 ng pro Probe empfohlen. Wenn die Bündelung Tumoren und normalen Proben abgestimmt ist, empfehlen wir das Hinzufügen von mehr Tumor Bibliothek (zB 100 ng pro Tumor und 50 ng pro normal), so dass sie eine größere Tiefe der Berichterstattung sind sequenziert. </li><li> Schließen Kappe der Röhre und machen 15-20 Löcher in der Spitze der Kappe mit einem 18-20 G oder kleiner Nadel. Speed ​​Vac die verstärkten Sample Library / COT DNA / Oligos in einem DNA-Vakuum-Konzentrator auf hoher Hitze (60 ° C). </li><li> Einmal ganz nach unten getrocknet, deinen Durst mit 7,5 ul 2x Hybridisierungrung Puffer und 3 ul Hybridisierung Komponente A. Das Rohr sollte nun die folgende: 5 ug COT DNA, variable ug verstärkt Sample-Bibliothek, 1000 pmol von Universal und Index Oligos, 7,5 ul 2x Hybridisierungspuffer, 3 ul Hybridisierung Komponente A in eine Gesamtvolumen von 10,5 ul. </li><li> Bedecken Sie die Löcher in der Kappe mit einem kleinen Stück von Labor-Band. Wirbel die Probe für 10 Sekunden und Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 10 Sekunden. </li><li> Inkubieren der Probe bei 95 ° C für 10 Minuten, um die DNA zu denaturieren, gefolgt von einer Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit für 10 s bei RT. </li><li> In einem neuen 0,2 ml PCR-Streifen Rohr, bereiten 2,25 ul Aliquot SeqCap EZ Bibliothek Fangsonden und 2,25 ul sterilem nucleasefreiem H 2 O und fügen Sie den Inhalt der Schritt 7.7. Pipette vorsichtig das gesamte Volumen auf und ab 10x. </li><li> Inkubieren in einem Thermocycler bei 47 ° C für 48-96 Stunden. Eingestellt und Deckeltemperatur Thermocycler beizubehalten bis 57 ° C </li><li> FolNieder Schritte in Kapitel 6 des NimbleGen SeqCap EX-Bibliothek SR Benutzerhandbuch v3.0 (Tabelle 2) zum Waschen und Wiederherstellung des aufgenommenen DNA. </li><li> Folgt Schritte in Kapitel 7 der Roche NimbleGen-Protokoll für die Amplifikation des aufgenommenen DNA mit folgenden Änderungen: <ul type="disc"><li> Verwenden Sie 2x KAPA HiFi-Polymerase (Tabelle 2) statt Phusion High-Fidelity PCR Master Mix </li><li> Verwenden von 100 &amp;mgr; M Primer 1 und Primer 2 in Tabelle 3 aufgelistet. </li><li> Laufen die folgenden PCR-Bedingungen: anfängliche Denaturierung bei 98 ° C für 30 sec, 11 Zyklen von 98 ° C für 10 sec, 60 ° C für 30 sec, 72 ° C für 30 sec, und abschließende Extension bei 72 ° C für 5 min . Halten bei 4 ° C. </li></ul></li><li> Quantifizierung der Konzentration der amplifizierten DNA mit erfasst Qubit High Sensitivity Assay (Tabelle 2) gemß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Analysieren Sie die aufgenommenen DNA-Qualität mit Agilent BioAnalysator DNA HS-Chip (Tabelle 2) gemß den Anweisungen des Herstellers. <ul type="disc"><li> Das PCR-Ausbeute sollte mindestens 100 ng (Bereich 100-1000 ng) sein. </li><li> Die durchschnittliche Fragmentlänge sollte zwischen 150-400 Basenpaare. </li></ul></li></ol> 8. Hallo Illumina-Seq-Sequenzierung <ol><li> Verdünnen Sie die aufgenommenen DNA amplifiziert, um 02.00 Uhr, und laden Sie die Probe auf einer einzigen Spur einer Illumina HiSeq 2000 Durchflusszelle. Sequence paired-Ende 75 Basenpaar liest nach den Anweisungen des Herstellers. Nach unserer Erfahrung ist eine Spur aus, um 500-700x einzigartigen Sequenzabdeckung pro Probe über 279 Gene, die für einen Pool von 24 Proben. </li><li> Illumina-Software (Echtzeit-Analyse) werden Bilder mit hoher Auflösung, um die Cluster-Intensitäten zu konvertieren, um Anrufe und Qualitätswerte zu stützen. Verwenden casava Daten nach Barcode Identität demultiplexieren und erzeugen FASTQ einzelnen Dateien für jede Probe. </li></ol> 9. Daten Anallyse <ol><li> Trim-Adapter-Sequenzen vom 3&#39;-Ende der Sequenz liest FASTQ Dateien mit Cutadapt ( <a href="http://code.google.com/p/cutadapt/">http://code.google.com/p/cutadapt/</a> ). Die minimale Überlappungslänge (-O-) ist 3 mit einer Fehlerrate (-e) von 1%. Die minimale Basislänge für die Beibehaltung der gepaarten liest nach dem Trimmen ist 25. </li><li> Richten Folge liest den Referenz menschlichen Genoms hg19 mit der Burrows-Wheeler-Aligner-Tool (BWA) 12. Führen Nachbearbeitungsschritte einschließlich doppelte Kennzeichnung, lokale multiplen Sequenz-Neuausrichtung und Grundqualität Punktzahl Neukalibrierung mit Hilfe der Genomanalyse Toolkit (GATK) nach ihrer Standard-Best Practices ( <a href="http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic?name=best-practices">http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic? name = Best-Practices</a> ) 13. Beim Profiling mehrere Proben von dem gleichen Patienten (z. B. abgestimmt Tumor und normal), sollten die lokalen multiplen Sequenz Neuausrichtung leistungs seinMED gemeinsam. Die Ausgabe dieser Nachbearbeitungsschritte ist eine separate BAM-Datei für jede Probe, die alle Folge, Qualität und Ausrichtung Informationen enthält, und kann direkt in die Integrative Genomics Viewer (IGV) zur Visualisierung von Lese-und Sequenzvarianten 14 geladen werden. </li><li> Berechnen Sequenz Performance-Metriken mit Picard-Werkzeuge ( <a href="http://picard.sourceforge.net/">http://picard.sourceforge.net/</a> ). Informative Metriken sind Ausrichtung Rate Bruchgrößenverteilung, GC-Gehalt verbunden Deckung Bias, On-Target-Capture Spezifität PCR doppelte Rate, Bibliothek Komplexität und meine Zielabdeckung. Repräsentative Werte sind in Abbildung 1 dargestellt. Allelfrequenzen bei gemeinsamen Polymorphismusorten berechnet DepthOfCoverage von GATK werden verwendet, um Verunreinigungen von nicht verwandten DNA zu überwachen und sicherzustellen, dass die jeweiligen Proben von denselben Patienten kamen. Die folgenden Computeranalysen sind abhängig von der Gegenwart von passTumor-und normalen Proben für den Nachweis von somatischen genetischen Veränderungen. Unübertroffene Tumoren kann auch unter Verwendung eines separaten normalen Kontrollprobe analysiert werden, aber die meisten somatischen Mutationen können nicht leicht von ererbten Sequenzvarianten unterschieden werden. </li><li> Rufen somatischen Einzel-Nukleotid-Varianten (SNVs) für jeden Tumor-normales Paar mit einem somatische Mutation Anrufer, wie muTect 15, SomaticSniper 16 oder 17 Strelka. Wir verwenden muTect mit modifizierten Filterkriterien, so dass für Varianten mit niedriger (nicht Null) Allel zählt in der normalen Probe, solange die Allelfrequenz mindestens 5fach größer in den Tumor. Varianten immer wieder in einem Panel von normalen DNAs genannt werden so wahrscheinlich systematische Artefakte der Sequenzierung oder Ausrichtung entfernt. Jeder SNV vorbei Filter wird dann vorsichtig mit IGV prüft. </li><li> Rufen somatischen indels für jeden Tumor-normales Paar durch Algorithmen wie SomaticIndelDetector 13, Dindel 18 oder 19 SOAPindel </sup&gt;. Wir verwenden SomaticIndelDetector mit den folgenden Kriterien: mindestens 10% Allelfrequenz mit mindestens 3 Unterstützung liest, oder zumindest 2% Allelfrequenz mit mindestens 10 Stütz liest. Wir ermöglichen indels mit niedriger (nicht Null) Allel zählt in der normalen Probe, solange die Allelfrequenz mindestens 5fach größer in den Tumor. Indels in einem Panel von normalen DNA genannt werden entfernt, wie oben beschrieben. Jeder indel vorbei Filter wird dann vorsichtig mit IGV prüft. </li><li> Extrapolieren Kopienzahl-Status von der Sequenzabdeckung bei Ziel Exons. Für jede einzelne Probe, führen Sie eine Löss Normalisierung der mittleren Sequenzabdeckung für alle Ziel Exons, Regression über GC Prozentsatz. Stellen Sie die nicht-normierte Deckungswerte durch Subtraktion der Löss-Passform und Zugabe der Probe weite Median Abdeckung. Berechnen des Verhältnisses des normalisierten Sequenzabdeckung über alle Ziel Exons für Tumor-normal-Paaren. In Abwesenheit eines passenden normalen Probe und / oder Rauschen zu verringern, andere geschlechtsspezifische diploidennormalen Kontrollen fehlt Keimbahn-Kopienzahl-Varianten verwendet werden. Bestimmen Sie somatischen Kopienzahl Gewinne und Verluste, die auf Zu-oder Abnahmen in der Deckungsgrad. </li><li> Nennen somatischen Umlagerungen mit Krebsgenen, wobei mindestens ein Haltepunkt in der genomischen oder um gezielt Intervall des Genoms fällt. Empfohlene Algorithmen gehören GASV 20, 21 Breakdancer, CREST 22 und 23 Dranger. Intrachromosomalen Inversionen, Deletionen und Duplikationen Tandem kann basierend auf der relativen Position und Orientierung der Stütz in diskordanten Paaren liest unterscheiden. Alle Beitritts Umlagerungen sollte manuell mit IGV prüft werden. Wir empfehlen experimentellen Validierung von PCR-und Sanger-Sequenzierung über die mutmaßlichen Umlagerung Haltepunkte. </li></ol>

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+oncology+through+integrative+high-throughput+sequencing:+a+pilot+study.">Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study.</a> Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).</li><li>Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+high+throughput+sequencing+in+clinical+cancer+settings:+formaldehyde+fixed-paraffin+embedded+(FFPE)+tumor+tissues,+input+amount+and+tumor+heterogeneity.">Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity.</a> BMC Med. Genomics. 4, 68 (2011).</li></ol>

Dr. Berger hat Beratungshonorare und Forschungsförderung von Foundation Medicine, einer Krebsdiagnostik-Unternehmen erhalten.

Unsere IMPACT-Assay erzeugt eine hohe Rate Ausrichtung, hoch auf-Zielrate, hohe Zielabdeckung und hohe Empfindlichkeit zum Nachweis von Mutationen, indels, und Nummer des Exemplars Veränderungen. Wir haben die Leistungsfähigkeit unserer IMPACT-Assay auf DNA-Sequenz sowohl von frisch gefrorenem nachgewiesen und archiviert FFPE-Proben niedriger DNA-Eingang. Mit der Durchführung ziel Exon-Sequenzierung der wichtigsten Krebs-assoziierte Gene, kann man sehr tief Sequenzabdeckung für die Exons dieser kritischen Gene dadur...

Die Identifizierung der &quot;Fahrer&quot; Tumor genetischen Ereignissen in Schlüssel Onkogene und Tumorsuppressorgene, spielt eine wesentliche Rolle bei der Diagnose und Behandlung vieler Krebsarten 1. Großforschungsanstrengungen massiv parallele Sequenzierung Verwendung &quot;der nächsten Generation&quot; haben die Identifizierung von vielen solcher Krebs-assoziierte Gene, die in den letzten Jahren 2 freigegeben. Allerdings sind diese Sequenzierungsplattformen erfordern in der Regel große Mengen an DNA aus gefrorenem Frischgewebe isoliert und so posiert eine große Einschränkung in der Charakterisierung und Analyse von DNA-Mutationen von konservierten Geweben, wie Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Tumorproben. Verbesserte Bemühungen, effizient und zuverlässig charakterisieren &quot;verwertbare&quot; genomische Informationen aus FFPE Tumorproben die retrospektive Analyse von zuvor überhöhten Proben zu ermöglichen und weiter zu fördern, individuelle Ansätze, um Krebs-Management. Traditionell Molekular diagnostic Labors auf zeitraubende, geringe Durchsatz-Methoden wie die Sanger-Sequenzierung und Echtzeit-PCR für DNA-Mutation Profilierung verlassen. Neuerdings höhere Durchsatzverfahren unter Verwendung von PCR oder Multiplex-Genotypisierung massenspektrometrischen entwickelt worden, um wiederkehrende somatische Mutationen in Schlüsselkrebsgene 3-5 untersuchen. Diese Ansätze sind jedoch dadurch begrenzt, daß nur vorbezeichneten &quot;Hotspot&quot;-Mutationen untersucht, so dass sie zur Detektion inaktivierende Mutationen in Tumorsuppressorgenen ungeeignet. Massiv parallele Sequenzierung bietet mehrere Vorteile gegenüber diesen Strategien, einschließlich der Fähigkeit, ganze Exons für beide gemeinsame und seltene Mutationen zu verhören, die Fähigkeit, weitere Klassen von genomischer Veränderungen, die Kopienzahl Gewinne und Verluste zu offenbaren, und größere Nachweisempfindlichkeit in heterogenen Proben 6, 7 . Gesamtgenom-Sequenzierung stellt den umfassenden Ansatz für die Mutation Entdeckung, obwohl es relativ istly teuer und verursacht großen Rechenaufwand für die Datenanalyse und-speicherung. Für klinische Anwendungen, bei denen nur ein kleiner Anteil des Genoms von klinischem Interesse sein, insbesondere zwei Innovationen in Sequenzierungstechnologie haben transformierende. Erstens, durch Hybridisierung Exon-basierten Erfassung, kann man DNA, die Taste Krebs-assoziierte Gene, die für eine gezielte Mutation Profilierung 8 isolieren. Zweitens, durch Ligation der molekularen Barcodes (dh DNA-Sequenzen 6-8 Nukleotide in der Länge), kann man Hunderte von Proben pro Sequenzierungslauf bündeln und voll die Vorteile der immer größeren Kapazität von massiv-parallele Sequenzierung 10 Instrumente. In Kombination ermöglichen diese Innovationen Tumoren, für niedrigere Kosten profiliert werden und bei höheren Durchsatz, mit kleineren Rechenanforderungen 11. Ferner kann durch die Umverteilung Sequenzabdeckung auf jene Gene am wichtigsten für die bestimmte Anwendung, eine Achie könnenve größer Sequenzierung Tiefe für höhere Nachweisempfindlichkeit für niedrige Allelfrequenz Veranstaltungen. Hier beschreiben wir unsere IMPACT-Assay (Integrated Mutation Profiling von Action Krebs Targets), die Exon-Capture auf einer Barcode-Sequenzbibliothek Pools nutzt durch Hybridisierung unter Verwendung kundenspezifische Oligonukleotide, um alle Protein-kodierenden Exons zu erfassen und wählen Introns von 279 Schlüssel Krebs-assoziierte Gene (Tabelle 1 ). Diese Strategie ermöglicht die Identifikation von Mutationen, indels, Kopienzahl Änderungen, und wählen Sie Strukturänderungen im Zusammenhang mit diesen 279 Gene. Unsere Methode ist mit DNA aus sowohl frisch eingefroren und FFPE Gewebe sowie Feinnadelaspirate und andere Zellproben isoliert kompatibel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody> 
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext End Repair Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6050L</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext dA-Tailing Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6053L</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext Quick Ligation Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6056L</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:247px;">Beckman Coulter Genomics</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEXTflex PCR-Free Barcodes &#8211; 24</td>
			<td style="width:247px;">Bioo Scientific</td>
			<td style="width:137px;">514103</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HiFi Library Amplification Kit</td>
			<td style="width:247px;">KAPA Biosystems</td>
			<td style="width:137px;">KK2612</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">COT Human DNA, Fluorometric Grade</td>
			<td style="width:247px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:137px;">05 480 647 001</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit</td>
			<td style="width:247px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:137px;">05 634 261 001</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SeqCap EZ Library Baits</td>
			<td style="width:247px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:247px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28104</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit</td>
			<td style="width:247px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">Q32850</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit</td>
			<td style="width:247px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">Q32851</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agilent DNA HS Kit</td>
			<td style="width:247px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:137px;">5067-4626, 4627</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:247px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Covaris E220</td>
			<td style="width:247px;">Covaris</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Magnetic Stand-96</td>
			<td style="width:247px;">Ambion</td>
			<td style="width:137px;">AM10027</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Illumina Hi-Seq 2000</td>
			<td style="width:247px;">Illumina</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting somatic genetic alterations in tumor specimens by exon capture and massively parallel sequencing

Die Bemühungen um die Aufdeckung und Untersuchung von Schlüssel onkogenen Mutationen sind wertvoll, um die geeignete Behandlung für Krebspatienten erleichtern bewährt. Die Errichtung von Hochdurchsatz, massiv parallel sequencing &quot;nächsten Generation&quot; die Entdeckung von vielen solcher Mutationen unterstützt. Um die klinische und translationale Nutzen dieser Technologie zu verbessern, müssen Plattformen mit hohem Durchsatz, kostengünstig und mit Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebeproben, die kleine Mengen von degradierten oder beschädigte DNA ergeben können kompatibel sein. Hier beschreiben wir die Herstellung von Barcode-und Multiplex-DNA-Bibliotheken, gefolgt von der Hybridisierung-basierte Erfassung von Exons für den Nachweis von Krebs-assoziierte Mutationen in frisch eingefroren und FFPE Tumoren durch massiv parallele Sequenzierung. Dieses Verfahren ermöglicht die Identifizierung von Sequenzmutationen, die Kopienzahl Änderungen, und wählen strukturelle Umlagerungen gezielte Einbeziehung aller Gene. Gezielte Exon-Sequenzierung bietet ter profitiert von hohen Durchsatz, geringe Kosten, und tiefe Sequenzabdeckung gelegt und somit hohe Empfindlichkeit zum Nachweis von Niederfrequenz-Mutationen.

Ein Pool von 24 Bibliotheken mit Barcode-Sequenz (12 Tumor-normal-Paare) wurde mit Sonden, die allen Protein-kodierenden Exons von 279 Krebs-Gene erfasst und sequenziert, wie 2 x 75 bp liest auf einer einzigen Spur einer HiSeq 2000 Durchflusszelle. Tumor-und Normal Bibliotheken wurden in einem Verhältnis von 2:1 vereinigt. Beispiel Performance-Metriken für einen Pool von gefrorenen Tumor DNA-Proben sind in Abbildung 1 dargestellt, einschließlich Ausrichtung Rate Bruchgrößenverteilung, On-Target-Cap...

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Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Wir beschreiben die Herstellung von mit Strichcode-DNA-Bibliotheken und die anschließende Hybridisierung Basis Exon Erfassung zur Erkennung von Schlüssel Krebs-assoziierten Mutationen in der klinischen Tumorproben von massiv parallelen Sequenzierung der &quot;nächsten Generation&quot;. Gezielte Exon-Sequenzierung bietet die Vorteile der hohen Durchsatz, geringe Kosten, und tiefe Sequenzabdeckung, woraus sich eine hohe Empfindlichkeit zum Nachweis von Niederfrequenz-Mutationen.

Erkennen Somatische Genetische Veränderungen in Tumorproben von Exon-Abscheidung und-Massively Parallel Sequencing

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

detecting-somatic-genetic-alterations-tumor-specimens-exon-capture

Research

JoVE Journal

Biology

19.3K Aufrufe.  Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.  Wir beschreiben die Herstellung von mit Strichcode-DNA-Bibliotheken und die anschließende Hybridisierung Basis Exon Erfassung zur Erkennung von Schlüssel Krebs-assoziierten Mutationen in der klinischen Tumorproben von massiv parallelen Sequenzierung der "nächsten Generation". Gezielte Exon-Sequenzierung bietet die Vorteile der hohen Durchsatz, geringe Kosten, und tiefe Sequenzabdeckung, woraus sich eine hohe Empfindlichkeit zum Nachweis von Niederfrequenz-Mu...

Serie: Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-Lymphozyten Erfassen mit einem Einweg-Mikrofluidik-Chip für HIV

Forschung

Biologie

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify&#160;unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3&#8217;- and 5&#8217;- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.

Linear Amplification Mediated PCR &amp;#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear-amplification mediated (LAM)-PCR is a method developed to identify the exact positions of integrating viral vectors in the genome. The technique has evolved to be the superior method to study clonal dynamics in gene therapy patients, biosafety of novel vector technologies, T-cell diversity, cancer stem cell models, etc.

Linear Amplification vermittelte PCR - Lokalisierung von genetischen Elementen und Charakterisierung von Unbekannt flankierenden DNA-

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

Wohnung Berge Vorbereitung für Beobachtung und Analyse der Zebrafisch-Embryo Proben von Bunt Ganze Berge<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Massively Parallel Reporter Assays in kultivierte Säugerzellen

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal Glucocorticoid-Analyse: Nicht-invasive Monitoring-Adrenal in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA-Sequenzierung Assay Gezieltes Genexpression und Genomic Änderungen an Charakterisieren

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.