Dominic Mills wurde von einem Bloomsbury Colleges Doktoratsstipendium (2007-2010) unterstützt. Die Autoren möchten sowohl Ozan Gundogdu und Abdi Elmi für ihre Unterstützung bei der Entwicklung des VDC Modell danken.

1. Das Wachstum der IEC Monoschichten auf Spezial 0,4 um Filter <ol><li> Kultur Caco-2-Zellen in modifiziertem essentiellen Dulbecco (DMEM) mit 10% (v / v) fötalem Kälberserum, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 1% (v / v) nicht-essentielle Aminosäuren in einem ergänzt Standard-Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C in 5% CO 2 und 95% Luft. Seed 4 x 10 5 Caco-2 IECs pro 0,4 um Filter zu wachsen Polarisation über 21 Tage, die Änderung der Medien alle 2-3 Tage. </li><li> Messen Sie den TEER der Polarisation Status der Monoschicht mit einem Volt-Ohm-Widerstand Meter bestätigen. In unseren Studien, die TEER von 21 Tage Caco-2-Zellen in diesen 0,4 um Filter gewachsen ist 700-800 Qcm 2. </li></ol> 2. Herstellung von C. jejuni und die bakterielle Medium für die Co-Kultivierung Assay <ol><li> 24 Stunden vor dem gewünschten Startpunkt des VDC Cokultivierung Assay, eine frische Agarplatte von C. jejuni und bei 37 ° C unter mikroaeroben Bedingungen (85% N 2, 5% O 2 und 10% CO 2) in die Atmosphäre variable Inkubator. </li><li> Zur gleichen Zeit, vorinkubiert 30 ml der Schaf-Brühe bei 37 ° C unter mikroaeroben Bedingungen in einer Variablen Atmosphäre inkubiert. </li></ol> 3. Aufbereitung und Sterilisation der VDC Halbkammern Vor dem Assay <ol><li> Vollständig einzutauchen VDC Halbkammern sowie die O-Ringe und die Stecker in der Sterilisation Lösung. </li><li> Mit einem sterilen 20 ml Spritze, spülen Sie die Lösung durch die Sterilisation Gaseinlässen in beiden Kammern die Hälfte. Andernfalls kann eine Kontamination der Proben während der Co-Kultivierung führen. </li><li> Lassen Sie alle Komponenten in der Sterilisation Lösung für&gt; 1 h eingetaucht. </li><li> Spülen Sie alle Teile mit frischem sterilem Wasser, mit einem anderen sterilen 20 ml Spritze, die Gaseinlässen spülen. </li></ol> 4. Vorbereitungdes bakteriellen Inokulums <ol><li> Ernte Hälfte eine Platte von C. jejuni Wachstum aus dem Blut-Agar-Platte vorbereitet am Vortag in 1 ml der vorinkubierten Brucella Brühe. Dies sollte zu ~ 10 10 KBE / ml. </li><li> Anschließend wird die optische Dichte der Bakteriensuspension bei 600 nm, um bakterielle Kolonie bildenden Einheiten (KBE) semiquantify. </li><li> Stellen Sie die Bakteriensuspension auf die gewünschte Ebene Inokulum in 4 ml des vorinkubierten Brucella Brühe. </li><li> Durchführen einer Verdünnungsreihe von diesem letzten Bakteriensuspension durch Plattieren der geeigneten Verdünnungen auf Blut-Agar-Platten in dreifach, dann bei 37 ° C im Brutschrank inkubieren variable Atmosphäre für 48 Stunden, um die Anzahl von Bakterien in der KBE Inokulum quantifizieren gefolgt. </li></ol> 5. Einrichten des VDC <ol><li> Legen Sie die untere Hälfte Kammer eines VDC flach auf der Bank. Fit einen O-Ring auf die untere Hälfte der Kammer. </li><li> Nehmen Sie einen Filter tragen die IECs von ter Träger und dreimal mit 400 ul sterilem PBS. Setzen Sie den Filter auf der unteren Hälfte der Kammer, so dass der O-Ring an seinem Platz bleibt. </li><li> Senken Sie die obere Hälfte Kammer einrastet. Sobald die beiden Halbkammern zusammengebaut, spannen zusammen mit den Ring-Klemmen. Legen Sie das VDC horizontal auf der Tischplatte, mit den beiden Öffnungen nach oben. </li><li> Fügen Sie die 4 ml Bakterieninokulum in die apikale Hälfte Kammer. </li><li> 4 ml Zellkulturmedium in der basolateralen Halbkammer. </li><li> Legen Sie die Endstücke in die Öffnungen auf beiden Halbkammern. </li></ol> 6. Anbringen des VDC zur Gasversorgung in der Variable Atmosphäre Incubator <ol><li> Legen Sie das VDC in die Variable Atmosphäre Inkubator in unmittelbarer Nähe zum Gasverteiler. </li><li> Öffnen Sie die Gaszufuhr Regler mit dem Gasverteiler. Befestigen Sie den Schlauch vom Verteiler in die Gas-Einlass auf der basolateralen Hälfte Kammer des VDC. Befestigen Sie die gas Auslassrohr, die aus der variablen Stimmung Inkubator zu einem der Auslässe in dem Endstück an der basolateralen Halbkammer. </li><li> Schließen Sie das andere Steckdose in der Ende-Stück auf der basolateralen Halbkammer. Öffnen Sie die Gaszufuhr an der Gasverteiler, kümmert sich um sie sehr langsam öffnen, um überschüssige Gasdruck zu vermeiden, da dies zu einer Vertreibung der basolateralen Medium führen kann. </li><li> Das Ziel ist ein Gasstrom von 1 Blase alle 2-5 sec. Regelmäßig auf den Gasstrom überprüfen im Laufe des Experiments und gegebenenfalls einstellen. </li></ol> 7. Demontage des VDC nach Cokultur <ol><li> Nach der entsprechenden Kokultur Zeit, schließen Sie die Gaszufuhr Regler mit dem Gasverteiler. Schließen Sie die Gaszufuhr in die VDC am Verteiler. Trennen Sie das Gas Einlass, den Gasaustritt und den Stopfen aus dem VDC. </li><li> Entfernen Sie das VDC von einer variablen Atmosphäre Inkubator. Entfernen Sie die apikalen und basolateralen Überstände und bei -80 ° C für subsequent Analyse. </li><li> Entfernen Sie die Ringklemmen und sanft auseinander nehmen das VDC. Entfernen Sie den Filter von der Hälfte der Kammer und den Transfer in eine sterile 6-well Zellkulturschale. Waschen Sie die IECs dreimal mit 400 ul sterilem PBS. </li><li> Zur Zählung der Gesamtzahl der Bakterien interagieren, werden 400 ul sterilem PBS, enthaltend 0,1% (v / v) Triton X-100 zu den IECs und Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur, um die IEC lysieren. Durchführen einer Verdünnungsreihe von diesem Zelllysat durch Plattieren der geeigneten Verdünnungen auf Blut-Agar-Platten in dreifach, dann bei 37 ° C im Brutschrank inkubieren variable Atmosphäre für 48 Stunden, um die Anzahl von interagierenden bakterielle KBE quantifizieren gefolgt. </li><li> Zur Zählung der Gesamtzahl der eindringenden Bakterien, fügen Sie 400 ul DMEM Zellkulturmedium enthaltend 150 ug / ml Gentamicin den IECs und Inkubation für 2 Stunden in einem Standard-Zellkultur-Inkubator bei 37 ° C in 5% CO 2 und 95% Luft, um extrazelluläre Bakterien abzutöten,dann wie für Schritt 7.4 oben folgen. </li></ol> 8. Reinigung des VDC nach Cokultur Waschen Sie die VDC mit sterilem Wasser und Speicher für die nächste Runde der Experimente.

<ol>
	<li>Mills, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+Campylobacter+jejuni+invasion+of+intestinal+epithelial+cells+under+low-oxygen+coculture+conditions+that+reflect+the+in+vivo+environment.">Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment.</a> Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).</li><li>Marteyn, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Shigella+virulence+in+response+to+available+oxygen+in+vivo.">Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo.</a> Nature. 465, 355-358 (2010).</li><li>Dorrell, N., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+century+of+Campylobacter+research:+recent+advances,+new+opportunities+and+old+problems.">The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).</li><li>Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+jejuni:+molecular+biology+and+pathogenesis.">Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).</li><li>Hu, L., Kopecko, D. J., Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+17.">Chapter 17.</a> Campylobacter. , 297-313 (2008).</li><li>Everest, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+Caco-2+cells+as+a+model+for+enteric+invasion+by+Campylobacter+jejuni+and+C.+coli.">Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli.</a> J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).</li><li>Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+the+internalization+and+intracellular+survival+of+Campylobacter+jejuni+in+human+epithelial+cell+cultures.">Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures.</a> Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).</li><li>Monteville, M. R., Konkel, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-facilitated+invasion+of+T84+eukaryotic+cells+by+Campylobacter+jejuni+occurs+preferentially+at+the+basolateral+cell+surface.">Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface.</a> Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).</li><li>Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+culture+methods+for+investigating+Campylobacter+invasion+mechanisms.">In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms.</a> J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).</li><li>Schuller, S., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microaerobic+conditions+enhance+type+III+secretion+and+adherence+of+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+to+polarized+human+intestinal+epithelial+cells.">Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells.</a> Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).</li><li>Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microaerophilic+conditions+permit+to+mimic+in+vitro+events+occurring+during+in+vivo+Helicobacter+pylori+infection+and+to+identify+Rho/Ras-associated+proteins+in+cellular+signaling.">Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling.</a> J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die Verwendung von in vitro-Zellkultur Methoden, um die Wechselwirkungen von bakteriellen Erregern mit Wirtszellen zu studieren, ist eine Technik, die weit verbreitet in vielen Forschungslabors eingesetzt. Jedoch als solche Zellkultur-Assays unter aeroben Bedingungen durchgeführt wird, diese in-vitro-Modellen nicht genau den in-vivo-Umgebung, wobei der Wirt-Pathogen-Interaktionen stattfinden. Die weit verbreitete Infektion in vitro Modelle sind besonders ungeeignet für das Studium m...

Die Wechselwirkungen von bakteriellen Erregern mit Wirtszellen wurden ausgiebig mit in vitro Zellkultur Methoden untersucht. Mit solchen Zellkulturassays, bakterielle Adhäsion an Wirtszellen, die Identifizierung von Wirtszellen Rezeptoren Wirtszelle Signalwege und Bakterienbefall von Wirtszellen sind alle im Detail untersucht, was in vielen wichtige Beobachtungen. Jedoch sind solche Zellkultur-Assays werden unter aeroben Bedingungen, die nicht repräsentativ für die in vivo-Umgebung kann durchgeführt. Eine wesentliche Einschränkung der in-vitro-Modellen verwendet werden, um Magen-Darm-Infektionen zu studieren, ist, dass die Kultur Bedingungen, einschließlich hoher Sauerstoffgehalt im Allgemeinen bevorzugen eukaryotischen Zelle Überleben. Allerdings Bedingungen im Darmlumen wird fast anaerob. Darmpathogene in sehr sauerstoffarmen Umgebung auszudrücken Virulenz Gene, deren Expression Änderungen unter aeroben Bedingungen 2. Als solche erhaltenen Daten unter Verwendung von Standard Zellkulturmodellen may geben eine ungenaue Angabe von bakteriellen Interaktionen mit Wirtszellen. Campylobacter jejuni ist der führende Erreger der bakteriellen akuten Gastroenteritis weltweit, mit Symptomen, die reichen von leichtem Durchfall bis zu schweren entzündlichen Darmentzündungen. Die meisten C. jejuni Infektionen führen unkomplizierten Gastroenteritis, aber C. jejuni ist auch der am häufigsten identifizierte Erreger in peripheren Neuropathien einschließlich Guillain-Barré-Syndrom (GBS). In Großbritannien wird geschätzt, dass es mehr als 500.000 Fälle von Enteritis verursacht durch C. jejuni-Infektion jedes Jahr mit einem prognostizierten Kosten für die britische Wirtschaft von £ 580.000.000. In den Entwicklungsländern, C. jejuni ist eine der Hauptursachen für die Sterblichkeit bei Kindern. Trotz der unbestrittenen Bedeutung von Campylobacter-Infektion und Jahrzehnten der Forschung, einschließlich einer gründlichen Genomik-basierte Analyse, C. jejuni Pathogenese ist noch weitgehend understood, im Gegensatz zu anderen enterischen Pathogenen wie Salmonella, Escherichia coli, Shigella und Vibrio cholerae. Der Mangel an einem geeigneten Tiermodell kleine ist ein wesentlicher Grund für diese 3. Auch die weit in vitro Infektion verwendeten Modelle sind ungeeignet für das Studium mikroaerophilen C. jejuni als für andere Darmpathogene, die fakultativ anaerob sind. Während C. jejuni als invasive Erreger, die Mechanismen von C. anerkannt jejuni Invasion von intestinalen Epithelzellen (IECs) sind noch unklar 4,5. C. jejuni Invasion hat sich gezeigt, dass in Abhängigkeit von entweder Mikrofilamente, Mikrotubuli, eine Kombination von beiden oder keiner 5. Die Verwirrung in diesem Bereich ist sehr wahrscheinlich auf die Verwendung ungeeigneter in vitro Assay-Bedingungen. Eine Reihe von verschiedenen Zellkultur-Assays verwendet wurden, um die Wechselwirkungen zu untersuchen C. jejunimit Wirtszellen. Caco-2-6 wurden 407 INT 7 und 8 T84 Zelllinien alle verwendet worden, um die Adhäsion und Invasion Fähigkeiten verschiedener C. studieren jejuni Stämme. Jedoch sind die Werte der bakteriellen Adhäsion und Invasion von C. jejuni mit IECs sind dramatisch niedriger als bei anderen Darmpathogene 9. Die Co-Kultivierung von C. jejuni mit IECs wird normalerweise in einem CO 2-Inkubator unter Bedingungen nahe dem atmosphärischen Sauerstoff durchgeführt wird, erforderlich für das Überleben der IECs. C. jejuni Genexpression wird sehr unterschiedlich in der sauerstoffarmen Umgebung der Darmlumen gegenüber Luftsauerstoff Bedingungen. Die Verwendung einer Vertikal Diffusionskammer (VDC-System) entwickelt worden, die erlaubt die Co-Kultivierung von Bakterien und Wirtszellen unter anderen Medium und Gas Bedingungen 1,10,11. Dieses System ahmt die Bedingungen im menschlichen Darm, wo Bakterien un wirdder Bedingungen des sehr niedrigen Sauerstoff während Gewebe wird mit Sauerstoff aus dem Blutkreislauf zugeführt werden. Polarized IEC Monoschichten in speziellen 0,4 um Filter angebaut wurden in einen VDC Schaffung einer apikalen und basolateralen Kammer, die einzeln mit bakteriellen Brühe und Zellkulturmedium bzw. (Abbildung 1) wurden gefüllt ist. Das VDC wurde in die Variable Atmosphäre Inkubator mit 85% N 2, 5% O 2 und 10% CO 2 bei 37 ° C, was optimale Bedingungen für C. platziert jejuni. Der apikale Kammer offen gelassen wurde und ausgesetzt, um die Atmosphäre innerhalb des mikroaerobe variable Atmosphäre Inkubator, während der abgedichtete basolateralen Kammer mit Sauerstoff durch konstante Verabreichung von 5% CO 2/95% O 2-Gasgemisch mit einem Auslaßrohr die Ansammlung von Druck zugeführt . Caco-2-Zell-Überleben und die Monoschicht Integrität unter diesen Bedingungen wurden durch die Überwachung der transepithelialen ele bestätigtctrical Widerstand (TEER) durch die Monoschicht über 24 h nachzuweisen Überleben des Caco-2-Zell-Monolayer und physikalische Trennung der apikalen und basolateralen Kompartimenten unter niedrigen Sauerstoffgehalt in der apikalen Kammer. Der TEER von Monoschichten in VDCs in der Variablen Atmosphäre Inkubator (mikroaeroben Bedingungen) und in einem Standard-Zellkultur CO 2-Inkubator (aeroben Bedingungen) beibehalten zeigten keine signifikanten Unterschiede, was darauf hinweist Integrität der Zellschicht unter verschiedenen atmosphärischen Bedingungen 1. Unter mikroaeroben Bedingungen blieb Tight Junctions Gegenwart und gleichmäßig zwischen den Zell-Grenzen mit einer Occludin Färbungsmusters ähnlich Zellen unter aeroben Bedingungen gehalten 1 verteilt. Die Wechselwirkungen von C. jejuni Caco-2 und T84-Zellen in der VDC wurden durch die Bewertung bakteriellen Wechselwirkung (Adhäsion und Invasion) und Invasion untersucht. Zwei verschiedene C. jejuni Wildtyp Strains wurden 1 verwendet. C. jejuni 11168H eine hypermotile Derivat der ursprünglichen Sequenz Stamm NCTC11168. Die 11168H Stamm zeigt viel höhere Besiedlung Ebenen in einem Küken Kolonisation Modell und ist somit eine geeignete Sorte für Wirt-Pathogen-Interaktion Studien verwenden berücksichtigt. 81 bis 176 ist eine menschliche isolieren und ist eine der häufigsten untersuchten invasive Laborstämme. C. jejuni Stämme wurden zur apikalen Abteil eines VDC entweder unter mikroaeroben oder aeroben Bedingungen aufgenommen. Wir beobachteten höheren Raten sowohl für Interaktion und Invasion von C. wurden aufgezeichnet jejuni unter mikroaeroben Bedingungen 1. Die erhöhte C. jejuni-Wechselwirkungen nicht aufgrund einer Zunahme der Bakterienzahl unter mikroaeroben Bedingungen 1. Diese Daten stützen die Hypothese, dass die sauerstoffarme Umgebung in der apikalen Kammer des VDC Bakterien-Wirt-Wechselwirkungen erhöht und zeigt an, dass die invasive Eigenschaften C. jejuni sind incrgelockert unter diesen Bedingungen. Dies war der erste Bericht über die Verwendung der VDC-Modell, um eine invasive bakterielle Krankheitserreger studieren und unterstreicht die Bedeutung der Durchführung in vitro-Assays Infektion unter den Bedingungen, dass mehr genau imitieren die in vivo Situation. Das VDC Modell könnte verwendet werden, um die Wirt-Pathogen-Interaktionen für viele verschiedene Bakterienarten zu untersuchen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>66-0001</td>
			<td>Manifold &#38; six Snapwell chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>66-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-rings</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>66-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>66-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snapwell filters (pore size 0.4 &#956;m)</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WPA Lightwave II spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>80-3003-72</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enteric bacterial invasion of intestinal epithelial cells in vitro is dramatically enhanced using a vertical diffusion chamber model

Die Wechselwirkungen von bakteriellen Erregern mit Wirtszellen wurden ausgiebig mit in vitro Zellkultur Methoden untersucht. Jedoch als solche Zellkultur-Assays unter aeroben Bedingungen durchgeführt wird, diese in-vitro-Modellen nicht genau den in-vivo-Umgebung, wobei der Wirt-Pathogen-Interaktionen stattfinden. Wir haben ein in vitro-Modell der Infektion, die Kokultur von Bakterien und Wirtszellen ermöglicht unter verschiedenen mittel-und Gas-Bedingungen entwickelt. Die vertikale Diffusion Chamber (VDC) Modell imitiert die Bedingungen im menschlichen Darm, wo Bakterien unter Bedingungen mit sehr niedrigen Sauerstoff während Gewebe sein wird mit Sauerstoff aus dem Blutkreislauf zugeführt werden. Platzieren polarisiert intestinalen Epithelzellen (IEC) in Monoschichten Snapwell Einsätze in einer VDC gewachsen erstellt separate apikalen und basolateralen Kompartimenten. Basolateralen Kompartiment mit Zellkulturmedium gefüllt, verschlossen und mit Sauerstoff durchströmt während die apikale Fach mit Brühe gefüllt ist, offen gehalten und inkubiert unter mikroaeroben Bedingungen. Sowohl Caco-2 und T84 IECs können im VDC unter diesen Bedingungen ohne ersichtlichen nachteilige Auswirkungen auf das Überleben der Zelle oder Monoschicht Integrität beibehalten. Cokultivierung Experimente mit verschiedenen C durchgeführt jejuni Wildtyp-Stämme und unterschiedliche IEC Linien in der VDC-Modell mit mikroaeroben Bedingungen in der apikalen Kammer reproduzierbar in einer Erhöhung der Anzahl der Interaktion (nahezu 10-fach) und intrazelluläre (fast 100-fach) Bakterien gegenüber aeroben Kulturbedingungen führen 1. Das Umfeld, in dem VDC-Modell erstellt mehr imitiert die Umwelt durch C. angetroffen jejuni im menschlichen Darm und unterstreicht die Bedeutung der Durchführung in vitro Infektion Assays unter Bedingungen, die stärker die in vivo Realität zu imitieren. Wir schlagen vor, dass die Verwendung des VDC-Modell ermöglicht neue Interpretationen der Wechselwirkungen wettenween bakterielle Erreger und Wirtszellen.

Cokultivierung Experimente mit einer C durchgeführt jejuni Wildtypstamm und IECs in der VDC-Modell mit mikroaeroben Bedingungen in der apikalen Kammer einen Anstieg in der Anzahl der Interaktion (nahezu 10-fach) und intrazelluläre (fast 100-fach) Bakterien gegenüber aeroben Kulturbedingungen in einem Zeitpunkt nachgewiesen -abhängigen Weise 1. Diese Beobachtung war reproduzierbar mit zwei verschiedenen C. jejuni Wildtypstämmen (11168H und 81-176) und zwei verschiedene IEC-Leitu...

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Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Durchführen Zellkultur-Assays zur Untersuchung von bakteriellen Adhäsion und Invasion unter aeroben Bedingungen in der Regel nicht repräsentativ für die<em&gt; In vivo</em&gt; Umwelt. Eine Vertikale Diffusion Chamber Modell ermöglicht Untersuchung der Wechselwirkungen des menschlichen Erreger<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Mit intestinalen Epithelzellen unter mehr<em&gt; In vivo</em&gt;-Ähnlichen Bedingungen, was zu einer erhöhten bakteriellen Invasion.

Enteric bakterielle Invasion von intestinalen Epithelzellen<em&gt; In Vitro</em&gt; Ist erheblich verstärkt unter Verwendung eines vertikalen Diffusion Chamber Modell

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

enteric-bacterial-invasion-intestinal-epithelial-cells-vitro-is

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

13.7K Aufrufe.  London School of Hygiene & Tropical Medicine. Durchführen Zellkultur-Assays zur Untersuchung von bakteriellen Adhäsion und Invasion unter aeroben Bedingungen in der Regel nicht repräsentativ für die In vivo Umwelt. Eine Vertikale Diffusion Chamber Modell ermöglicht Untersuchung der Wechselwirkungen des menschlichen Erreger Campylobacter jejuni Mit intestinalen Epithelzellen unter mehr In vivo-Ähnlichen Bedingungen, was zu einer erhöhten bakteriellen Invasion.

Serie: Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

In-vitro-Bildung von Biofilmen in einem 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Mit Luciferase to Image Bakterielle Infektionen bei Mäusen

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

Invasion von menschlichen Zellen durch einen bakteriellen Erreger

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

In-vitro-Assay der bakteriellen Adhäsion auf Mammalian Epithelzellen

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Die Anwendung eines Maus Ligierte Peyer-Patch-Darmschlinge Assay zu bakterielle Aufnahme von M-Zellen auswerten

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and human diseases have been and continue to be extensively documented. These roles include influences on infectious and non-infectious diseases including prevention of inflammation as well as mucosal immunity to infectious diseases. Cholera is an acute intestinal illness caused by the bacterium Vibrio cholerae. It occurs in developing nations and if left untreated, can result in death. While vaccines for cholera exist, they are not always effective and other preventative methods are needed. We set out to determine tolerable concentrations of three fatty acids (oleic, linoleic and linolenic acids) and cholera toxin using mouse BALB/C macrophages and human intestinal epithelial cells, respectively. We solubilized the above fatty acids and used cell proliferation assays to determine the concentration ranges and specific concentrations of the fatty acids that are not detrimental to human intestinal epithelial cell viability. We solubilized cholera toxin and used it in an assay to determine the concentration ranges and specific concentrations of cholera toxin that do not statistically decrease cell viability in BALB/C macrophages. 
We found the optimum fatty acid concentrations to be between 1-5 ng/&mu;l, and that for cholera toxin to be &lt; 30 ng per treatment. This data may aid future studies that aim to find a protective mucosal role for fatty acids in prevention or alleviation of cholera infections.

We set out to determine tolerable concentrations of three fatty acids (oleic, linoleic and linolenic acids) and cholera toxin that did not significantly and adversely affect cell survival by solubilizing the fatty acids and the toxin and using them in cell survival assays.

Bestimmung der tolerierbaren Fettsäuren und Cholera Toxin-Konzentrationen mit menschlichen Darm-Epithelzellen und BALB / c Maus-Makrophagen

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

In vitro Coculture Assay zur Bewertung pathogeninduzierter Neutrophiler Transepithelmigration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

Beurteilung der bakteriellen Invasion von Herzzellen in Kultur und Herzkolonisation bei infizierten Mäusen mit Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

Immunfluoreszenzanalyse der Stressgranulat-Bildung nach bakterieller Herausforderung von Säugetierzellen

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Ein High-Throughput- Shigella-spezifischen bakterizide Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...