Diese Arbeit wurde von der Wellcome Trust (WT 0795880) gefördert.

Das folgende Protokoll beschreibt die Studie von Endothelzellen Invasion von S. aureus kann aber theoretisch zur zellulären Invasion von jedem kultivierbaren Bakterien zu untersuchen. Stages speziell auf S. aureus und Endothelzellen werden angezeigt. 1. Vorbereitung der Bakterien <ol><li> Kultur S. aureus-Stämme für 4-16 h (je nach Wachstumsphase erforderlich) in 10 ml Brain-Heart Infusion (BHI) Brühe bei 37 ° C in Luft unter Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute. Diese Wachstumsbedingungen sind spezifisch für S. aureus und müssen unter Umständen für andere Bakterien adaptiert werden. </li><li> Wash Bakterien dreimal in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM; Invitrogen) durch abwechselnde Runden Zentrifugation bei Raumtemperatur (5.000 x g, 10 min), Entfernung der Kulturüberstand und Resuspension der Bakterienpellet in gleichwertigem Umfang DMEM. Die optische Dichte der erhaltenen Suspension von Bakterien, die dann nach Bedarf eingestellt werden kann. Für S. aureus, bereiten wir eine Suspension bei OD 600 = 1, was auf ~ 10 9 cfu ml -1 entspricht. </li></ol> 2. Endothelial Cell Culture <ol><li> Und L-Glutamin (2 mM) bei 37 ° C in 5% CO 2; Kultur der endothelialen Zelllinie EA.hy926 1 in DMEM mit fetalem Rinderserum (10% FBS) ergänzt. Alternativ können gebündelt primären humanen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVECs) von Lonza (Basel, Schweiz) erworben werden und kultiviert in endotheliale basalen Medium mit 2% FBS, Rinderhirn-Extrakt (einschließlich Heparin), Human endothelial growth factor und Hydrocortison bei 37 ergänzt ° C in 5% CO 2 nach den Anweisungen des Herstellers (Lonza). Diese Wachstumsbedingungen sind spezifisch für diese Zellen und müssen unter Umständen für andere Wirtszelle Typen angepasst werden. </li><li> Wachsen Endothelzellen in T75 Flaschen in Anspruch Konfluenz, verifiziert durch Auge. </li><li> Bereiten Sie die 24-Well-Platten für die Einfügung der Deckgläser. Feine Pinzette (Flamme sterilisiert) werden benötigt, um die Deckgläser, die eine undurchsichtige und eine glänzende Oberfläche haben zu bewegen. Legen Sie Deckgläschen in die Vertiefungen der 24-Well-Platte mit der undurchsichtige Fläche nach oben, um Zelladhäsion ermöglichen. </li><li> Liberate Zellen aus dem T75 Kolben mit 3 ml Trypsin-EDTA (0,25%) und fügen Sie 10 ml des jeweiligen Kulturmediums. </li><li> Add 500 ul der resuspendierten Zellen auf 24-Well-Platten mit Thermanox Deckgläschen. Eine T75 konfluenten Flasche von Zellen zur Verfügung gestellt genügend Zellen für zwei 24-Well-Platten, was in etwa 5 × 10 5 Zellen pro Well (in 500 ul Medium). </li><li> Die Platten für 48 h, wie oben beschrieben, und überprüfen Sie 100% Zellkonfluenz durch invertierte Lichtmikroskopie. </li><li> Dip-wash Deckgläschen in PBS und in den neuen 24-Well-Platten mit 490 ul DMEM mit 10% FBS in jede Vertiefung. </li><li> Um zu untersuchen, die Rolle spezifischer Stoffwechselvorgänge in der Zelle Invasion, können Inhibitoren auf die kultivierten Zellen 1 h vor der Zugabe von Bakterien und Konzentrationen während des Tests beibehalten hinzugefügt werden. Zum Beispiel, um zu bestimmen, die Rolle des Aktin-Umlagerung in S. aureus Invasion von Endothelzellen, 50 uM Cytochalasin D hinzugefügt werden, oder für die Rolle der Caveolae, 5 mM Methyl-β-Cyclodextrin hinzugefügt werden können. </li></ol> 3. Invasion Assay <ol><li> Add 10 ul gewaschenen Bakterien (was in etwa 2 × 10 7 cfu ml -1 S. aureus) in jede Vertiefung mit einem gewaschenen Deckgläschen mit einem konfluente Schicht von Endothelzellen in 490 ul DMEM mit 10% FBS. </li><li> Inkubieren 15-90 Minuten bei 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> Zur Messung der Gesamtzahl der Bakterien mit den Zellen (adhärent und verinnerlicht) verbunden sind, Dip-waschen Deckgläser dreimal in PBS und fügen an die frische Vertiefungen mit 500 ul 0,5% Triton X-100 in PBS. Um die Zellen vollständig zu lysieren zu lassen und alle verinnerlicht Bakterien, die Pipette mehrmals und wies die Spitze der Pipette direkt auf die Oberfläche des Deckglases. </li><li> Zählt die Bakterien durch Ausplattieren der flüssigen Suspension (oder Verdünnungen dieser wenn nötig) auf die Oberfläche des TSA-Platten. Da TX-100 viele Gram-negative Bakterien lysieren will, kann Saponin statt 2 verwendet werden. </li><li> Zur Messung der Anzahl der internalisierten Bakterien, entfernen Sie den Kulturüberstand aus jedem Well mit ungebundenen Bakterien und ersetzen mit 500 ul DMEM/10% FBS mit 200 pg ml -1 Gentamycin ergänzt. Wir verwenden routinemäßig Gentamicin anstatt Lysostaphin hier, da es billiger ist, und erlaubt uns, zwischen den Experimenten mit verschiedenen Arten von Bakterien (zB Staphylokokken und Laktokokken), ohne die experimentelle Protokoll ändern zu wechseln. </li><li> Die Platten bei 37 ° C in 5% CO 2 für 60 min, alle extrazellulären Bakterien abzutöten. </li><li> Wash Deckgläschen 3 mal in PBS,lysieren und durch Ausplattieren auf TSA aufzählen, wie beschrieben für die Adhäsionsassay oben. </li><li> In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, visuell zählen die Anzahl der Bakterien mittels Lichtmikroskopie. In diesem Fall, und spezifisch für S. aureus Zellinvasion, verwenden Lysostaphin (10 ug ml -1) anstelle von Gentamicin, physisch zu zerstören die extrazelluläre Bakterien. </li><li> Inkubieren Deckgläser für 20min bei 37 ° C in CO 2 in die Lysostaphin-Lösung, dann spülen und fix mit Cytopath (Cellpath). </li><li> Flood die Deckgläser mit Kristallviolett (0,5%, w / v) für 5min. </li><li> In Wasser, Luft trocknen Dip-Spül-und Montage auf Glas-Objektträger. Die Anzahl der Bakterien pro mm 2 der konfluenten Endothelzellen quantifiziert mittels Lichtmikroskopie werden. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Expression von Fibronektin bindende Proteine ​​(FnBPA und FnBPB) auf der Oberfläche von S. aureus verleiht die Fähigkeit, Endothelzellen einzudringen. Neuere Arbeiten haben neu die Fibronektin-bindende Domäne von FnBPA 3. Wild-Typ (WT) S. aureus 8325,4 dringt Endothelzellen mit hoher Effizienz, während eine Belastung fehlen sowohl FnBPA und B (Δ FNB) zeigten eine signifikant reduzierte Mengen an Internalisierung (Abbildung 1A). Die Komplementation der Mutante mit einem Plasmid kodiert fnb A minus der Fibronektin-bindende Domäne (pFnR0) nicht zu fördern Invasion (Abbildung 1A). Im Gegensatz dazu Komplementation der Mutante mit einem Plasmid kodiert die gesamte fnb A-Gens (pFnBA4) restauriert Invasion WT Ebenen (Abbildung 1A). Die Rolle der FnBPA in Endothelzellen Invasion kann auch gezeigt, mit der heterologen Expression Host Lactococcus lactis werden. Expression von Plasmid-kodierten FnBPA in L. lactis (pRM9 9) nicht signifikant verbessern Adhäsion an Endothelzellen im Vergleich zu Bakterien exprimiert keine FnBPA (CTL) (offene Balken, Abbildung 1B). Im Gegensatz dazu FnBPA-exprimierenden L. lactis überfallen Endothelzellen bei deutlich höheren Niveau als die nicht-exprimierenden Stamm (geschlossene Bars, Abbildung 1B). Die Experimente wurden viermal in zweifacher Ausfertigung und der Mittelwert ± Standardabweichung präsentiert wird durchgeführt. * Daten darstellen, die einen statistisch signifikanten Unterschied (p = &lt;0,05) von WT-oder CTL-Werte sind. <img src="/files/ftp_upload/2693/2693fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Invasion von EA. Hy926 Endothelzellen durch S. aureus (A) oder L. lactis (B).

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusobacterium+nucleatum+transports+noninvasive+Streptococcus+cristatus+into+human+epithelial+cells.">Fusobacterium nucleatum transports noninvasive Streptococcus cristatus into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 74, 654-662 (2006).</li><li>Menzies, B. E., Kourteva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+Staphylococcus+aureus+by+Endothelial+Cells+Induces+Apoptosis.">Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis.</a> Infect. 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Immun. 66, 4593-4601 (1998).</li><li>Eiff, C. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+small+colony+variants:+a+challenge+to+microbiologists+and+clinicians.">Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians.</a> Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).</li><li>Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-linked+kinase+is+an+essential+link+between+integrins+and+uptake+of+bacterial+pathogens+by+epithelial+cells.">Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).</li></ol>

<html> Der Test wir beschreiben, ist auf der Gentamicin Protection Assay, der verwendet wurde, weit, um die Invasion von Wirtszellen durch Bakterien Studie. Beobachtungen von der Unfähigkeit der Gentamicin und andere Antibiotika, um die intrazelluläre Bakterien abtöten wurden in frühen Studien über die Invasion von Wirtszellen durch Bakterien 8.4 genutzt. Der Einsatz von 24, 48 oder sogar 96-Well-Platten ermöglicht die Erzeugung von großen Mengen an quantitative, reproduzierbare Daten in kürzester Zeit und mit relativ geringen Kosten. Der Test ist auch attraktiv, weil es keine spezielle Ausrüstung erfordert, kann zugeschnitten, um mit verschiedenen Bakterien und Zellen arbeiten, und kann verwendet werden, um die Rolle der beiden Bakterien und Wirtszelle Prozesse in Invasion 9 Untersuchung sein. In der Tat, seit der frühesten Versuche, die Gentamicin Protection Assay weithin eingesetzt, um Wirtszelle Invasion durch eine Reihe von verschiedenen Bakterien oder auch Kombinationen von Bakterien 10,11 zu messen. Während die zentralen Prinzipien sind die gleichen, viele subtile Variationen in der Methode berichtet worden. In diesem Artikel haben wir unsere Version beschrieben und angegeben, wo Änderungen notwendig sein für andere Bakterien oder Wirtszellen. Bei der Gestaltung eines Experiments zur Wirtszelle Invasion mit diesem Ansatz gibt es eine Reihe wichtiger Punkte zu beachten Maßnahme: Bakterielle Empfindlichkeit gegenüber Gentamicin. Dies mag selbstverständlich klingen, aber es ist wichtig, um sicherzustellen, dass das Bakterium untersucht anfällig für Gentamicin ist bei der Konzentration, Temperatur und über die Zeitdauer verwendet werden. Im Falle von Unempfindlichkeit, kann es möglich sein, auch andere Antibiotika 5. Ein alternativer Ansatz sein kann, lytischen Enzymen (Lysostaphin, Mutanolysin, Lysozym) 12 verwenden. Incubation und Inokulum. Bei der Durchführung dieses Tests zum ersten Mal ist es wichtig, den optimalen Inkubationszeiten und bakterielle Inokulum verwendet werden sollen, festzulegen. Daher sollten anfänglichen Experimenten untersuchen sowohl Adhäsion und Invasion im Laufe der Zeit (5 min bis zu 6 h). Es ist auch wichtig zu beurteilen, wie Invasion durch die Multiplizität der Infektion betroffen ist (MOI; Anzahl der Bakterien pro Zelle). Im Allgemeinen ist es am besten, die geringste Anzahl von Bakterien möglich verwenden, da dies Schäden an den kultivierten Zellen reduzieren. Wichtige Unterschiede zwischen den Stämmen vielleicht verpasst, wenn längere Inkubationszeiten oder großen Inokula 9,13 verwendet werden. Zellschäden. Es ist wichtig, um Bakterien vor Waschen zu benutzen. Allerdings ist die zelluläre Schäden, die nicht Toxinproduktion beschränkt. Bakterielle Invasion, kann die Induktion von Apoptose und Störung der normalen Zellfunktionen alle verursachen Zellschäden. Dies kann das Eindringen von Gentamicin in der Zelle führen, die Tötung verinnerlicht Bakterien und den Eindruck zu erwecken, dass Invasion hat nicht 14 aufgetreten. Inkubationsbedingungen. Die Temperatur und der Zusammensetzung des Kulturmediums können einen erheblichen Einfluss auf die Invasion. Zum Beispiel ist Invasion von HeLa Zellen, die durch Streptococcus pyogenes abhängig von der Anwesenheit von löslichen Fibronektin, die typischerweise im Serum 15. Ein weiterer Aspekt ist das Wachstum von Bakterien in das Kulturmedium im Verlauf des Experiments. Kultur und Quantifizierung der intrazellulären Bakterien. Obwohl TX-100 kann nicht töten intrazelluläre Bakterien, kann es in ihrem Wachstum hemmen. Als solches ist es wichtig, bakterielle Replikation auf festen Medien zu überprüfen in der Gegenwart des Waschmittels. Wo betroffen sind, kann es möglich sein, niedrigere Konzentrationen des Detergens zu nutzen oder auf eine Alternative wie Saponin verwenden. Ein Vorteil des Gentamicin Protection Assay über die Kristallviolettfärbung und Mikroskopie Assay ist, dass es weniger arbeitsintensiv ist, und es erlaubt den Nachweis und die Differenzierung von Sub-Populationen von Bakterien verinnerlicht. Zum Beispiel, S. aureus kann entweder eine normale Kolonie Typ (NCT) oder die kleine Kolonie Variante (SCV) 16, das wäre nicht unterscheidbar durch Mikroskopie von einzelnen Bakterienzellen. Ein Vorteil des Kristallviolettfärbung und Mikroskopie Assay über die Gentamicin Protection Assay wird die Zelle Verklumpung für und dass intrazelluläre Bakterien, die ein &quot;lebensfähiges, aber nicht kultivierbaren&quot; Zustand erkannt wird 17 eintreten können berücksichtigt werden. Die Untersuchung der Rolle der Wirtszelle Prozesse in bakteriellen Invasion. Viele Studien haben Inhibitoren der Wirtszelle Funktion wie Cytochalasin D, die mit Aktin Umlagerung stört beschäftigt. Solche Studien können auch Antikörper, die auf Zelloberflächenrezeptoren und siRNA Knockdown von spezifischen Genen 18. Es ist äußerst wichtig, um sicherzustellen, dass diese Behandlungen keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit oder Anbau von kultivierten Zellen oder toxische Wirkungen auf Bakterien. Zukünftige Richtungen: NHALT &quot;&gt; Da dieser Test in der Regel ist in Multi-Well-Zellkultur-Platten durchgeführt wird, ist es theoretisch möglich, es zu einem High-Throughput-Screening-Betrieb, was die Prüfung von Banken potentieller Zell-Funktion Inhibitoren, Antiinfektiva und beinhalten möglicherweise anpassen Antibiotika entwickelt, um intrazelluläre Bakterien Ziel. Alternativ könnte ein solcher Ansatz verwendet, um Mutantenbibliotheken Bildschirm, um Gene in Adhäsion, Invasion oder intrazellulären Überleben beteiligt zu identifizieren. In manchen Fällen kann es wünschenswert sein, Scherkräfte (flow) in das Modell einzubeziehen, zum Beispiel bei der Modellierung des Endothels, um mehr genau imitieren die in vivo-Umgebung. Aktuelle Fortschritte in der Entwicklung und Herstellung von Messzellen und Mikrofluidik Zellkultur-Systeme bieten die Möglichkeit des Einsatzes der Gentamicin Protection Assay in Wirt-Pathogen-Modelle, die Scherkräfte zu integrieren. Zusammenfassend ist die hier beschriebene Protokoll auf ähnliche Ansätze über viele Jahre hinweg verwendet wird. Es ist weithin für viele Arten von kultivierten Zellen und bakteriellen Spezies und kann große Datenmengen schnell und bei relativ geringen Kosten zu generieren.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>31885-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Brain heart infusion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioChemika</td>
<td>53286</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10091-148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HUVECs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-2519</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Endothelial basal medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-3121</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine brain extract (including heparin)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4092</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human endothelial growth factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4017C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrocortisone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4035C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GA-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4092C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lysostaphin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AMBI</td>
<td>LSPN-50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thermanox coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>TKT-210-330P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytopath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TCS Biosciences</td>
<td>HC8595</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Crystal violet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C3886</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T75 flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>430641</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytochalasin D</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C2618</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methyl-B-cyclodextrin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>332615</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

invasion of human cells by a bacterial pathogen

Hier werden wir beschreiben, wie wir die Invasion von humanen Endothelzellen Studie durch bakterielle Erreger Staphylococcus aureus. Das allgemeine Protokoll kann auf das Studium der Zelle Invasion durch nahezu alle kultivierbaren Bakterien angewendet werden. Die Phasen, in denen spezifische Aspekte der Invasion untersucht werden können, wie die Rolle von Aktin Umlagerung oder Caveolae, wird hervorgehoben. Wirtszellen werden in Flaschen gezüchtet und wenn Sie bereit sind für den Einsatz werden in 24-well-Platten mit Thermanox Deckgläschen ausgesät. Mit Deckgläser ermöglicht nachträgliche Entfernung der Zellen aus den Vertiefungen zu Störungen von Serumproteinen auf die Seiten der Brunnen (auf die S. aureus würde beilegen) hinterlegt reduzieren. Bakterien sind, um die erforderliche Dichte gewachsen und gewaschen, um sezernierte Proteine ​​(zB Toxine) zu entfernen. Deckgläser mit konfluenten Schichten von Endothelzellen, neue 24-well-Platten mit frischem Kulturmedium vor der Zugabe von Bakterien übertragen. Bakterien und Zellen werden dann gemeinsam für die benötigte Zeit in 5% CO 2 bei 37 ° C. Für S. aureus ist dies in der Regel zwischen 15-90 Minuten. Thermanox Deckgläser sind aus jeder Vertiefung entnommen und in PBS gewaschen zu tauchen, um ungebundene Bakterien zu entfernen. Wenn insgesamt assoziierten Bakterien (adhärent und verinnerlicht) zu quantifizieren sind, Deckgläser dann in ein frisches gut aufgestellt, das 0,5% Triton X-100 in PBS. Sanfte Pipettieren führt zu Zell-Lyse vollständig und Bakterien werden durch serielle Verdünnung und Ausstreichen auf Agar aufgezählt. Wenn die Anzahl der Bakterien, die die Zellen eingedrungen sind notwendig ist, sind Deckgläschen in die Vertiefungen mit 500 ul Zellkulturmedium mit Gentamicin und Inkubation ergänzt weiter für 1 h, die alle externen Bakterien abzutöten hinzugefügt. Deckgläser dann gewaschen werden kann, lysierten Zellen und Bakterien durch Ausplattieren auf Agar aufgezählt, wie oben beschrieben. Wenn das Experiment erfordert eine direkte Visualisierung können Deckgläschen fixiert und für Licht-, Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskopie gefärbt werden oder hergerichtet für die Elektronenmikroskopie.

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Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Ein allgemeines Protokoll für die Untersuchung der Invasion von Wirtszellen durch eine bakterielle Erreger, die sich auf<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Und humanen Endothelzellen.

Invasion von menschlichen Zellen durch einen bakteriellen Erreger

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

invasion-of-human-cells-by-a-bacterial-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

34.6K Aufrufe.  University of Bath. Ein allgemeines Protokoll für die Untersuchung der Invasion von Wirtszellen durch eine bakterielle Erreger, die sich auf Staphylococcus aureus Und humanen Endothelzellen.

Serie: Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Die Anwendung eines Maus Ligierte Peyer-Patch-Darmschlinge Assay zu bakterielle Aufnahme von M-Zellen auswerten

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Forschung

Immunologie und Infektion

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. Therefore, rapid administration of adequate antibiotic therapy is of foremost importance in the treatment of bloodstream infections. The critical element in this process is timing, heavily dependent on the results of bacterial identification and antibiotic susceptibility testing. Both of these parameters are routinely obtained by culture-based testing, which is time-consuming and takes on average 24-48 hours2, 4. The aim of the study was to develop DNA-based assays for rapid identification of bloodstream infections, as well as rapid antimicrobial susceptibility testing. The first assay is a eubacterial 16S rDNA-based real-time PCR assay complemented with species- or genus-specific probes5. Using these probes, Gram-negative bacteria including Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as well as Gram-positive bacteria including Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., and Streptococcus pneumoniae could be distinguished. Using this multiprobe assay, a first identification of the causative micro-organism was given after 2 h.
Secondly, we developed a semi-molecular assay for antibiotic susceptibility testing of S. aureus, Enterococcus spp. and (facultative) aerobe Gram-negative rods6. This assay was based on a study in which PCR was used to measure the growth of bacteria7. Bacteria harvested directly from blood cultures are incubated for 6 h with a selection of antibiotics, and following a Sybr Green-based real-time PCR assay determines inhibition of growth. The combination of these two methods could direct the choice of a suitable antibiotic therapy on the same day (Figure 1). In conclusion, molecular analysis of both identification and antibiotic susceptibility offers a faster alternative for pathogen detection and could improve the diagnosis of bloodstream infections.

The design of a straightforward one-day workflow scheme for bacterial pathogen diagnostics enables the rapid recognition of bloodstream infections. The inclusion of eight clinically relevant bacterial targets and their antibiotic resistance profiles offers the clinician an initial insight on the same day, which can lead to more adequate therapy.

Ein-Tages-Workflow-Schema für bakterielles Pathogen-Erkennung und Resistenz gegen antimikrobielle Tests aus Blutkulturen

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell culture assays are performed under aerobic conditions, these in vitro models may not accurately represent the in vivo environment in which the host-pathogen interactions take place. We have developed an in vitro model of infection that permits the coculture of bacteria and host cells under different medium and gas conditions. The Vertical Diffusion Chamber (VDC) model mimics the conditions in the human intestine where bacteria will be under conditions of very low oxygen whilst tissue will be supplied with oxygen from the blood stream. Placing polarized intestinal epithelial cell (IEC) monolayers grown in Snapwell inserts into a VDC creates separate apical and basolateral compartments. The basolateral compartment is filled with cell culture medium, sealed and perfused with oxygen whilst the apical compartment is filled with broth, kept open and incubated under microaerobic conditions. Both Caco-2 and T84 IECs can be maintained in the VDC under these conditions without any apparent detrimental effects on cell survival or monolayer integrity. Coculturing experiments performed with different C. jejuni wild-type strains and different IEC lines in the VDC model with microaerobic conditions in the apical compartment reproducibly result in an increase in the number of interacting (almost 10-fold) and intracellular (almost 100-fold) bacteria compared to aerobic culture conditions1. The environment created in the VDC model more closely mimics the environment encountered by C. jejuni in the human intestine and highlights the importance of performing in vitro infection assays under conditions that more closely mimic the in vivo reality. We propose that use of the VDC model will allow new interpretations of the interactions between bacterial pathogens and host cells.

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Performing cell culture assays for investigating bacterial adhesion and invasion under aerobic conditions is usually unrepresentative of the in vivo environment. A Vertical Diffusion Chamber model allows study of interactions of the human pathogen Campylobacter jejuni with intestinal epithelial cells under more in vivo-like conditions, resulting in enhanced bacterial invasion.

Enteric bakterielle Invasion von intestinalen Epithelzellen<em&gt; In Vitro</em&gt; Ist erheblich verstärkt unter Verwendung eines vertikalen Diffusion Chamber Modell

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Imaging InlC Sekretion to Cellular-Infektion durch den bakteriellen Erreger untersuchen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

Automatische Trennung von<em&gt; C. elegans</em&gt; Variabel durch einen bakteriellen Erreger kolonisiert

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Co-Kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

Beurteilung der bakteriellen Invasion von Herzzellen in Kultur und Herzkolonisation bei infizierten Mäusen mit Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Die Entwirrung der Funktion eines bakteriellen Effektor aus einem nicht-kultivierter Pflanzenschädling eine Hefe mit Zwei-Hybrid-Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.