Im Forschungsgebiet Von Shigella fehlen derzeit gut definierte Assays, um die funktionelle Rolle von Antikörpern zu untersuchen, die durch Immunisierung oder Infektion erzeugt werden. Dieser Test stellt eine gut definierte Methode dar, um diese Immunantworten zu qualifizieren und die bakterizide Aktivität von Shigella-spezifischen Antikörpern zu messen. Der Hauptvorteil dieses Assays ist, dass er eine Analyse mehrerer Proben mit hohem Durchsatz ermöglicht.
Die in diesem Protokoll verwendeten Techniken reduzieren die praktische Zeit und die Gesamttestzeit erheblich, um die direkte bakterielle Tötung von Antikörpern und Serumproben zu messen. Zunächst die Proben in einem warmwasserbad bei 56 Grad Celsius für 30 Minuten bebrüten und aktivieren. Erhalten Sie eine Assayplatte und 20 Mikroliter Assaypuffer zu spalten eins bis zwölf der Reihen A bis G.Hinzufügen von 20 Mikroliteras Assaypuffer zu den Spalten eins und zwei der Reihe H.Load 30 Mikroliter jeder Testprobe und Duplikat zu Zeile H der Assayplatte.
Um mit der Durchführung dreifacher serieller Verdünnungen der Testproben zu beginnen, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 10 Mikroliter aus den Brunnen 3H bis 12H zu entfernen. Übertragen Sie die Proben auf die entsprechenden Bohrungen in Reihe G und Pipette 8 bis 10 Mal nach oben und unten, um die Probe gut zu mischen. Entfernen Sie dann 10 Mikroliter aus diesen Brunnen.
Übertragen Sie auf die entsprechenden Brunnen in Reihe F und Pipette nach oben und unten 8 bis 10 Mal zu mischen. Setzen Sie diesen seriellen Verdünnungsprozess durch Zeile A fort. Nachdem Sie die Brunnen in Reihe A gemischt haben, entfernen und entsorgen Sie 10 Mikroliter aus den Brunnen 3A bis 12A, so dass das Endvolumen in allen Brunnen 20 Mikroliter beträgt. Holen Sie sich eine Durchstechflasche mit gefrorenen Zielbakterienbeständen und tauen Sie sie bei Raumtemperatur auf.
Dann verdünnen Sie die Bakterien in 20 Milliliter Assay-Puffer. nach dem vorgegebenen optimalen Verdünnungsfaktor. Mit einer Mehrkanalpipette 10 Mikroliter verdünnter Bakterien in jeden Brunnen der Assayplatte geben.
Holen Sie sich eine Durchstechflasche mit gefrorenem Baby Rabbit Compliment und eine Durchstechflasche mit gefrorener Wärme aktiviert BRC. Verwenden Sie kaltes fließendes Wasser, um die Durchstechflaschen auf Raumtemperatur aufzutauen. Mischen Sie dann 100 Mikroliter Wärme aktiviert BRC mit 400 Mikroliter Assay Puffer.
Fügen Sie 50 Mikroliter dieser 20 Prozent wärmeaktivierten BRC-Lösung zu allen Brunnen in Spalte eins hinzu. Mischen Sie einen Milliliter natives BRC mit vier Millilitern Assaypuffer. Fügen Sie 50 Mikroliter dieser 20-Prozent-Mischung zu allen Brunnen in den Spalten zwei bis zwölf hinzu.
Legen Sie die Platte 10 bis 15 Sekunden lang einen Plattenschütter, um die Assayplatte sanft zu mischen. Inkubieren Sie die Assayplatte in einem mikrobiologischen Inkubator für zwei Stunden. Entfernen Sie in der Zwischenzeit die Deckel von den beiden LB Agar Platten und legen Sie die Platten nach oben in einem biologischen Sicherheitsschrank für 40 bis 60 Minuten zum Trocknen.
Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, übertragen Sie die Assayplatte auf nasses Eis und inkubieren Sie für 10 bis 20 Minuten, um die Reaktion zu stoppen. Mischen Sie mit einer Zwölfkanalpipette die Bohrungen in Reihe H und die Spotplatte 10 Mikroliter des Reaktionsgemisches auf den Boden einer LBA-Platte. Kippen Sie die Platte sofort und lassen Sie die Stellen etwa 1,5 bis 2 Zentimeter laufen.
Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Zeilen G, F und E, und erkennen Sie sie über der vorherigen Zeile. Inkubieren Sie die LBA-Platten bei Raumtemperatur, bis die Lösung in die LBA-Platten aufgenommen wird. Dann legen Sie die Deckel auf die Platten und übertragen Sie sie kopfüber in einen mikrobiologischen Inkubator, um sie über Nacht zu inkubieren.
Am nächsten Tag 25 Milliliter Overlay Agar bei 55 Grad Celsius, mit 100 Mikrogramm pro Milliliter TTC und 0,1 Prozent Natriumazid zu jeder LBA-Platte. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden, damit die überlebenden Bakterien eine rote Farbe entwickeln können. Verwenden Sie dann eine Digitalkamera, um die Platten zu fotografieren.
Übertragen Sie die Bilder auf einen Computer und verwenden Sie die Software Integrated Colony Enumerating von NIST, um die Bilder wie im Textprotokoll beschrieben zu analysieren. Repräsentative LBA-Platten zeigen, dass die Farbentwicklung nach der nächtlichen Inkubation und Überlagerungszugabe stattgefunden hat, wobei alle überlebenden Kolonien rot sichtbar sind. Die bakterielle Tötung ist für alle Proben, die in den ersten drei Verdünnungen getestet wurden, deutlich zu sehen.
Eine Abnahme der bakteriellen Tötung wird gesehen, da Proben weiter oben auf der Platte verdünnt werden und das Serum weniger konzentriert ist. Die Anzahl der Mikrokolonien wird dann mit der NIST-Software durchgeführt. Die durchschnittliche KBE-Anzahl für jede Verdünnung jeder Probe wird dann berechnet, ebenso wie der 50-prozentige Tötungswert.
Dieser 50-prozentige Tötungswert wird dann auf die durchschnittliche KBE für jede Serumverdünnung angewendet, um die Werte zu bestimmen, die für die Berechnung des SBA KI erforderlich sind. Dieses Protokoll beruht auf einer konsistenten und gleichmäßigen bakteriellen Beschichtung auf LB Auger. Gute Spot-Beschichtungs- und Neigetechnik ermöglicht das Wachstum diskreter Mikrokolonien und eine genaue Koloniezählung. Diese Technik verwendet lebende virulente Shigella und erfordert geeignete aseptische Technik und PSA, um sicherzustellen, dass die Bakterien sicher nach BSL 2 Verfahren behandelt werden.
