Die Autoren möchten die UC Davis Mausbiologie Programm für die Zucht der Mäuse danken. Diese Forschung wurde unterstützt durch einen Zuschuss von Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland unterstützt.

Alle tierexperimentellen Studien und Experimente wurden unter einem Protokoll, das von der University of California, Davis Institutional Animal Care und Verwenden Administrative Advisory Committee genehmigt durchgeführt. 1. MUC1.Tg Maus Zucht und Vermehrung <ol><li> Die UC Davis Mausbiologie Program (MBP) Rassen Wildtyp C57BL / 6 männlichen Mäusen mit heterozygoter MUC1.Tg C57BL / 6 weiblichen Mäusen zu unserer Zucht Kolonie zu gründen. MUC1.Tg Nachkommen für Studien geliefert, wie gebraucht. </li><li> MBP Personal Clip die Zehen der Nachkommen in einem definierten Muster (0-99) für Maus-Identifikation, und falls anwendbar Clip der Schwanz. Die Zehe oder Schwanz Gewebe zur Genotypisierung mit Standard-DNA-Extraktion und Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Analyse verarbeitet. </li></ol> 2. Studiendesign <ol><li> Studiengruppe Zuordnungen <ol><li> Wiegen Sie jede Maus einzeln auf einer Waage und notieren das Gewicht in Gramm für jede Maus. </li><li> Dieser Teil des Verfahrens invOlvés die Methodik und Design der Studie. Für den ersten Teil der Studie, weisen Alter abgestimmte MUC1.Tg und Wildtyp-Mäusen zu Blasenkrebs Induktion mit OH-BBN starten. Euthanize Mäusen 8 Wochen nach der letzten OH-BBN Dosis, um das Vorhandensein von Tumoren der Blase durch Histologie bestätigen. </li><li> Für den zweiten Teil der Studie zufällig männlichen Mäusen MUC1.Tg in die entsprechende Anzahl von Behandlungs-und Kontrollgruppen. Diese Mäuse werden für Serum Zytokine und T-Zell-Immunantwort während der Induktion und Tumorentwicklung überwacht werden, und dann bei Beendigung der Studie 8 Wochen nach der letzten Dosis OH-BBN. </li></ol></li><li> Bladder Cancer Induction <ol><li> OH-BBN ist krebserregend und hochgiftig. Bitte lesen und befolgen Sie die Anweisungen des Sicherheitsdatenblatt bei der Handhabung und Speicherung dieser Chemikalie. </li><li> Berechnen Sie die Dosierung Lösung Konzentration erforderlich, um die entsprechende Dosis (3 mg) in einem Volumen von 100 ul liefern, jeder Maus auf den durchschnittlichen Gewichte und numbe Basisr von Mäusen in jeder Studie und Gruppe. </li><li> Verdünnen Sie die OH-BBN in 100% Ethanol. Bringen Sie die endgültige Konzentration 30 mg / ml mit sterilem Wasser. Die endgültige Ethanol: Wasser-Konzentration sollte 20:80, v / v. </li><li> Verwalten des OH-BBN oral mittels Edelstahl, 20 G Nadeln Magensonde täglich, 5 Tage / Woche für 12 Wochen auf der Behandlungsgruppe Zuordnung ab dem Alter von 8 Wochen bezogen. </li></ol></li><li> Impfung Behandlungen <ol><li> Den Inhalt jeder Flasche des lyophilisierten Peptids Impfstoff in 600 ul 0,9% sterile Kochsalzlösung und gründlich, indem die Lösung durch einen 0,5-Zoll-27 G Nadel 6x resuspendieren. Unter Verwendung von Kochsalzlösung, passen die Konzentration, so dass die gewünschte Dosis in einem Volumen von 100 ul geliefert wird. </li><li> Ab Woche 20, nach der letzten Dosis von OH-BBN, die Verwaltung der Impfstoff auf einer wöchentlichen Basis für einen Acht-Wochen-Zyklus durch subkutane Injektion von 100 ul mit einer 25 G-Nadel (KW entspricht dem Alter der Mäuse). </li></ol></li><li> Überwachung und Probenahme <ol><li> Wiegen Sie alle Mäuse und tasten auf das Vorhandensein von neuen Tumoren einmal pro Woche. Euthanize keine Mäuse, die ≥ 20% des Körpergewichts verloren haben oder wenn es tastbare Tumoren, Blut im Urin und / oder Harnverhalt sind. </li><li> Vor der ersten OH-BBN Dosis und dann in 4-wöchigen Abständen, sammeln Vollblut über submandibular blutet. Das Blut in Serum Blutgerinnung Rohre (BD Microtainer), und lassen Sie 30 Minuten für die Blutgerinnung. </li><li> Zentrifuge die Blutproben in einer Mikrozentrifuge bei 3.500 xg für 10 min. Sorgfältig übertragen die Serum Kappe Kryoröhrchen mit einer Pipette zu schrauben. </li><li> Blitzeis in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C bis zur weiteren Analyse von Multiplex. </li><li> Acht Wochen nach der letzten Dosis von OH-BBN, einschläfern alle Mäuse durch CO 2-Erstickung. </li><li> Platzieren Sie jede Maus auf eine Dissektion Bord und festzunageln von allen vier Gliedmaßen. </li><li> Mit einer Pinzette und Schere, make ein horizontaler Schnitt in der oberen Bauchgegend. Setzen Sie die Schere in den Einschnitt zwischen der Epidermis und Bauchwand und vorsichtig trennen die Haut vom darunter liegenden Gewebe mit Hilfe der Pinzette. </li><li> Einen vertikalen Schnitt von der horizontalen Schnitt nach der Mittelachse in Richtung des vorderen Endes der Maus. Trennen Sie die Haut vor dem Brustkorb und unter Verwendung einer 1 ml Spritze und einer 22 G Nadel durchstechen das Herz und Blut sammeln mit einer glatten und stetigen Unentschieden. </li><li> Siehe 2.4.3 und 2.4.4 für Serum Isolierung und Lagerung fort. </li><li> Mit einer Pinzette und Schere, schneiden und schälen zurück der Rest der Epidermis. Schnitt durch die Bauchdecke und Bauchfell und aseptisch entfernen Blasentumor für Immunhistochemie (IHC) und Western Blot. </li><li> Sammle Milz für die Lebensfähigkeit der Zellen-Analyse (Muse) und ELISpot. Für IHC, Ort Blasentumor Probe in Gewebekassette und fixieren in gekühlten Formalin über Nacht bei Raumtemperatur. </li&gt; <li> Am folgenden Tag, ersetzen Sie das Formalin mit 70% Ethanol. </li><li> Für die Western-Blot-Analyse des Tumors, den Tumor zu homogenisieren, fügen Proteinextraktion Puffer plus Halt Protease-Inhibitoren und Transfer zum 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Vortex für 30-60 sec und halten auf Eis für 5 min. Blitz in flüssigem Stickstoff und Auftauen in das umgebende Wasser einfrieren. Wiederholen Sie den Vorgang der Verwirbelung, Einfrieren und Auftauen zweimal. </li><li> Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 g für 10 min bei 4 ° C und übertragen Sie die Zellextrakte auf neue Röhren beschriftet. </li><li> Quantifizierung der Konzentration durch Ausführen einer Bicinchoninsäure Protein Assay (BCA) für die Protein-Messungen. Proben bei -80 ° C bis bereit für Western-Blot-Analyse. </li></ol></li></ol> 3. Molecular Biology / Western Die folgenden Verfahren wurden durchgeführt, um die Expression von MUC1 in Blasemaus Tumorgewebe mit Standard Western Blot Protokoll überprüfen (Daten nicht zeigenn). <ol><li> Trennen Sie die Proteinextrakte durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) und dann übertragen auf PVDF-Membran mit halbtrockenen Vorrichtung. </li><li> Blockieren Sie das Protein übertragen Membran mit 5% Magermilch in 0,1% Tween-20 in Phosphate Buffered Saline (PBS-T) pH 7,4 für 1 Stunde auf einem Schüttler bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubieren der Membran für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Schüttler mit anti-MUC1 oder anti-β-Actin-Antikörper in 0,1% PBS-T. </li><li> Waschen der Membran durch Dekantieren der Lösung und Zugabe von 0,1% PBS-T. Swirl die Membran auf dem Schüttler für 5 min und dekantiert. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. </li><li> Inkubieren der Membran für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit einem Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierten sekundären Antikörper. </li><li> 3x waschen (siehe Schritt 3.4). </li><li> Verfolgen Sie das Protokoll für die Enhanced Chemilumineszenz (ECL) Kit zu aktivieren und lesen Sie die Fluorographie. </li></ol> 4. Multiplex Fluorometric Microbead Immunoassay &lt;ol&gt; <li> Setup-und Berechnungen <ol><li> Mit einer 96-Well-Platte Karte zuweisen Blanks, Standards, Kontrollen und Proben in die Vertiefungen. Berechnen Sie die Anzahl und das Volumen des Analyten zu erfassen Antikörper und Streptavidin-Phycoerythrin (SA-PE) für den Assay benötigt. </li><li> Lassen Sie alle Puffer und Verdünnungsmittel auf Raumtemperatur ins Gleichgewicht. Bereiten Sie die Standards und Probe Verdünnungen mit einem leeren 96-Well-Platte. </li><li> Die Rekonstitution der lyophilisierten Matrix und Serum-Standard nach dem Protokoll des Herstellers und stellen 1.05 serielle Verdünnungen der Standardlösung mit dem geeigneten Verdünnungsmittel in 96-Well-Platte. Für die leeren Brunnen, verwenden Sie die entsprechende Verdünnungsmittel. </li><li> Verdünnen alle Kontrollen und unbekannten Proben 1:2 in der geeigneten Verdünnungsmittel in dem Rest der 96-Well-Platte. </li><li> Für die perlenmix, Pipette das erforderliche Volumen des geeigneten Verdünnungsmittel in einen 15-ml-Tube. Vortex jede Perle Fläschchen für 20 sec und Pipette das erforderliche Volumen der einzelnen Analyten in der 15 ml Tube. </li&gt; <li> Schützen Sie die Perlen von Licht zu vermeiden Bleichen. Stellen Sie den 96-Well-Platte auf einer saugfähigen Unterlage zum Verlust der Probe durch Feuchtigkeitsregulierung vermeiden. </li></ol></li><li> Assay-Protokoll <ol><li> Prewet den 96er Filter Bodenplatte mit 200 ul Assay-Puffer und ermöglichen vollständige Einweichen des Filters. Vorsichtig mit der 96-Well-Platte Vakuumapparatur abtropfen lassen und trocken tupfen die Unterseite der Platte mit einem Papiertuch. </li><li> Mit einer Mehrkanal-Pipette Pipette 25 ul Serummatrix in die Vertiefungen für die Leer-und Standardproben und Pipette 25 ul Assay-Puffer in die Vertiefungen für die Kontrollen und die Proben zugeordnet. </li><li> Je 25 ul des Rohlings, Normen, Kontrollen und Unbekannten zu den jeweils zugeordneten Vertiefungen. Vortex der Wulst-Mix für 20 sec und übertragen Sie die Perlen mit einem Reservoir. </li><li> Je 25 ul der perlenmix in jede Vertiefung. Die Platte mit Aluminiumfolie oder einem opaken Platte Deckel den Inhalt vor Licht zu schützen. </li><li&gt; Schütteln Sie die Platte bei 500 Umdrehungen pro Minute für zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einem Schüttler. Abtropfen lassen und waschen Sie die Platte mit 200 ul 0,1% Tween 20 in Phosphate Buffered Saline (PBS-T) zweimal. Abtropfen lassen und trocken tupfen. </li><li> Bereiten Sie die Capture-Antikörper-Lösung. Pipette die erforderliche Menge von 0,1% PBS-T und Capture Antikörper in ein 15 ml Röhrchen und Vortex für 10 Sekunden. Übertragen Sie die Capture-Antikörper-Mix zu einem Reservoir und Pipette 25 ul in jede Vertiefung. </li><li> Schütteln Sie die Platte bei 500 rpm für eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Schüttler. Abtropfen lassen und waschen Sie die Platte mit 200 ul 0,1% PBS-T zweimal. Abtropfen lassen und trocken tupfen. </li><li> Bereiten Sie die SA-PE Lösung. Pipettieren Sie die gewünschte Lautstärke von 0,1% PBS-T und SA-PE in einen 15-ml-Tube und Vortex für 10 Sekunden. Die Lösung wird in einem Reservoir und Pipette 25 ul in jede Vertiefung. </li><li> Schütteln Sie die Platte bei 500 rpm für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler. Abtropfen lassen und waschen Sie die Platte mit 200 ul 0,1% PBS-T zweimal. Abtropfen lassen und bLos trocken. </li><li> Je 100 ul 0,1% PBS-T und schütteln auf einem Schüttler bei 500 rpm für mindestens zwei Minuten, um die Beads zu resuspendieren. Lesen und analysieren die Platte auf dem Luminex Lx200 Maschine. </li></ol></li></ol> 5. IFN-γ/IL-4 ELISpot Vorbereitung und Analyse <ol><li> In einem biologischen Sicherheitsschrank, verarbeiten die Milz durch 100 um Nylon Gewebe Siebe in 5 ml steriler Phosphat-gepufferte Saline (PBS) in sterile Petrischalen. Schicht die Splenozyten auf 3 ml Lymphozyten-Trennmedium in sterile 15-ml-Röhrchen. </li><li> Die Röhrchen bei 600 g für 15 min, um die Lymphozyten aus den roten Blutzellen zu trennen. Übertragen Sie die geschichteten Lymphozyten über dem Gradienten, neue sterile 15-ml-Röhrchen. </li><li> Stellen Sie die Lautstärke auf 10 ml mit sterilem PBS. Wird die Suspension bei 600 × g für 10 min die Zellen zu pelletieren. </li><li> Saugen Sie den Überstand und die Zellen in 1 ml PBS für die Lebensfähigkeit der Zellen und zählen mit der MuseAnalysator. Folgen Sie der Muse Count &amp; Lebensfähigkeit Kit-Protokoll. </li><li> Als serielle Verdünnungen der Lymphozyten in 1,5 ml Schraubdeckel Zentrifugenröhrchen bei Verdünnung von 1:10, 1:20 und 01.40 Uhr (oder nach Bedarf) in Count &amp; Lebensfähigkeit Reagent (minimale Gesamtvolumen 300 ul). Pipettieren jeder Verdünnung nach oben und unten mehrmals zu mischen und auf die Muse zu analysieren. </li><li> Bereiten Sie einen Teller Karte von den Proben und Bedingungen für die ELISpot Platte. Bereiten Sie die ELISpot Platte nach dem Protokoll des Herstellers und Pipette 100 ul Medium, Peptid (10 ug / ml) oder Gerangel Peptid (10 ug / ml) in jede Vertiefung. </li><li> Je 100 ul Zellsuspension, liefert 1,0 x 10 6 Zellen in jede Vertiefung und Inkubation der Platte bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers für den ELISPOT-Assay. Analysieren Sie den entwickelten ELISpot Platte mit einem Dissektionsmikroskop. </li><li> Quantifizierung der Ergebnisse durch Zählen der Anzahl von farbigen Flecken corresponding auf jeden Analyten in jede Vertiefung. Die Spots mit der Anzahl der vor Ort-Zellen (SFC) in jede Vertiefung entsprechen. </li></ol> 6. Immunhistochemie (IHC) und Hämatoxylin &amp; Eosin (H &amp; E) Färbung <ol><li> Nehmen Blase Tumorgewebe erhalten wie oben beschrieben (Abschnitt 2.4.11), in Paraffin und Schritt-Abschnitt bei 4 um für immunhistochemische Analyse einzubetten. </li><li> Führen IHC mit einem Antikörper, der das MUC1 Tandem Repeat-Region von MUC1 erkennt. Über die Animal Research Kit Peroxidase, um die Reaktivität der sekundären Maus-Antikörper mit endogenen Immunglobulin im Gewebe zu minimieren. </li><li> Führen H &amp; E-Färbung unter Verwendung von Standard-Protokollen. </li></ol> 7. Statistische Methoden Für die Multiplex Fluorometric Microbead Immunoassay, verwenden Sie einen zweiseitigen Student-t-Test zum Vergleich der durchschnittlichen Serum beobachtet Cytokinkonzentrationen zwischen der Behandlungs-und Kontrollgruppen. Für ELISpot, benutzen Sie eine Ein-way ANOVA, um die Stelle bilden Kolonien zwischen der media control vergleichen, Rührei Peptid-und Peptid-Gruppen. Verwenden Dunnett Multiple Comparison Test, um die Wahrscheinlichkeit eines falsch positiven Ergebnis zu verringern. Ein p-Wert ≤ 0,05 gilt als signifikant für alle Analysen.

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	<li>Siegel, R., Naishadham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).</li><li>Lynch, C. F., Davila, J. A., Ries, L. A. G., Young, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+23.+Cancer+of+the+urinary+bladder.">Chapter 23. Cancer of the urinary bladder.</a> SEER Survival Monograph: Cancer Survival Among Adults: U.S. SEER Program, 1988-2001, Patient and Tumor Characteristics. , 07-6215 (2007).</li><li>Jacobs, B. L., Lee, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bladder+cancer+in+2010:+how+far+have+we+come.">Bladder cancer in 2010: how far have we come.</a> CA Cancer J. Clin. 60 (4), 244-272 (2010).</li><li>Sexton, W. J., Wiegand, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bladder+cancer:+a+review+of+non-muscle+invasive+disease.">Bladder cancer: a review of non-muscle invasive disease.</a> Cancer Control. 17 (4), 256-268 (2010).</li><li>Bohle, A., Jocham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravesical+bacillus+Calmette-Guerin+versus+mitomycin+C+for+superficial+bladder+cancer:+a+formal+meta-analysis+of+comparative+studies+on+recurrence+and+toxicity.">Intravesical bacillus Calmette-Guerin versus mitomycin C for superficial bladder cancer: a formal meta-analysis of comparative studies on recurrence and toxicity.</a> J. Urol. 169 (1), 90-95 (2003).</li><li>Shokeir, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Squamous+cell+carcinoma+of+the+bladder:+pathology,+diagnosis+and+treatment.">Squamous cell carcinoma of the bladder: pathology, diagnosis and treatment.</a> BJU Int. 93 (2), 216-220 (2004).</li><li>Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+human+tumour+immunology+and+immunotherapy.">Progress in human tumour immunology and immunotherapy.</a> Nature. 411 (6835), 380-384 (2001).</li><li>Joudi, F. N., Smith, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Final+results+from+a+national+multicenter+phase+II+trial+of+combination+bacillus+Calmette-Guerin+plus+interferon+alpha-2B+for+reducing+recurrence+of+superficial+bladder+cancer.">Final results from a national multicenter phase II trial of combination bacillus Calmette-Guerin plus interferon alpha-2B for reducing recurrence of superficial bladder cancer.</a> Urol. Oncol. 24 (4), 344-348 (2006).</li><li>Lau, S. K., Weiss, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+MUC1,+MUC2,+and+MUC5AC+in+carcinomas+of+various+sites:+an+immunohistochemical+study.">Differential expression of MUC1, MUC2, and MUC5AC in carcinomas of various sites: an immunohistochemical study.</a> Am. J. Clin. Pathol. 122 (1), 61-69 (2004).</li><li>Hollingsworth, M. A., Swanson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucins+in+cancer:+protection+and+control+of+the+cell+surface.">Mucins in cancer: protection and control of the cell surface.</a> Nat. Rev. Cancer. 4 (1), 45-60 (2004).</li><li>Scholfield, D. P., Simms, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC1+mucin+in+urological+malignancy.">MUC1 mucin in urological malignancy.</a> BJU Int. 91 (6), 560-566 (2003).</li><li>Devine, P. L., McKenzie, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucins:+structure,+function,+and+association+with+malignancy.">Mucins: structure, function, and association with malignancy.</a> Bioessays. 14 (9), 619-625 (1992).</li><li>Jerome, K. R., Barnd, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T-lymphocytes+derived+from+patients+with+breast+adenocarcinomas+recognize+an+epitope+present+on+the+protein+core+of+a+mucin+molecule+preferentially+expressed+by+malignant+cells.">Cytotoxic T-lymphocytes derived from patients with breast adenocarcinomas recognize an epitope present on the protein core of a mucin molecule preferentially expressed by malignant cells.</a> Cancer Res. 51 (11), 2908-2916 (1991).</li><li>Takahashi, T., Makiguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+MUC1+on+myeloma+cells+and+induction+of+HLA-unrestricted+CTL+against+MUC1+from+a+multiple+myeloma+patient.">Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient.</a> J. Immunol. 153 (5), 2102-2109 (1994).</li><li>Choi, C., Witzens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+functional+CD8+memory+T+cells+specific+for+MUC1+in+bone+marrow+of+patients+with+multiple+myeloma.">Enrichment of functional CD8 memory T cells specific for MUC1 in bone marrow of patients with multiple myeloma.</a> Blood. 105 (5), 2132-2134 (2005).</li><li>Barnd, D. L., Lan, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific,+major+histocompatibility+complex-+unrestricted+recognition+of+tumor-associated+mucins+by+human+cytotoxic+T-cells.">Specific, major histocompatibility complex- unrestricted recognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T-cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (18), 7159-7163 (1989).</li><li>Ioannides, C. G., Fisk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T-cells+from+ovarian+malignant+tumors+can+recognize+polymorphic+epithelial+mucin+core+peptides.">Cytotoxic T-cells from ovarian malignant tumors can recognize polymorphic epithelial mucin core peptides.</a> J. Immunol. 151 (7), 3693-3703 (1993).</li><li>Tang, C. K., Katsara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+used+for+MUC1+immunotherapy:+human+clinical+studies.">Strategies used for MUC1 immunotherapy: human clinical studies.</a> Expert Rev. Vaccines. 7 (7), 963-975 (2008).</li><li>Mukherjee, P., Ginardi, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC1-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+eradicate+tumors+when+adoptively+transferred+in+vivo.">MUC1-specific cytotoxic T lymphocytes eradicate tumors when adoptively transferred in vivo.</a> Clin. Cancer Res. 7, 848-855 (2001).</li><li>Acres, B., Limacher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC1+as+a+target+antigen+for+cancer+immunotherapy.">MUC1 as a target antigen for cancer immunotherapy.</a> Expert Rev. Vaccines. 4 (4), 493-502 (2005).</li><li>Butts, C., Murray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+phase+IIB+trial+of+BLP25+liposome+vaccine+in+stage+IIIB+and+IV+non-small-cell+lung+cancer.">Randomized phase IIB trial of BLP25 liposome vaccine in stage IIIB and IV non-small-cell lung cancer.</a> J. Clin. Oncol. 23 (27), 6674-6681 (2005).</li><li>Butts, C., Maksymiuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updated+survival+analysis+in+patients+with+stage+IIIB+or+IV+non-small-cell+lung+cancer+receiving+BLP25+liposome+vaccine+(L-BLP25),+phase+IIB+randomized,+multicenter,+open-label+trial.">Updated survival analysis in patients with stage IIIB or IV non-small-cell lung cancer receiving BLP25 liposome vaccine (L-BLP25), phase IIB randomized, multicenter, open-label trial.</a> J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 137 (9), 1337-1342 (2011).</li><li>Agrawal, B., Krantz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+induction+of+primary+human+CD4++and+CD8++T+cell+responses+against+cancer-associated+MUC1+peptide+epitopes.">Rapid induction of primary human CD4+ and CD8+ T cell responses against cancer-associated MUC1 peptide epitopes.</a> Int. Immunol. 10 (12), 1907-1916 (1998).</li><li>Palmer, M., Parker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+study+of+the+BLP25+(MUC1+peptide)+liposomal+vaccine+for+active+specific+immunotherapy+in+stage+IIIB/IV+non-small-cell+lung+cancer.">Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer.</a> Clin. Lung Cancer. 3 (1), 49-57 (2001).</li><li>Walsh, M. D., Hohn, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin+expression+by+transitional+cell+carcinomas+of+the+bladder.">Mucin expression by transitional cell carcinomas of the bladder.</a> Br. J. Urol. 73 (3), 256-262 (1994).</li><li>Murray, A., Simms, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+rhenium-188-C595+antibody+for+radioimmunotherapy+of+transitional+cell+bladder+cancer.">Production and characterization of rhenium-188-C595 antibody for radioimmunotherapy of transitional cell bladder cancer.</a> J. Nucl. Med. 42 (5), 726-732 (2001).</li><li>Hughes, O., Bishop, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+superficial+bladder+cancer+by+the+intravesical+administration+of+67copper-labelled+anti-MUC1+mucin+monoclonal+antibody+C595.">Targeting superficial bladder cancer by the intravesical administration of 67copper-labelled anti-MUC1 mucin monoclonal antibody C595.</a> J. Clin. Oncol. 18 (2), 363-370 (2000).</li><li>Conn, I. G., Crocker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMFG-2+as+a+prognostic+indicator+in+superficial+bladder+cancer.">HMFG-2 as a prognostic indicator in superficial bladder cancer.</a> J. Clin. Pathol. 41 (11), 1191-1195 (1988).</li><li>Hughes, O., Denley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC1+mucin+expression+in+transitional+cell+carcinoma+of+the+bladder:+a+target+for+diagnosis+and+therapy+with+monoclonal+antibody+C595.">MUC1 mucin expression in transitional cell carcinoma of the bladder: a target for diagnosis and therapy with monoclonal antibody C595.</a> J. Urol. Pathol. 12, 185-197 (2000).</li><li>Rowse, G. J., Tempero, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+and+immunity+to+MUC1+in+a+human+MUC1+transgenic+murine+model.">Tolerance and immunity to MUC1 in a human MUC1 transgenic murine model.</a> Cancer Res. 58 (2), 315-321 (1998).</li><li>Mukherjee, P., Madsen, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin-1+specific+immunotherapy+in+a+mouse+model+of+spontaneous+breast+cancer.">Mucin-1 specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer.</a> J. Immunother. 26 (1), 47-62 (2003).</li><li>McCormick, D. L., Ronan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+total+dose+and+dose+schedule+on+induction+of+urinary+bladder+cancer+in+the+mouse+by+N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine.">Influence of total dose and dose schedule on induction of urinary bladder cancer in the mouse by N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine.</a> Carcinogenesis. 2 (3), 251-254 (1981).</li><li>Wurz, G. T., Gutierrez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+effects+of+L-BLP25+antigen-specific+tumor+immunotherapy+in+a+novel+human+MUC1+transgenic+lung+cancer+mouse+model.">Antitumor effects of L-BLP25 antigen-specific tumor immunotherapy in a novel human MUC1 transgenic lung cancer mouse model.</a> J. Transl. Med. 11, 10-1186 (2013).</li><li>Kunze, E., Schauer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+transformation+in+the+development+of+N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced+transitional+cell+carcinomas+in+the+urinary+bladder+of+rats.">Stages of transformation in the development of N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced transitional cell carcinomas in the urinary bladder of rats.</a> Z Krebsforsch Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87 (2), 139-160 (1976).</li><li>Crallan, R. A., Georgopoulos, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+human+bladder+carcinogenesis.">Experimental models of human bladder carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 27 (3), 374-381 (2006).</li><li>Samma, S., Uemura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+induction+of+carcinoma+in+situ+in+dog+urinary+bladder+by+sequential+treatment+with+N-methyl-N'-nitrosourea+and+N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine.">Rapid induction of carcinoma in situ in dog urinary bladder by sequential treatment with N-methyl-N'-nitrosourea and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine.</a> Gann. 75 (5), 385-387 (1984).</li><li>Bornhof, C., Wolfrath, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+urinary+bladder+urothelial+cancers+in+the+rabbit+by+dibutylnitrosamine+with+an+artificial+bladder+calculus+as+cocarcinogen.">Induction of urinary bladder urothelial cancers in the rabbit by dibutylnitrosamine with an artificial bladder calculus as cocarcinogen.</a> Urologe A. 28 (6), 339-343 (1989).</li><li>Irving, C. C., Tice, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced+urinary+bladder+cancer+in+rats+by+administration+of+disulfiram+in+the+diet.">Inhibition of N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced urinary bladder cancer in rats by administration of disulfiram in the diet.</a> Cancer Res. 39 (8), 3040-3043 (1979).</li><li>Mehta, N. R., Wurz, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-BLP25+vaccine+plus+letrozole+induces+a+TH1+immune+response+and+has+additive+antitumor+activity+in+MUC1-expresssing+mammary+tumors+in+mice.">L-BLP25 vaccine plus letrozole induces a TH1 immune response and has additive antitumor activity in MUC1-expresssing mammary tumors in mice.</a> Clin. Cancer Res. 18 (10), 2861-2871 (2012).</li></ol>

DPV, GTW, SMG, CJK, AMG, und GKH deklarieren keine Interessenkonflikte. MWD ist der Principal Investigator eines Zuschusses von Merck KGaA, und MW ist ein Mitarbeiter der Merck KGaA.

Die erfolgreiche Induktion von Übergangs-und invasive Plattenepithelkarzinome Blasenkarzinom in menschlichen MUC1.Tg Mäuse bietet eine Immuntherapie präklinischen Modell für Entwicklung. Immunotherapeutic Untersuchungen erfordern die Verwendung eines spontanen, Immunsystem intakt Modell, um die entzündliche Reaktion auf Tumorprogression im Laufe der Zeit als auch der Immunantwort auf eine Immuntherapie zu bewerten. In einer spontanen Tumorentwicklung Modell bleibt der Tumor-Mikroumgebung intakt und die Tumore entwi...

Blasenkrebs ist die vierthäufigste Krebsart und die achte häufigste Ursache für Todesfälle durch Krebs bei amerikanischen Männern. In den Vereinigten Staaten sind schätzungsweise 72.500 Neuerkrankungen und 15.000 Todesfällen von Blasenkrebs bei Männern und Frauen im Jahr 2013 1 kombiniert erwartet. Die Inzidenz von Blasenkrebs ist etwa dreimal so hoch bei Männern als bei Frauen. In den Vereinigten Staaten, Konto Übergangszeit Karzinome (TCC) für über 90% der Fälle, während Plattenepithelkarzinome (SCC) eine Inzidenz von weniger als 2% 2 haben. Der gesamte relative 5-Jahres-Überlebensrate für papilläre TCC ist 91,5% im Vergleich zu nur 30,9% für 2 SCC. Obwohl invasiven papillären TCCs entfallen rund 75% der Fälle zum Zeitpunkt der Diagnose, Behandlung sogar mit mehr als 50% der Patienten ein Rezidiv innerhalb von 5 Jahren zu erleben, mit bis zu 30% dieser Patienten voran zu Muskel-invasive Erkrankungen 3,4 . Typische Behandlungsschemata für Nicht-Muskel-invAsive Krankheit sind transurethrale Resektion (TUR) durch intravesical Chemotherapie. Bei Patienten mit hochgradigen Ta oder T1-Tumoren kann eine Wiederholung TUR vor der Chemotherapie 3,4 durchgeführt werden. Für jene Patienten mit low-grade Ta Rezidiven oder hochwertigem Ta oder T1-Läsionen, gefolgt von TUR adjuvante Chemotherapie oder Immuntherapie in Form von Bacillus Calmette-Guerin (BCG) 3,4 verwendet werden können. BCG hat sich gezeigt, überlegen zu sein intravesical Mitomycin C mit Bezug auf die Zeit, um eine Wiederholung 5. Für T2 Muskel invasive Erkrankungen, ist die radikale Zystektomie mit oder ohne neoadjuvante Chemotherapie die empfohlene Kur 3. Bei Patienten mit SCC erscheint Zystektomie die effektivste Behandlung 6 sein. Angesichts der sehr hohen Raten von Rückfällen trotz der besten Behandlungen zur Verfügung, es ist eindeutig ein Bedarf für neue, effektivere Therapien für Blasenkrebs. Ausbau neuer Immuntherapien zur abgeschlossenem Satzer Krebs ist ein möglicher Ansatz, die Versprechen für die Verlängerung des krankheitsfreien Überlebens halten kann. Historisch gesehen hat BCG die einzige effektive Immuntherapie für Blasenkrebs. Seine Wirkungsweise wird angenommen, dass die nicht-spezifische Induktion einer T-Helfer 1 (Th1) die Immunantwort durch die Erhöhung des Niveaus von Interleukin-2 (IL-2) und Interferon gamma (IFN-γ) 4 umfassen. Zelluläre oder Th1 Immunität, ist kritisch in Krebs-Immuntherapie als humorale oder Th2 hat Immunität nie als wirksam gegen feste Tumoren, mit Ausnahme von Antikörpern gegen Wachstumsfaktor-Rezeptoren 7 gerichtet. In einem Versuch, auf die Vorteile der BCG-Monotherapie zu verbessern, wurde IFN-α 2B/BCG Kombination Immuntherapie in einer klinischen Phase-II-Studie mit eindeutigen Ergebnisse 8 bewertet. Ein alternativer Ansatz zur Immuntherapie für Blasenkrebs sein kann, um Tumor-assoziierte Antigene (TAA), die Identifizierung von denen gemacht Krebsimmuntherapie präziser 7 hat gezielt </sup&gt;. Eine solche TAA Mucin 1 (MUC1), der ein Zelloberflächen-Glykoprotein in vielen epithelialen Tumoren wie Blasen-, Brust-, Lungen-und Bauchspeicheldrüsenkrebs 9,10 überexprimiert ist. Die Expression und Modifikation von MUC1 auch im wesentlichen während der Karzinogenese verändert, macht, dass underglycosylation antigene Sequenzen von Aminosäuren, wie variable Anzahl von Tandem-Repeats (VNTR) auf dem Peptid Kern bekannt. Während MUC1 ist ein selbst-Molekül sind diese immundominante VNTR-Regionen in der Regel nicht durch umfangreiche Glykosylierung ausgesetzt, und somit werden sie vom Immunsystem als fremd 11,12 gesehen. Zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs), die spezifisch erkennen MUC1-Epitope aus den Tumor-Lymphknoten von Brustkrebspatientinnen 13 sowie Blut und Knochenmark von Myelom-Patienten isoliert wurden 14,15, so dass MUC1 ein potentielles Ziel für eine zellulären Immunantwort. Die immundominante VNTRs der underglycosylated Form von MUC1 durch CTLs erkannt wird, was die Zerstörung von Tumorzellen 16-19. Native zelluläre und / oder humorale Immunantwort gegen Krebs MUC1 sind jedoch nicht stark genug, um Tumoren zu eliminieren. Um die bereits bestehende schwache Immunantwort auf MUC1 vermehren können synthetische Peptide immundominante durch Impfung eingeführt werden, um eine CTL-Reaktion stark genug, um einen klinischen Nutzen zu generieren 18,20 sein. Ein MUC1 liposomalen Impfstoff wurde bereits gezeigt, dass das Überleben bei Patienten mit Lungenkrebs 21,22 zu erhöhen, erzeugen CTLs, die töten MUC1-positive Tumorzellen, und produzieren eine Th1-polarisierten Zytokinantwort 23,24. Mit einer hohen Expression von MUC1 9,11,25, Blasenkrebs ist ein logischer Kandidat für die Prüfung MUC1 gerichtet Immuntherapie 26,27. Ferner weist MUC1 Potential als prognostischer Faktor in Blasenkrebs 28. MUC1-Expression in TCC signifikant Stadium und Grad zugeordnet ist, und metastatischen TCCEs wurde gezeigt, weiterhin MUC1 29 auszudrücken. Um die potentielle Nützlichkeit von MUC1-gerichtete Immuntherapie bei Blasenkrebs auszuwerten, haben wir eine intakte menschliche Immunsystem MUC1 (hMUC1)-exprimierenden transgenen (MUC1.Tg) Mausmodell von Blasenkrebs congenic auf der C57BL / 6 Hintergrund 30. Menschliche MUC1 ist als selbsttragende Protein unter der Kontrolle seines eigenen Promotors, was zu einer Gewebe-Expressionsmuster mit dem von Menschen beobachtet 30,31 ausgedrückt. Die Mäuse wurden mit dem bekannten Blase Karzinogen N-Butyl-N-(4-Hydroxybutyl) Nitrosamin (OH-BBN) 32, und dann die resultierenden Tumoren wurden hMUC1 Expression und Tumorart und Note bewertet induziert. Um die Wirkung des karzinogen auf Th1/Th2 Cytokinspiegel während der Tumorentwicklung zu untersuchen, wurden Serumproben regelmäßig für Multiplex-Analyse gesammelt. Die Mäuse wurden dann mit einer MUC1-Peptid-Impfstoff gezielt behandelt, und das Serum von Cytokinen und Immunantworten Auswertungted von Multiplex-Immunoassay fluorometrische Mikrokügelchen und ELISpot.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN)</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>B0938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G Gavage Needles</td>
			<td>Popper &#38; Sons, Inc.</td>
			<td>7921</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide Vaccine</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>investigational agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microtainers</td>
			<td>BD</td>
			<td>365957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Cassettes</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M490-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Buffer</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>87787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease &#38; Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cytokine 20plex Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LMC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Microsphere Beads</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>MC100xx-01</td>
			<td>xx is the bead region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse TNF- Capture Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>551225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse TNF- Detection Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>554415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IFN- Capture Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IFN- Detection Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab83136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Buffer</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>L-MAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokine Standard</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MXM8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-screen HTS 96well filter plates</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MSBVN1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA-PE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SA10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 m Nylon Tissue Sieves</td>
			<td>BD</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splenocyte Separation Media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-829E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF- /IL-4 ELISpot plates</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>ELD5217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody</td>
			<td>Epitomics</td>
			<td>2900-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-actin monoclonal antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP antibody</td>
			<td>Promega</td>
			<td>W401B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse HRP antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td>SC-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>162-0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean TGX Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>456-1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse Count &#38; Viability Kit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MCH100104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC1 Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550486</td>
			<td>IHC antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Research Peroxidase Kit</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K3954</td>
			<td>IHC staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore plate vaccum apparatus</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MSVMHTS00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Lx200</td>
			<td>Millipore / Luminex</td>
			<td>40-013</td>
			<td>Manufactured by Luminex, distributed by Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Xponent Software</td>
			<td>Millipore / Luminex</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Version 3.1; included with Luminex Lx200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milliple Analyst Software</td>
			<td>Milliplex / VigeneTech</td>
			<td>40-086</td>
			<td>Version 5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse Cell Analyzer</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>0500-3115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse Software</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Version 1.1.0.0; included with Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Unitron</td>
			<td>Z730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism Software</td>
			<td>Graphpad Software Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Version 5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans Blot SD Cell and PowerPac</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-3849</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of invasive transitional cell bladder carcinoma in immune intact human muc1 transgenic mice:  a model for immunotherapy development

Einem präklinischen Modell von Harnblasenkarzinom in menschlichen Mucin-1 (MUC1) transgene (MUC1.Tg) Mäuse für den Zweck der Bewertung Immuntherapie und / oder zytotoxische Chemotherapie entwickelt. Um Blasenkrebs, C57BL / 6 Mäuse (MUC1.Tg und Wildtyp) wurden oral mit dem Karzinogen N-Butyl-N-(4-hydroxybutyl) Nitrosamine (OH-BBN) bei 3,0 mg / Tag behandelt, 5 Tage / Woche induzieren für 12 Wochen. Um die Auswirkungen der OH-BBN auf Serum-Zytokin-Profil während der Tumorentwicklung zu bewerten, wurde Vollblut über submandibular blutet vor der Behandlung und alle vier Wochen gesammelt. Außerdem wurden ein MUC1-Peptid-Impfstoff gezielte und Placebo Gruppen von Mäusen wöchentlich acht Wochen lang verabreicht. Multiplex fluorometrische Mikrokügelchen immunoanalyses von Serum Zytokine während der Tumorentwicklung und nach der Impfung durchgeführt. Bei Beendigung, Interferon-gamma (IFN-γ) / Interleukin-4 (IL-4) ELISpot Analyse für MUC1 spezifischen T-Zell-Immunantwort und histopathologischen Auswertungen der Tumorartund Grad durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass: (1) das Vorkommen von Blasenkrebs in beide MUC1.Tg und Wildtyp-Mäusen betrug 67%, (2) Übergangsregelung Karzinome (TCC) im Verhältnis 2:1 entwickelt, um Plattenepithelkarzinome (SCC) im Vergleich , (3) inflammatorische Zytokine mit der Zeit während der Tumorentwicklung erhöht, und (4) Verwaltung des Peptid-Impfstoff induziert eine Th1-polarisierten Serum Zytokinprofil und MUC1 spezifischen T-Zell-Antwort. Alle Tumoren in Mäusen MUC1.Tg waren für MUC1 Ausdruck positiv, und die Hälfte aller Tumoren in MUC1.Tg und Wildtyp-Mäusen waren invasiv. Abschließend mit einem Team-Ansatz durch die Koordinierung der Bemühungen der Pharmakologen, Immunologen, Pathologen und Molekularbiologen haben wir ein Immunsystem intakt transgenen Mausmodell von Blasenkrebs, die hMUC1 Ausdruck entwickelt.

Die präklinische Beurteilung der Auswirkungen von neuen Immuntherapien und Kombinationen in Blasenkrebs erfordert die Entwicklung eines geeigneten Tiermodell. In unserer transgenen Mausmodell führte Induktion mit dem chemischen Karzinogen OH-BBN in einer hohen Rate von Blasenkrebs Inzidenz von überwiegend TCC mit einigen SCC, die ähnlich wie Blasenkrebs beim Menschen ist. Um Tumorhistologie, MUC1 Expression Status und die Immunantwort gegen das Peptid-Impfstoff Behandlung zu bestimmen, wurden 21 MUC1.Tg und 18 Wildt...

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Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

Ein N-Butyl-N-(4-Hydroxybutyl) Nitrosamin-induzierten Blasenkrebs Modell wurde in menschlichen Mucin-1 (MUC1) transgenen Mäusen zur Prüfung MUC1-gerichtete Immuntherapie entwickelt. Nach Verabreichung eines MUC1-Peptid-Impfstoff gezielt wurde eine zytotoxische T-Lymphozyten-Reaktion auf MUC1 durch Messung Serum Cytokinspiegel und T-Zell-spezifische Aktivität bestätigt.

Induktion von Invasive Transitional Handy Blasenkarzinom in Immune intakte menschliche MUC1 transgenen Mäusen: Ein Modell für Immuntherapie Entwicklung

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

induction-invasive-transitional-cell-bladder-carcinoma-immune-intact

Research

JoVE Journal

Medicine

21.1K Aufrufe.  University of California, Davis. Ein N-Butyl-N-(4-Hydroxybutyl) Nitrosamin-induzierten Blasenkrebs Modell wurde in menschlichen Mucin-1 (MUC1) transgenen Mäusen zur Prüfung MUC1-gerichtete Immuntherapie entwickelt. Nach Verabreichung eines MUC1-Peptid-Impfstoff gezielt wurde eine zytotoxische T-Lymphozyten-Reaktion auf MUC1 durch Messung Serum Cytokinspiegel und T-Zell-spezifische Aktivität bestätigt.

Serie: Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Aufbau und Verbreitung der Menschenrechte Retinoblastoma Tumore in immundefizienten Mäuse

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Forschung

Medizin

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body temperature that is observed during fever. The use of hyperthermia as an adjuvant has emerged as a promising procedure for tumor regression in the field of cancer biology. For this purpose, the most important requirement is to have reliable and uniform heating protocols. We have developed a protocol for hyperthermia (whole body) in mice. In this protocol, animals are exposed to cycles of hyperthermia for 90 min followed by a rest period of 15 min. During this period mice have easy access to food and water. High body temperature spikes in the mice during first few hyperthermia exposure cycles are prevented by immobilizing the animal. Additionally, normal saline is administered in first few cycles to minimize the effects of dehydration. This protocol can simulate fever like conditions in mice up to 12-24 hr. We have used 8-12 weeks old BALB/Cj female mice to demonstrate the protocol.

This paper describes a protocol for whole body hyperthermia in mice that can stimulate fever like conditions up to 12-24 hr.

Protokoll für Long Duration Ganzkörper-Hyperthermie in Mäuse

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

The lower urinary tract (LUT) functions as a dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a convenient time. While storing urine, however, the bladder is exposed for prolonged periods to waste products. By acting as a tight barrier, the epithelial lining of the LUT, the urothelium, avoids re-absorption of harmful substances. Moreover, noxious chemicals stimulate the bladder's nociceptive innervation and initiate voiding contractions that expel the bladder's contents. Interestingly, the bladder's sensitivity to noxious chemicals has been used successfully in clinical practice, by intravesically infusing the TRPV1 agonist capsaicin to treat neurogenic bladder overactivity1. This underscores the advantage of viewing the bladder as a chemosensory organ and prompts for further clinical research. However, ethical issues severely limit the possibilities to perform, in human subjects, the invasive measurements that are necessary to unravel the molecular bases of LUT clinical pharmacology. A way to overcome this limitation is the use of several animal models2. Here we describe the implementation of cystometry in mice and rats, a technique that allows measuring the intravesical pressure in conditions of controlled bladder perfusion.
	After laparotomy, a catheter is implanted in the bladder dome and tunneled subcutaneously to the interscapular region. Then the bladder can be filled at a controlled rate, while the urethra is left free for micturition. During the repetitive cycles of filling and voiding, intravesical pressure can be measured via the implanted catheter. As such, the pressure changes can be quantified and analyzed. Moreover, simultaneous measurement of the voided volume allows distinguishing voiding contractions from non-voiding contractions3.
	Importantly, due to the differences in micturition control between rodents and humans, cystometric measurements in these animals have only limited translational value4. Nevertheless, they are quite instrumental in the study of bladder pathophysiology and pharmacology in experimental pre-clinical settings. Recent research using this technique has revealed the key role of novel molecular players in the mechano- and chemo-sensory properties of the bladder.

Cystometry is an efficient technique to measure bladder function of small animals in vivo. The bladder is continuously infused at rates controlled through an intravesical catheter, whereas the urethra is left free for micturition. This allows for repetitive filling and emptying of the bladder, while intravesical pressure and voided volume are recorded.

Die Verwendung von Zystometrie in kleine Nagetiere: A Study of Bladder Chemosensorik

	The lower urinary tract (LUT) functions as a  dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a  convenient time. While ...

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

In vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate the human disease provide a valuable platform for research into disease pathophysiology and for the preclinical evaluation of novel therapies. We present a variety of methods to generate subcutaneous or orthotopic human HCC xenografts in immunodeficient mice that could be utilized in a variety of research applications. With a focus on the use of primary tumor tissue from patients undergoing surgical resection as a starting point, we describe the preparation of cell suspensions or tumor fragments for xenografting. We describe specific techniques to xenograft these tissues i) subcutaneously; or ii) intrahepatically, either by direct implantation of tumor cells or fragments into the liver, or indirectly by injection of cells into the mouse spleen. We also describe the use of partial resection of the native mouse liver at the time of xenografting as a strategy to induce a state of active liver regeneration in the recipient mouse that may facilitate the intrahepatic engraftment of primary human tumor cells. The expected results of these techniques are illustrated. The protocols described have been validated using primary human HCC samples and xenografts, which typically perform less robustly than the well-established human HCC cell lines that are widely used and frequently cited in the literature. In comparison with cell lines, we discuss factors which may contribute to the relatively low chance of primary HCC engraftment in xenotransplantation models and comment on technical issues that may influence the kinetics of xenograft growth. We also suggest methods that should be applied to ensure that xenografts obtained accurately resemble parent HCC tissues.

Human tumor xenografts in immunodeficient mice are valuable tools to study cancer biology. Specific protocols to generate subcutaneous and intrahepatic xenografts from human hepatocellular carcinoma cells or tumor fragments are described. Liver regeneration induced by partial hepatectomy in recipient mice is presented as a strategy to facilitate intrahepatic engraftment.

Generierung von subkutanen und Intrahepatische Menschenleberzellkarzinom Xenografts in immundefizienten Mäusen

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

Urinary Bladder Distention Evoked Visceromotor Responses as a Model for Bladder Pain in Mice

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized by increased urgency and frequency of urination, as well as nocturia and general pelvic pain, especially upon bladder filling or voiding. Despite years of research, the cause of IC/BPS remains elusive and treatment strategies are unable to provide complete relief to patients. In order to study nervous system contributions to the condition, many animal models have been developed to mimic the pain and symptoms associated with IC/BPS. One such murine model is urinary bladder distension (UBD). In this model, compressed air of a specific pressure is delivered to the bladder of a lightly anesthetized animal over a set period of time. Throughout the procedure, wires in the superior oblique abdominal muscles record electrical activity from the muscle. This activity is known as the visceromotor response (VMR) and is a reliable and reproducible measure of nociception. Here, we describe the steps necessary to perform this technique in mice including surgical manipulations, physiological recording, and data analysis. With the use of this model, the coordination between primary sensory neurons, spinal cord secondary afferents, and higher central nervous system areas involved in bladder pain can be unraveled. This basic science knowledge can then be clinically translated to treat patients suffering from IC/BPS.

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized in part by pelvic pain. In order to study nervous system contributions to the condition, a physiological model of urinary bladder pain is used in mice and rats.

Harnblase Aufdehnung evozierte viszeromotorische Antworten als Modell für Bladder Pain in Mäuse

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition ...

Facial Nerve Axotomy in Mice: A Model to Study Motoneuron Response to Injury

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and either cut or crush it to induce peripheral nerve injury. Advantages of this surgery are its simplicity, high reproducibility, and the lack of effect on vital functions or mobility from the subsequent facial paralysis, thus resulting in a relatively mild surgical outcome compared to other nerve injury models. A major advantage of using a cranial nerve injury model is that the motoneurons reside in a relatively homogenous population in the facial motor nucleus in the pons, simplifying the study of the motoneuron cell bodies. Because of the symmetrical nature of facial nerve innervation and the lack of crosstalk between the facial motor nuclei, the operation can be performed unilaterally with the unaxotomized side serving as a paired internal control. A variety of analyses can be performed postoperatively to assess the physiologic response, details of which are beyond the scope of this article. For example, recovery of muscle function can serve as a behavioral marker for reinnervation, or the motoneurons can be quantified to measure cell survival. Additionally, the motoneurons can be accurately captured using laser microdissection for molecular analysis. Because the facial nerve axotomy is minimally invasive and well tolerated, it can be utilized on a wide variety of genetically modified mice. Also, this surgery model can be used to analyze the effectiveness of peripheral nerve injury treatments. Facial nerve injury provides a means for investigating not only motoneurons, but also the responses of the central and peripheral glial microenvironment, immune system, and target musculature. The facial nerve injury model is a widely accepted peripheral nerve injury model that serves as a powerful tool for studying nerve injury and regeneration.

We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.

Facial Nerve Axotomie bei Mäusen: Ein Modell zur Motoneuron Reaktion auf eine Verletzung Studieren

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The &quot;Wire-Injury&quot; Model

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Induktion von beschleunigter Atherosklerose bei Mäusen: Das "Wire-Injury"-Modell

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Technique of Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice for Induction of Left Ventricular Hypertrophy

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure overload-induced left ventricular hypertrophy (LVH) and its progression to heart failure. In the majority of the reported investigations, this procedure is performed with intubation and ventilation of the animal which renders it demanding and time-consuming and adds to the surgical burden to the animal. The aim of this protocol is to describe a simplified technique of minimally invasive TAC without intubation and ventilation of mice. Critical steps of the technique are emphasized in order to achieve low mortality and high efficiency in inducing LVH.
Male C57BL/6 mice (10-week-old, 25-30 g, n=60) were anesthetized with a single intraperitoneal injection of a mixture of ketamine and xylazine. In a spontaneously breathing animal following a 3-4 mm upper partial sternotomy, a segment of 6/0 silk suture threaded through the eye of a ligation aid was passed under the aortic arch and tied over a blunted 27-gauge needle. Sham-operated animals underwent the same surgical preparation but without aortic constriction. The efficacy of the procedure in inducing LVH is attested by a significant increase in the heart/body weight ratio. This ratio is obtained at days 3, 7, 14 and 28 after surgery (n = 6 - 10 in each group and each time point). Using our technique, LVH is observed in TAC compared to sham animals from day 7 through day 28. Operative and late (over 28 days) mortalities are both very low at 1.7%.
In conclusion, our cost-effective technique of minimally invasive TAC in mice carries very low operative and post-operative mortalities and is highly efficient in inducing LVH. It simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal. It can be easily performed by following the critical steps described in this protocol.

The aim of this protocol is to describe step-by-step the technique of minimally invasive transverse aortic constriction (TAC) in mice. By elimination of intubation and ventilation which are mandatory for the commonly used standard procedure, minimally invasive TAC simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal.

Technik der minimal-invasiven quer Aortenstenose Verengung bei Mäusen für Induktion der linken Ventricular Hypertrophie

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure ...

A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an increased use of mouse models in orthopedic research was noted, most probably because mouse models offer a large number of genetically-modified strains and special antibodies for the analysis of molecular mechanisms of fracture healing. To control the biomechanical conditions, well-characterized osteosynthesis techniques are mandatory, also in mice. Here, we report on the design and use of a closed bone healing model to stabilize femur fractures in mice. The intramedullary screw, made of medical-grade stainless steel, provides through fracture compression an axial and rotational stability compared to the mostly used simple intramedullary pins, which show a complete lack of axial and rotational stability. The stability achieved by the intramedullary screw allows the analysis of endochondral healing. A large amount of callus tissue, received after stabilization with the screw, offers ideal conditions to harvest tissue for biochemical and molecular analyses. A further advantage of the use of the screw is the fact that the screw can be inserted into the femur with a minimally invasive technique without inducing damage to the soft tissue. In conclusion, the screw is a unique implant that can ideally be used in closed fracture healing models offering standardized biomechanical conditions.

This protocol describes a minimally invasive osteosynthesis technique using an intramedullary screw for standardized stabilization of femur fractures, which can be used to analyze endochondral bone healing in mice.

Eine Minimal-Invasive Modell Endochondral Frakturheilung bei Mäusen unter standardisierten Bedingungen biomechanische Analyse

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an ...