This work was funded by a grant from the National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) awarded to Professor Kesavan Esuvaranathan.

Alle Tier Arbeit auf die Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) Leitlinien für Tiernutzung eingehalten und Handhabung (Protokollnummer 084/12) an der National University of Singapore. 1. Growing MB49-PSA Zellen in vitro und PSA Secretion Mess <ol><li> Pflegen murine Blasenkrebszellen MB49-PSA 15 in vollständigen Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt, 2 mmol / L L-Glutamin und 0,05 mg / ml Penicillin-Streptomycin in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. Mit 200 &amp; mgr; g / ml Hygromycin B den Selektionsdruck der PSA-sezernierenden Zellen zu erhalten. </li><li> Zu PSA - Sekretion, Platte 1 x 10 6 Zellen in einer 6-Well - Kulturplatte bestimmen , und Inkubieren bei 37 ° C in Gegenwart von 5% CO 2 für 48 h. </li><li> Zwei Tage später, sammeln Sie den Überstand für die PSA-Messung. <ol><li> mit einer Pasteurpipette, übertragen Sie die supernatant in ein Zentrifugenrohr 15 mL. </li><li> Zentrifuge für 5 Minuten bei 250 xg in Fließzellen und Debris zu entfernen. Wenn der PSA-Test an einem anderen Tag durchgeführt wird, Speichern der Überstand bei - 30 ° C in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Falls nicht, gehen direkt zum nächsten Schritt. </li><li> Bestimmen Sie die PSA - Konzentration eine Mensch-freies PSA ELISA - Kit 7 verwenden. </li></ol></li><li> Auflisten der plattierten Zellen. <ol><li> Mit Hilfe einer Pasteur-Pipette, waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 1 ml DMEM. Absaugen und vollständig die Medien zu entfernen. </li><li> 1 ml frisches Medium und kratzen vorsichtig mit einem Zellschaber, die Zellen aus dem Bohrloch zu entfernen. </li><li> Transfer der Zellen in ein Mikrozentrifugenrohr und resuspendieren sie gründlich eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten. </li><li> Mischen Sie gleiche Volumina der Zellsuspension und einer 0,4% Trypanblau Lösung. Zählen Sie die lebenden Zellen (die nicht den Farbstoff aufnehmen) unter Verwendung einer Zählkammer. </li></ol></li><li> Berechnen Sie die PSA-Expression als ngvon PSA / ml Medium / 10 6 Zellen. Der PSA - Expression von MB49-PSA - Zellen für die Implantation in Mäuse ist 80 bis 120 ng / ml / 10 6 Zellen. </li></ol> 2. Bestimmung der Empfindlichkeit von PSA-Messungen mittels ELISA und Real-time PCR-Analyse <ol><li> Platte MB49-PSA - Zellen in komplettem DMEM - Medium in einer 6-Well - Kulturplatte mit unterschiedlichen Mengen an elterlicher MB49 - Zellen , so dass es ein Maximum von 1 x 10 6 Zellen pro Vertiefung ( das heißt, 10 0, 10 1, 10 2, 10 4 3, 10, 10 5 oder 10 6 MB49-PSA - Zellen werden mit 10 6, 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, 10 1 oder 10 0 MB49 - Zellen). </li><li> Einen Tag später, zur Erhebung der Überstand für PSA-Messung, wie in Schritt 1.3 beschrieben. Bestimmen Sie die PSA - Konzentration eine Mensch-freies PSA ELISA - Kit 7 verwenden. </li><li> Extrahieren Sie die RNA aus den Zellen. <ol><li> Lyse derZellen direkt in der Platte durch Zugabe von 1 ml RNA-Extraktion Reagenz. </li><li> Inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur und übertragen das Zelllysat in ein Mikrozentrifugenröhrchen. In 0,2 ml Chloroform und verwirbeln die Proben 15 s kräftig. Inkubieren sie für 3 min bei Raumtemperatur. </li><li> Zentrifugiere die Proben bei 12.000 xg für 15 min bei 4 ° C. übertragen Sie vorsichtig die obere wässrige Phase (0,5 ml) in ein frisches Röhrchen, ohne die Interphase zu stören. </li><li> 0,5 mL Isopropylalkohol. Inkubieren für 10 min bei Raumtemperatur. Zentrifugiere die Proben bei 12.000 xg für 10 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand vollständig, ohne Störung der RNA Niederschlag am Boden des Röhrchens. </li><li> Waschen Sie das Pellet einmal mit 1 ml 75% Ethanol. Zentrifuge bei 7.500 xg für 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie das gesamte Ethanol und erlauben das Pellet an der Luft trocknen für 10 min. </li><li> Lösen Sie die RNA in 30 ul Nuklease-freies Wasser. Inkubieren Sie für 5 min bei 60 ° C, die so zu erhöhen,lubility. </li><li> Quantifizieren der RNA durch Messung der Extinktion ultraviolettem (UV) -Spektroskopie bei 260 nm (A260) gemessen. Um RNA Reinheit beurteilen zu können, messen die Absorption bei 280 nm (A280) und berechnen Sie die A260 / A280-Verhältnis, das über 1,6 sein sollte. </li></ol></li><li> Revers transkribieren cDNA von 2 ug RNA. <ol><li> Bereiten Sie das Reaktionsgemisch auf Eis und überträgt es auf 0,2 ml-Röhrchen. </li><li> Zentrifuge kurz die Rohre um den Inhalt des Abschaltens und Luftblasen zu beseitigen. </li><li> Laden die Rohre in den Thermocycler und durchzuführen, die reverse Transkription bei den folgenden Bedingungen: 60 min bei 37 ° C, gefolgt von 5 min bei 95 ° C. Nachdem der Lauf beendet ist, halten die cDNA-Proben bei 4 ° C. </li><li> Lagern Sie die Proben bei - 30 ° C für die langfristige Lagerung. </li></ol></li><li> Führen Sie eine Echtzeit-PCR-Analyse für PSA und Cytoplasma-beta-Actin. Beta-Actin verwendet, um die Proben zu normalisieren. Führen des Assays auf 100 ng revers transkribierter RNA in einer 96-well plate. Assay alle Proben in dreifacher Ausfertigung. Führen 40 Zyklen mit den folgenden Parametern: 2 min bei 50 ° C, 10 min bei 95 ° C, 15 s bei 95 ° C für die Denaturierung und 1 min bei 60 ° C. Stellen Sie die niedrigste Nachweisgrenze bei einem Zyklus Schwellenwert (CT) von 35; Somit wird jede Probe mit einem CT-Wert über 35 wird als nicht nachweisbar. </li></ol> 3. Die Aufrechterhaltung der Tumorigenität des MB49-PSA-Zelllinie HINWEIS: Längerer Wachstum in vitro führt zu einem Verlust von tumorigenicity. Zur Aufrechterhaltung der tumorigenicity, die MB49-PSA-Zelllinie wird durch die Maus mindestens einmal alle 2 Jahre agiert. <ol><li> Zellen. <ol><li> Ernte exponentiell wachsenden Zellen, indem sie vorsichtig mit einem sterilen Zellschaber. Mischen Sie gleiche Volumina der Zellsuspension und einer 0,4% Trypanblau Lösung. Zählen Sie die lebenden Zellen mit einer Zählkammer. Sie nicht implantiert werden, wenn mehr als 20% der Zellen tot sind. </li><li> Berechne die Menge an lebenden Zellen erforderlich (1 x 107 Zellen / ml) und sie auf ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 250 xg für 5 min bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. Re-suspend das Zellpellet in DMEM leere Medien. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal alle Spuren von FBS vor der Implantation zu entfernen. </li><li> Halten Sie die Zellsuspension auf Eis, bis die Mäuse für die Implantation bereit sind. </li></ol></li><li> Implantieren subkutan die Tumorzellen in Mäusen auf der Rückenflanke. <ol><li> Anästhesieren einen 4- bis 6-Wochen alten C57BL6 / J-Maus eine Mischung aus dem Anästhetika Ketamin und Medetomidin (75 mg / kg und 1 mg / kg, jeweils), intraperitoneal mit 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht verwendet. </li><li> Rasieren Sie die rechte Flanke, die Haut zu belichten. </li><li> Mit einer Pinzette, heben Sie die Haut und macht sie von der darunter liegenden Muskeln zu trennen und zu injizieren 0,1 ml der Zellsuspension (1 × 10 6 Zellen) subkutan mit einer 24 G - Nadel. Während die Nadel entfernt wird, kneifen die Injektionsstelle für 5 bis 10 s, so dass die Tumorzellen tunnicht aus der Injektionsstelle austreten. </li><li> Beleben Sie die Maus mit einer subkutanen Injektion von Atipamezol (1 mg / kg) bei 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht. </li></ol></li><li> Überwachen Sie das Tumorwachstum alle zwei Tage durch Messen des Tumordurchmesser mit Sätteln. Das Tumorvolumen wird berechnet mit der Formel mit v = (ab 2) / 2, wobei &quot;a&quot; die längste Abmessung und &quot;b&quot; ist die senkrechte Breite, die beide in mm. </li><li> Wenn das Tumorvolumen mindestens 50 mm 3 (ungefähr 7 Tage) ist, euthanize die Maus mit CO 2. Excise die Tumormasse mit einem Paar von einer sterilen Pinzette und Schere unter aseptischen Bedingungen und in DMEM. </li><li> In einer 6-Well-Kulturplatte, Hackfleisch, den Tumor in kleine Stücke mit sterilen Skalpellen. Verwenden Sie eine 1 ml Spritzenkolben als &quot;Stößel&quot;, um die Tumor aufzuschlüsseln. </li><li> 3 ml vollständigem DMEM und aufrechtzuerhalten , die Zellen in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Sobald haften die Zellen an die plate (zwischen einem und zwei Tage), entfernen Sie die Medien, Schmutz und nicht haftenden Zellen, indem sie mit einer sterilen Pasteur-Pipette vorsichtig abgesaugt. Waschen Sie zweimal mit DMEM. Achten Sie darauf, nicht die Zellen stören. </li><li> In 1 ml DMEM und die Zellen ernten, indem sie mit einem Zellschaber. So wählen und einzelne Kolonien zu erweitern, um die Zellen zählen eine Hämozytometer und Platte 1 Zelle pro Vertiefung in einer 96-Well-Kulturplatte verwendet. Kulturzellen in DMEM mit 200 ug / ml Hygromycin B bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Ändern Sie die Medien und Antibiotika alle 4 - 5 Werktage. Überwachen Sie die Zellen, bis sie bei etwa 80-90% konfluent sind. Re-Platte die Zellen auf einer 24-Well-Kulturplatte durch Pipettieren Zellen aus dem Bohrloch zu entfernen. </li><li> Sobald die Zellen in der 24-Well-Kulturplatte konfluent sind, lösen sie durch mit einem Zellschaber und sie in einer 6-Well-Kulturplatte Platte. </li><li> Bildschirm, um die verschiedenen Klone für PSA-Sekretion, wie in Schritt 1 beschrieben Cryo-Erhaltung der Klon mit der höchsten PSA GeheimnisIon und verwenden Sie es für die zukünftige Mausexperimenten. </li></ol> 4. Das Implantieren der Tumor HINWEIS: Jede Maus ist mit 1 x 10 5 MB49-PSA - Zellen in 50 &amp; mgr; l DMEM leere Medien in der Blase implantiert. Durch den toten Raum in dem Katheter, bereiten immer mehr Volumen (mindestens 100 &amp; mgr; l extra pro Maus). Ein alternativer Ansatz wäre es , eine Luftspritze zu verwenden , wie von Kasman et al. 5 anstelle einer Spritze. <ol><li> Zellen. <ol><li> Einen Tag vor der Implantation, wenn die Zellen etwa 80% konfluent, passage die MB49-PSA Tumorzellen in vollständigem DMEM-Medium (ergänzt mit 10% FBS, 2 mmol / l L-Glutamin, 0,05 mg / ml Penicillin-Streptomycin und 200 &amp; mgr; g / ml Hygromycin B) bei 37 ° C und 5% CO 2 bei einem Teilungsverhältnis von 1: 2. </li><li> Am Tag des Verfahrens, ernten die Zellen, indem sie vorsichtig mit einem sterilen Zellschaber. Mischen Sie gleiche Volumina der Zellsuspension undeine 0,4% Trypanblau Lösung. Zählen Sie die lebenden Zellen mit einer Zählkammer. Sie nicht implantiert werden, wenn mehr als 20% der Zellen tot sind. </li><li> Berechne die Menge an lebenden Zellen erforderlich (2 x 10 6 Zellen / ml) und übertragen sie in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 250 xg für 5 min bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. Re-suspend das Zellpellet in DMEM leere Medien. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal alle Spuren von FBS vor der Implantation zu entfernen. </li><li> Halten Sie die Zellsuspension auf Eis, bis die Mäuse für die Implantation bereit sind. </li></ol></li><li> Lassen Sie das 4- bis 6-Wochen alten weiblichen C57BL / 6J-Mäuse für eine Woche vor dem Eingriff zu akklimatisieren. Alle tierischen Arbeiten müssen in einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten. <ol><li> Wiegen jeder Maus und injizieren Anästhesie (75 mg / kg Ketamin und 1 mg / kg Medetomidin) intraperitoneal mit 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht. Das Körpergewicht zwischen 17 und 22 g betragen. Bestätigen anesthetization durch keine respo Beobachtungnse nach einer Zehe Prise. </li><li> Zur Identifizierung, markieren Sie das Ohr einen Ohr Stempel verwenden. </li><li> Injizieren Hartmann-Lösung oder Verbindung Natriumlactat intraperitoneal in 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht jedes 1 bis 2 h für Feuchtigkeit. </li><li> Bewerben sterile Augensalbe für beide Augen mit einem sterilen Watte Lampe verwenden, da die Blinzelreflexes unter Narkose verloren geht und die Augen austrocknen. Erneute wenn nötig. </li><li> Legen Sie die Mäuse in Rückenlage auf dem Papier Handtücher auf einem Wärmepackung (durch den Kontakt mit Luft aktiviert) Körpertemperatur und kleben Sie die Hinterbeine nach unten zu halten. </li></ol></li><li> Mit einem Finger gelten sanften Druck auf den unteren Bauchbereich und sammeln Urin aus der Blase in ein Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 ml. Diese Probe dient als Grundwert von Harn-PSA. </li><li> Ziehen Sie sterile Poly-L-Lysin (PLL) in einen 1-ml-Spritze und befestigen Sie eine 24-Gauge-IV-Katheter, mit der Nadel Stilett entfernt. Schmiermittel auf der Spitze des Katheters und insert der Katheter durch die Harnröhre in die Blase Zange mit der Katheterisierung zu führen. Stoppen Sie, wenn Sie Widerstand spüren. HINWEIS: Die Forscher mit ihren Tierärzten über die Notwendigkeit der Verwendung eines Gleitgel mit Anästhetikum für intravesikale Instillationen und die Verwendung von post-Verfahren Analgetika diskutieren sollten. </li><li> Instill 50 ul PLL langsam, mit einer Geschwindigkeit von 10 &amp; mgr; l alle 20 s, zu vermeiden vesico-ureteral Rückfluß 18. Lassen Sie den Katheter in die Blase für 20 min mit einem Anschlag zu verhindern out-Flow. </li><li> Nach 20 min den Katheter zu entfernen und die Blase von Inhalten durch leichten Druck auf den unteren Bauchbereich räumen. Mit einem leeren 1-ml-Spritze, spülen Sie alle verbleibenden Inhalte aus dem Katheter. </li><li> Mix MB49-PSA-Zellen gründlich durch Pipettieren und ziehen sie in eine 1-ml-Spritze. Bringen Sie den Katheter und mit Schmiermittel. Instill 50 ul 1 x 10 5 Zellen mit einer langsamen Geschwindigkeit von 10 &amp; mgr; l alle 20 s. Setzen Sie den Anschlag aufder Katheter. Geben Sie Kontrollmäuse 50 &amp; mgr; l Kochsalzlösung. </li><li> Nach 1 h die Katheter entfernen und die Blase von allen Inhalten räumen. Entfernen Sie das Klebeband an den Hinterbeinen und legen Sie die Mäuse auf ihre ventralen Seiten. Revive die Mäuse durch subkutane Injektion der Umkehrung Arzneimittel (1 mg / kg Atipamezol) bei 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht. </li><li> Überwachen Sie die Mäuse bis Motilität beobachtet wird. Bringen Sie die Mäuse in ihre Käfige. </li><li> Nach Abschluss eines Tumordetektion Protokoll (§§ 5, 7 oder 8), einschläfern die Mäuse mit CO 2. Post-mortem Tumordetektion wird in Abschnitt 6 beschrieben. </li></ol> 5. Überwachung Tumorwachstum mit ELISA HINWEIS: Tumor Präsenz und Wachstum in Mäusen überwacht durch PSA-Sekretion im Urin zu messen. Die Forscher sollten auf die Überwachung der Tiergesundheit mit ihren Tierärzten beraten und Wohlbefinden nach der Tumorimplantation und humane Endpunkte. <ol><li> Es gibt zwei Verfahren Urin von Mäusen zu sammeln. <ol><li> Sammeln Sie Urin über Nacht durch eine einzige Maus in einem individuellen metabolischen Käfig platzieren entworfen Urin von Fäkalien zu trennen. Wenn der Setup-Kühlung nicht hat, ein Protease-Inhibitor (100 &amp; mgr; l) in den Urinsammelröhrchen geben über Nacht Abbau von PSA zu verhindern. Jedoch begrenzt die Anzahl der verfügbaren metabolischen Käfigen die Nützlichkeit dieser Methode der Urinsammlung. </li><li> Wo es logistisch unmöglich ist Stoffwechselkäfigen (wie in den ABSL2 Zimmer) zu verwenden, sammeln einen Finger Fleck Urin von mit leichtem Druck auf den unteren Bauchbereich auszuüben, während die Mäuse betäubt werden, wie in Schritt 4.2.1 beschrieben. Dies erfolgt in der Regel vor der Therapie eingeflößt wird. Aus unserer Erfahrung können mindestens 150 &amp; mgr; l Urin 1 h nach der Anästhesie gesammelt werden. </li></ol></li><li> Ab sofort stellen die gesammelten Urin auf Eis. Hämaturie kann ab der zweiten Woche nach der Tumorimplantation sichtbar. Stark hämolytische Proben können ELISA-Analyse beeinflussen. Daher Urinsmuss auf Eis und verarbeitet schnell nach der Sammlung platziert werden. </li><li> Zentrifugieren der Urinröhrchen bei 6.700 xg für 5 min bei 4 ° C Zellen oder Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Um die Differenz in Urinmenge zwischen den Mäusen, aliquoten der Urin in neue Schläuche zu normalisieren und lagern Sie sie bei -30 ° C bis die Analysen für PSA Durchführung eines ELISA - Kits 7 und Kreatinin unter Verwendung eines Assay - Kit 7 verwenden. Obwohl Mäuse PSA nicht produzieren, gibt es geringe Mengen an nicht-spezifische Bindung nachgewiesen, die unter Verwendung von ELISA. Für Proben als positiv betrachtet werden, muss der Schwellenwert auf Werte eingestellt werden , größer ist als in normalen Mäusen + 3 Standardabweichungen (SD) 15. </li></ol> 6. Nachweis von Tumor Präsenz mit Real-time PCR <ol><li> Bei Beendigung der Bauchhöhle der Maus sezieren und die Blase zu lokalisieren. Excise die Blase und legen Sie sie in eine Cryovial. Gefriert sofort in flüssigem Stickstoff. </li><li> Extrahieren Sie die RNA durch das Gewebe in einer RNA-Extr HomogenisierenAktion Reagenz. </li><li> Führen der reversen Transkription und Echtzeit-PCR-Analyse für PSA, wie oben in Abschnitt 2 beschrieben. </li></ol> 7. Monitoring Tumorwachstum mit Fluoreszenz-Imaging <ol><li> Etikett 1 x 10 7 MB49-PSA - Zellen mit einem Nahinfrarot-Fluoreszenzfarbstoff 19. </li><li> Re-Platte und ernten die markierten Zellen an den Tagen 4, 7, 11, 14, 18 und 21 zu überprüfen , ob Zellen behalten Lebensfähigkeit und Fluoreszenz mittels Durchflusszytometrie 20. </li><li> Implantieren Sie die markierten MB49-PSA-Zellen in Mäusen Blasen, wie in Abschnitt 4 oben beschrieben. </li><li> Überwachen Sie den Tumorwachstum eines Fluoreszenz-Imaging-System alle zwei Tage verwenden. </li><li> Am Tag der Bildgebung, wiegen und die Mäuse mit einer Mischung der Anästhetika Ketamin und Medetomidin (75 mg / kg und 1 mg / kg, jeweils), intraperitoneal mit 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht anästhesiert. </li><li> Rasieren Sie den Bauchbereich, die Haut zu belichten. </li><li> Platzieren Sie Mäuse in der Imaging-Kammer und erwerbenBilder der Blasen, die Software, die mit dem Abbildungssystem verwendet wird. </li><li> Revive die Mäuse durch subkutane Injektion einer Umkehrung Medikament (1 mg / kg Atipamezol) bei 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht. </li></ol> 8. Überwachung Tumorwachstum mit Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung <ol><li> Implantat-Tumoren in Mäusen, wie oben in Abschnitt 4 beschrieben. </li><li> Alle zwei Tage Tumorwachstum unter Verwendung von Ultraschall-Bildgebung zu überwachen. </li><li> Am Tag der Bildgebung, wiegen und die Mäuse mit einer Mischung der Anästhetika Ketamin und Medetomidin (75 mg / kg und 1 mg / kg, jeweils), intraperitoneal mit 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht anästhesiert. </li><li> Rasieren Sie den Bauchbereich, die Haut zu belichten. </li><li> Instill 100 ul steriler 0,9% Salzlösung in die Blase mit einer 24-Gauge-IV-Katheter. Die Kochsalzlösung wird die Blase aufblähen und die Sichtbarkeit während der Ultraschall-Bildgebung zu verbessern. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf dem Ultraschall-Plattform und Anwendung leitendes Gel auf die lower Bauch. </li><li> Senken Sie die Handsonde auf die Haut und erwerben B-Modus - Bilder der Blase auf dem Imaging - Plattform 21. </li><li> Revive die Mäuse durch subkutane Injektions Umkehrung Medikament (1 mg / kg Atipamezol) bei 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht. </li></ol>

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	<li>Gunther, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+syngeneic+orthotopic+murine+bladder+cancer+(MB49).">Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49).</a> Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).</li><li>Dobek, G. L., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthotopic+model+of+murine+bladder+cancer.">An orthotopic model of murine bladder cancer.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li><li>Chade, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathological+characterization+of+a+syngeneic+orthotopic+murine+bladder+cancer+model.">Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model.</a> Int Braz J Urol. 34, 220-226 (2008).</li><li>Chan, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+orthotopic+bladder+tumor+implantation+in+a+syngeneic+mouse+model.">Optimizing orthotopic bladder tumor implantation in a syngeneic mouse model.</a> J Urol. 182, 2926-2931 (2009).</li><li>Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthotopic+bladder+cancer+model+for+gene+delivery+studies.">An orthotopic bladder cancer model for gene delivery studies.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50181 (2013).</li><li>Ninalga, C., Loskog, A., Klevenfeldt, M., Essand, M., Totterman, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+oligonucleotide+therapy+cures+subcutaneous+and+orthotopic+tumors+and+evokes+protective+immunity+in+murine+bladder+cancer.">CpG oligonucleotide therapy cures subcutaneous and orthotopic tumors and evokes protective immunity in murine bladder cancer.</a> J Immunother. 28, 20-27 (2005).</li><li>Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+and+Microenvironment+Modification+during+Progression+of+Murine+Orthotopic+Bladder+Cancer.">Tumor and Microenvironment Modification during Progression of Murine Orthotopic Bladder Cancer.</a> Clin Dev Immunol. , 865684 (2011).</li><li>Chin, J., Kadhim, S., Garcia, B., Kim, Y. S., Karlik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+imaging+for+detecting+and+treatment+monitoring+of+orthotopic+murine+bladder+tumor+implants.">Magnetic resonance imaging for detecting and treatment monitoring of orthotopic murine bladder tumor implants.</a> J Urol. 145, 1297-1301 (1991).</li><li>Kikuchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantitative+analysis+of+early+stage+orthotopic+murine+bladder+tumor+using+in+vivo+magnetic+resonance+imaging.">Detection and quantitative analysis of early stage orthotopic murine bladder tumor using in vivo magnetic resonance imaging.</a> J Urol. 170, 1375-1378 (2003).</li><li>Sweeney, S. K., Luo, Y., O'Donnell, M. A., Assouline, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnology+and+cancer:+improving+real-time+monitoring+and+staging+of+bladder+cancer+with+multimodal+mesoporous+silica+nanoparticles.">Nanotechnology and cancer: improving real-time monitoring and staging of bladder cancer with multimodal mesoporous silica nanoparticles.</a> Cancer nanotechnology. 7, 3 (2016).</li><li>Tanaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+detection+of+bladder+cancer+in+an+orthotopic+murine+model+with+green+fluorescence+protein+cytology.">Noninvasive detection of bladder cancer in an orthotopic murine model with green fluorescence protein cytology.</a> J Urol. 170, 975-978 (2003).</li><li>Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+to+monitor+bladder+cancer+cell+adhesion+in+vivo:+a+new+approach+to+optimize+a+syngeneic,+orthotopic,+murine+bladder+cancer+model.">Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model.</a> BJU Int. 101, 120-124 (2008).</li><li>Newton, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-interleukin-10R1+monoclonal+antibody+in+combination+with+bacillus+Calmette--Guerin+is+protective+against+bladder+cancer+metastasis+in+a+murine+orthotopic+tumour+model+and+demonstrates+systemic+specific+anti-tumour+immunity.">Anti-interleukin-10R1 monoclonal antibody in combination with bacillus Calmette--Guerin is protective against bladder cancer metastasis in a murine orthotopic tumour model and demonstrates systemic specific anti-tumour immunity.</a> Clin Exp Immunol. 177, 261-268 (2014).</li><li>Patel, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transabdominal+micro-ultrasound+imaging+of+bladder+cancer+in+a+mouse+model:+a+validation+study.">Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study.</a> Urology. 75, 799-804 (2010).</li><li>Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+response+of+orthotopic+bladder+tumors+to+granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+therapy+using+the+prostate-specific+antigen+gene+as+a+reporter.">Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter.</a> Clin Cancer Res. 10, 6977-6984 (2004).</li><li>Luo, Y., Chen, X., O'Donnell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+prostate+specific+antigen+to+measure+bladder+tumor+growth+in+a+mouse+orthotopic+model.">Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model.</a> J Urol. 172, 2414-2420 (2004).</li><li>Coralli, C., Cemazar, M., Kanthou, C., Tozer, G. M., Dachs, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+reporter+green+fluorescent+protein+under+simulated+tumor+conditions.">Limitations of the reporter green fluorescent protein under simulated tumor conditions.</a> Cancer Res. 61, 4784-4790 (2001).</li><li>Biot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preexisting+BCG-specific+T+cells+improve+intravesical+immunotherapy+for+bladder+cancer.">Preexisting BCG-specific T cells improve intravesical immunotherapy for bladder cancer.</a> Sci Transl Med. 4 (137), 137ra172 (2012).</li><li>Swirski, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+near-infrared+cell+tracker+reagent+for+multiscopic+in+vivo+imaging+and+quantification+of+leukocyte+immune+responses.">A near-infrared cell tracker reagent for multiscopic in vivo imaging and quantification of leukocyte immune responses.</a> PLoS One. 2, 1075 (2007).</li><li>Jozwicki, W., Brozyna, A. A., Siekiera, J., Slominski, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+CD4+CD25+Foxp3++cells+in+peripheral+blood+in+relation+to+urinary+bladder+cancer+malignancy+indicators+before+and+after+surgical+removal.">Frequency of CD4+CD25+Foxp3+ cells in peripheral blood in relation to urinary bladder cancer malignancy indicators before and after surgical removal.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Walk, E. L., McLaughlin, S. L., Weed, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+Ultrasound+Imaging+of+Mouse+Cervical+Lymph+Nodes.">High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes.</a> J Vis Exp. , e52718 (2015).</li><li>Rooks, V., Beecken, W. D., Iordanescu, I., Taylor, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonographic+evaluation+of+orthotopic+bladder+tumors+in+mice+treated+with+TNP-470,+an+angiogenic+inhibitor.">Sonographic evaluation of orthotopic bladder tumors in mice treated with TNP-470, an angiogenic inhibitor.</a> Academic radiology. 8, 121-127 (2001).</li><li>Folin, O., Morris, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+determination+of+creatinine+and+creatine+in+urine.">On the determination of creatinine and creatine in urine.</a> JBC. 17, 469-473 (1914).</li><li>Dykman, L. A., Bogatyrev, V. A., Khlebtsov, B. N., Khlebtsov, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+assay+based+on+colloidal+gold+conjugates+with+trypsin.">A protein assay based on colloidal gold conjugates with trypsin.</a> Anal Biochem. 341, 16-21 (2005).</li><li>Shi, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Joint+enhancement+strategy+applied+in+ECL+biosensor+based+on+closed+bipolar+electrodes+for+the+detection+of+PSA.">Joint enhancement strategy applied in ECL biosensor based on closed bipolar electrodes for the detection of PSA.</a> Talanta. 154, 169-174 (2016).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemiluminescent+immunosensing+of+prostate-specific+antigen+based+on+silver+nanoparticles-doped+Pb+(II)+metal-organic+framework.">Electrochemiluminescent immunosensing of prostate-specific antigen based on silver nanoparticles-doped Pb (II) metal-organic framework.</a> Biosensors &amp; bioelectronics. 79, 379-385 (2016).</li><li>Kavosi, B., Salimi, A., Hallaj, R., Moradi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+electrochemical+immunosensor+for+PSA+biomarker+detection+in+prostate+cancer+cells+using+gold+nanoparticles/PAMAM+dendrimer+loaded+with+enzyme+linked+aptamer+as+integrated+triple+signal+amplification+strategy.">Ultrasensitive electrochemical immunosensor for PSA biomarker detection in prostate cancer cells using gold nanoparticles/PAMAM dendrimer loaded with enzyme linked aptamer as integrated triple signal amplification strategy.</a> Biosensors &amp; bioelectronics. 74, 915-923 (2015).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-species+comparison+of+orthologous+gene+expression+in+human+bladder+cancer+and+carcinogen-induced+rodent+models.">Cross-species comparison of orthologous gene expression in human bladder cancer and carcinogen-induced rodent models.</a> Am J Transl Res. 3, 8-27 (2010).</li><li>Gong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+Novel+Bladder+Cancer+Xenograft+Model+in+Humanized+Immunodeficient+Mice.">Establishment of a Novel Bladder Cancer Xenograft Model in Humanized Immunodeficient Mice.</a> Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 37, 1355-1368 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die kritischsten Schritte in dem Protokoll sind 1) erfolgreich die Tumorigenität der Zelllinie beibehalten wird; 2) meßbar PSA Sekretion vor Implantation der Tumorzellen in Mäusen zu gewährleisten; 3) Erzeugen einer Einzelzellsuspension zur Implantation, um Variation der Tumorgröße zu verringern; und 4) Einträufeln Zellen mit einer langsamen Geschwindigkeit vesico-ureteral Reflux zu verhindern, was zu einer Implantation der Tumorzellen in der Niere. Nach längerem Passage in vitro...

Das Ziel dieser Methode ist murine orthotope Blasentumoren zu erzeugen und die implantierten Tumore so genau wie möglich zu überwachen, so dass Mäuse ohne Tumorimplantation an Endpunktsanalyse nicht gedacht, um geheilt wurden. Insgesamt reduziert das Verfahren die Notwendigkeit für experimentelle Analyse für eine große Anzahl von Mäusen gezeigt, und eine höhere Genauigkeit sicherzustellen therapeutische Ergebnisse bei der Bestimmung. Die Entwicklung eines orthotopischen Modell für Krebs ist wichtig, da die Implantation von Tumorzellen nicht subkutan nicht die Umgebung der klinischen Erkrankung rekapitulieren oder die Entwicklung von therapeutischen Strategien ermöglichen. Die Architektur der Blase ermöglicht die Instillation von Blasenkrebstherapien direkt in die Blase mit minimaler systemischer Wirkungen. So Tiermodelle, die diese Umgebung, wie orthotop Modell rekapitulieren, sind wichtige neue Therapien zu bewerten. Die Schlussfolgerungen aus jedem Versuchsaufbau gezogen werden dependent von den Grenzen des Modells. Verschiedene Techniken wurden zur Herstellung von orthotope Blasentumoren in Mäusen entwickelt. Diese stützen sich auf eine Beschädigung des Glycosaminoglycans Schicht der Blase, so dass Tumorzellen implantiert werden. Die verwendeten Techniken umfassen Elektrokauterisation, die in einem einzigen Punkt der Beschädigung in der Blasenwand führt, was zur Tumorentwicklung an einer Stelle in der Blase 1,2. Allerdings ist die Erfolgsrate der Tumorimplantation Elektrokauterisation unter Verwendung von betreiberabhängig von 10 unterschiedlichen - 90%, und es schließt die Gefahr, dass die Blasenwand durchstochen wird, was zu Tumoren in der Bauchhöhle zu entwickeln. Chemische Kauter wird unter Verwendung von Silbernitrat durchgeführt, welche Schäden die Blasenwand 3. In ähnlicher Weise wurde Säure 4 der Blasenwand zu beschädigen. Trypsin hat auch die Blase als auch zu beschädigen 5 verwendet. Diese Verfahren können bei der Entwicklung von mehr als einem Tumor in der Blase führen.Darüber hinaus besteht die Gefahr von schweren Schäden an der Blase, wenn die Chemikalien zu lange in Kontakt mit der Blasenwand verbleiben. Die Methode von Ninalga et al. verwendet die sich positiv auf die Blasenwand zu beschichten geladene Moleküle poly-L-Lysin (PLL) 6; Dies ermöglicht die geladenen Tumorzellen negativ auf die Glycosaminoglycan Schicht der Blase zu halten. Dieses Verfahren führt im allgemeinen zu mehr als einem Tumor in der Blase entwickeln, aber der Tumorimplantation ist bei 80-100% 4,7. Technisch ist es auch die einfachste Verfahren auszuführen. Um sicherzustellen, dass die Tumoren, die ziemlich auch in der Größe zu entwickeln, ist es wichtig, dass die Tumorzellen nicht in großen Klumpen vor der Implantation gruppiert. Um die therapeutische Wirksamkeit zu bewerten, ist es am besten, diese Studie an Mäusen mit ziemlich ähnlich großen Tumoren durchzuführen. Somit kann eine gute Erkennungssystem, das die Tumorgröße bald nach der Implantation zu quantifizieren kann, ist wichtig. Mehrere Strategien haben Bienen verwendet Tumoren zu evaluieren. Dazu gehören die Magnetresonanztomographie (MRI) 8-10, Fluoreszenz 11, Biolumineszenz 12,13, Ultraschall 14 und enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 15,16. Während MRI und Ultraschall keine Modifikationen der Tumorzellen erforderlich ist, besteht ein Bedarf für empfindliche Geräte und Kontrastmittel für die MRI. Die Fluoreszenz-, Lumineszenz- und ELISA-basierten Assays erfordern Modifikation der Tumorzellen Markerproteine ​​zu exprimieren, die mit diesen Methoden nachgewiesen werden können. Für Lumineszenz wird ein Substrat für den Nachweis der Luciferase-Aktivität erforderlich ist; Somit gibt es einen zusätzlichen Schritt und höhere Kosten. Sowohl Lumineszenz und Fluoreszenz erfordern spezielle Ausrüstung. Zur Herstellung von Fluoreszenz, grün fluoreszierendes Protein (GFP) Cyclisierung, die durch molekularen Sauerstoff katalysiert wird, erforderlich. Somit kann die GFP-Expression innerhalb einer Tumormasse auf Zugang zu Sauerstoff abhängig variabel sein, so dass dies ein ziemlich unzuverlässig Marker <sup&gt; 17. Die Modifikation der murinen Zelllinie Blasenkrebs MB49 menschlichen Prostata - spezifisches Antigen (PSA) 15,16 absondern als Surrogat - Marker eine andere Strategie. Diese Marker stellen auch ein alternatives Mittel zur Bestätigung Tumor Anwesenheit bei der Beendigung des Versuchs, so dass sie eine Alternative zu Immunhistochemie. Diese Studie berichtet über die PLL Verfahren orthotope Tumorimplantation und stellt einen Vergleich der Tumordetektionssysteme, nämlich ELISA, Fluoreszenz und Ultraschallbildgebung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="893">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:404px;">MB49-PSA cells</td>
			<td style="width:188px;">N/A</td>
			<td style="width:188px;">N/A</td>
			<td style="width:113px;">ref (Wu QH, 2004)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">RPMI 1640 media</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) media</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fetal Bovine Serum (FBS) South American</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S181B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30088.03&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">L-glutamine</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>X0550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hygromycin B</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10687-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">free PSA (Human) ELISA kit</td>
			<td>Abnova</td>
			<td>KA0209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TRIzol Reagent for RNA extraction&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4374967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TaqMan Gene Expression Assay &#8211; Mouse Actb</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Mm00607939_s1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TaqMan Gene Expression Assay &#8211; Human KLK3</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Hs00426859_g1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">C57BL/6J female mice</td>
			<td>In Vivos</td>
			<td></td>
			<td>4-6 wk old</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anesthesia (75mg/kg Ketamine and 1mg/kg Medetomidine)</td>
			<td>Local pharmacy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Reversal drug (1mg/kg Atipamezole)</td>
			<td>Local pharmacy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Ear punch</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72893-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hartmann&#39;s solution or Compound sodium lactate</td>
			<td>B Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Ophthalmic ointment - Duratears sterile ocular lubricant ointment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Heat pack - HotHands handwarmers</td>
			<td>Heatmax Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Introcan Certo IV catheter</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>4251300</td>
			<td>24G x 3/4&#8243;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Aquagel Lubricating jelly</td>
			<td>Local pharmacy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">&#160;Poly-L-lysine solution, 0.01%,</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Quantichrom Creatinine Assay Kit</td>
			<td>BioAssay Systems</td>
			<td>DICT-50&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fluorescent dye - VivoTrack 680</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEV12000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>4427575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Equipment and Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">7500 Realtime PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">7500 Software v2.3</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Metabolic Cage</td>
			<td>Tecniplast&#160;</td>
			<td>Vertical type rack for 12 cages</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">BD FACSCanto I system&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">BD FACSDiva software v7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">IVIS SpectrumCT in vivo imaging system&#160;</td>
			<td>Caliper Life Sciences&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Living Image Software v3.1</td>
			<td>Caliper Life Sciences&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Vevo 2100 imaging system&#160;</td>
			<td>VisualSonics&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a murine orthotopic bladder tumor model and tumor detection system

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von Blasentumoren in weiblichen Mäusen C57BL / 6J der murinen Blasenkrebs-Zelllinie MB49 verwendet, die menschliche Prostataspezifischen Antigen (PSA), und das Verfahren für den Nachweis der Tumorimplantation abzusondern modifiziert wurde. Kurz gesagt, werden die Mäuse mit injizierbaren Medikamenten betäubt und in der Rückenlage zu legen hat. Urin aus der Blase geräumt und 50 ul Poly-L-Lysin (PLL) wird langsam mit einer Geschwindigkeit von 10 &amp; mgr; l / 20 s unter Verwendung einer 24 G IV-Katheter instilliert. Es wird 20 min in der Blase links durch den Katheter Stopfen verschlossen. Der Katheter wird entfernt und PLL wird durch sanften Druck auf die Blase verlassen. Dies wird durch Instillation des murinen Blasenkrebs - Zelllinie (1 x 10 5 Zellen / 50 &amp; mgr; l) mit einer Geschwindigkeit von 10 &amp; mgr; l / 20 s folgte. Der Katheter wird zugestöpselt vorzeitige Entleerung zu verhindern. Nach 1 h werden die Mäuse mit einer Umkehrung Droge wieder auf, und die Blase verlassen wird. Die langsame Einträufeln Rate ist wichtig,wie es reduziert vesico-ureteral Reflux, die Tumoren in der oberen Harnwege und in den Nieren auftreten verursachen können. Die Zelllinie sollte auch wieder ausgesetzt werden Verklumpung von Zellen zu reduzieren, da dies zu einer ungleichmäßigen Tumorgrößen nach der Implantation führen kann. Diese Technik induziert Tumoren mit hohem Wirkungsgrad. Das Tumorwachstum wird durch Urin-PSA-Sekretion überwacht. PSA Marker Überwachung ist zuverlässiger als Ultraschall oder Fluoreszenzabbildung für den Nachweis der Anwesenheit von Tumoren in der Blase. Tumoren in Mäusen im Allgemeinen eine maximale Größe, die einen negativen Einfluss auf die Gesundheit von etwa 3 erreichen - 4 Wochen, wenn sie unbehandelt. Durch die Überwachung des Tumorwachstums ist es möglich, Mäuse zu unterscheiden, die von den ausgehärteten wurden, die nicht erfolgreich mit Tumoren implantiert. Mit nur Endpunktanalyse, kann der letztere fälschlicherweise angenommen, dass durch Therapie geheilt wurden.

PSA Sekretion von MB49-Zellen wurde festgestellt, mit dem Wachstumsmedium zu variieren. MB49-PSA wird in DMEM - Medium gezüchtet , weil dies zu einer erhöhten PSA - Sekretion (1A). Um die Empfindlichkeit des PSA ELISA und Echtzeit-PCR, eine unterschiedliche Anzahl von MB49-PSA-sezernierenden Zellen wurden mit MB49 parentalen Zellen zu bestimmen. PSA ELISA detektiert ein Minimum von 1 x 10 5 PSA-sezernierenden Zellen / 1 x 10 6 Zellen (1B),...

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A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von murinen orthotope Blasentumoren in weiblichen C57BL / 6J-Mäusen und für die Überwachung des Tumorwachstums.

Ein Murine Orthotopische Blasentumormodell und Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

a-murine-orthotopic-bladder-tumor-model-and-tumor-detection-system

Research

JoVE Journal

Cancer Research

14.5K Aufrufe.  National University of Singapore, National University Health System.  Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von murinen orthotope Blasentumoren in weiblichen C57BL / 6J-Mäusen und für die Überwachung des Tumorwachstums. 

Serie: A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is important to control peritoneal dissemination. However, it is still unclear how tumor cells detach from primary lesions and attach to the mesothelium. The establishment of an appropriate animal model is needed to gain an understanding of the mechanism of peritoneal dissemination in vivo. In the current study, we introduce the process from the local injection of EOC cells into the murine ovarian surface to the development of metastasis, including the peritoneum and distant organs. Female nude mice (BALB/c nu/nu) at 8 weeks of age were used. Under a microscopic field of view, EOC cells (1 x 105 cells/&#181;l of medium-extracellular matrix (ECM)-based hydrogel/unilateral ovary/mouse) were injected into murine ovaries through a retroperitoneal approach from the dorsal flank. This proposed method is a less invasive procedure for the mouse and minimizes damage to the ovary. Here, we describe the methodological steps in the development of the original and metastatic tumor formation of EOC.

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

To clarify the multistep process of peritoneal dissemination of ovarian carcinoma, the current study presents a murine experimental model of original tumor development and peritoneal metastasis via orthotopic inoculation with these tumor cells.

Murine experimentellen Modell der ursprünglichen Tumor-Entwicklung und Peritoneal Metastasierung<em&gt; über</em&gt; Orthotopische Inokulation mit Ovarialkarzinomzellen

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

Forschung

Krebsforschung

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. Here we describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. With appropriate shielding, the irradiation targets the lower abdominal/pelvic region of the mouse, sparing the brain, in an effort to model radiation treatment received by individuals with pelvic cancers. We deliver an irradiation dose that is sufficient to induce fatigue-like behavior in mice, measured by voluntary wheel-running activity (VWRA), without causing obvious morbidity. Since wheel running is a normal, voluntary behavior in mice, its use should have little confounding effect on other behavioral tests or biological measures. Hence, wheel running can be used as a feasible outcome measure in understanding the behavioral and biological correlates of fatigue. CRF is a complex condition with frequent comorbidities, and likely has causes related both to cancer and its various treatments. The methods described in this paper are useful for investigating radiation-induced changes that contribute to the development of CRF and, more generally, to explore the biological networks that can explain the development and persistence of a peripherally-triggered but centrally-driven behavior like fatigue.

We describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. The selected non-lethal irradiation dose leads to a week-long reduction in voluntary wheel-running activity.

Ein Maus-Modell der Fatigue, induziert durch Peripheral Bestrahlung

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Orthotopic mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in hollow organs such as the large bowel. In order to produce uniform tumors which reliably grow and metastasize, standardized techniques of tumor cell preparation and injection are critical. 
We have developed an orthotopic mouse model of colorectal cancer (CRC) which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor cells from either primary tumors, 2-dimensional (2D) cell lines or 3-dimensional (3D) organoids are injected into the cecum and, depending on the metastatic potential of the injected tumor cells, form highly metastatic tumors. In addition, CTCs can be found regularly. We here describe the technique of tumor cell preparation from both 2D cell lines and 3D organoids as well as primary tumor tissue, the surgical and injection techniques as well as the isolation of CTCs from the tumor-bearing mice, and present tips for troubleshooting.

We describe the establishment of orthotopic colorectal tumors via injection of tumor cells or organoids into the cecum of mice and the subsequent isolation of circulating tumor cells (CTCs) from this model.

Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen in einem orthotopischen Mausmodell des Darmkrebses

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when stimulated by T lymphocytes, oncogenic B cells survive and expand autonomously in undefined organ niches. Mantle cell lymphoma (MCL) is one such B cell disorder, where the median survival rate of patients is 4 - 5 years. This calls for the need of effective mechanisms by which the homing and engraftment of these cells are blocked in order to increase the survival and longevity of patients. Therefore, the effort to develop a xenograft mouse model to study the efficacy of MCL therapeutics by blocking the homing mechanism in vivo is of utmost importance. Development of animal recipients for human cell xenotransplantation to test early stage drugs have long been pursued, as relevant preclinical mouse models are crucial to screen new therapeutic agents. This animal model is developed to avoid human graft rejection and to establish a model for human diseases, and it may be an extremely useful tool to study disease progression of different lymphoma types and to perform preclinical testing of candidate drugs for hematologic malignancies, like MCL. We established a xenograft mouse model that will serve as an excellent resource to study and develop novel therapeutic approaches for MCL.

Mantle cell lymphoma (MCL) is a difficult to treat B cell disorder and it is equally difficult to establish a xenograft mouse model of primary MCL to study and develop therapeutics. Here, we describe the successful establishment of MCL xenografts in mice to help understand its underlying biology.

Tumor Engraftment in einem Xenograft-Maus-Modell der menschlichen Mantel-Zell-Lymphom

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory regions of oncogenes and tumor suppressors can lead to changes in gene expression and play an important role in the pathogenesis of brain tumors. Native chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a popular technique that allows the detection of modifications or other proteins tightly bound to DNA. In contrast to cross-linked ChIP, in native ChIP, cells are not treated with formaldehyde to covalently link protein to DNA. This is advantageous because sometimes crosslinking may fix proteins that only transiently interact with DNA and do not have functional significance in gene regulation. In addition, antibodies are generally raised against unfixed peptides. Therefore, antibody specificity is increased in native ChIP. However, it is important to keep in mind that native ChIP is only applicable to study histones or other proteins that bind tightly to DNA. This protocol describes the native chromatin immunoprecipitation on murine brain tumor neurospheres.

Epigenetic mechanisms are frequently altered in glioma. Chromatin immunoprecipitation could be used to study the consequences of genetic alterations in glioma that result from changes in histone modifications which regulate chromatin structure and gene transcription. This protocol describes native chromatin immunoprecipitation on murine brain tumor neurospheres.

Native Chromatin Immunopräzipitation mit Murine Gehirn Tumor Neurosphären

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and transgenic genetically engineered mouse models. Unlike subcutaneous tumors, orthotopic tumors contain more clinically accurate vasculature, tumor microenvironment, and responses to multiple therapies. In contrast to genetically engineered mouse models, orthotopic models can be performed with lower cost and in less time, involve the use of highly complex and heterogeneous mouse or human cancer cell lines, rather that single genetic alterations, and these cell lines can be genetically modified, such as to express imaging agents. Here, we present a protocol to surgically injecting a luciferase- and mCherry-expressing murine prostate cancer cell line into the anterior prostate lobe of mice. These mice developed orthotopic tumors that were non-invasively monitored in vivo and further analyzed for tumor volume, weight, mouse survival, and immune infiltration. Further, orthotopic tumor-bearing mice were surgically castrated, leading to immediate tumor regression and subsequent recurrence, representing castration-resistant prostate cancer. Although technical skill is required to carry out this procedure, this syngeneic orthotopic model of both androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer is of great use to all investigators in the field.

The goal of this protocol is to demonstrate the intra-prostatic injection of prostate cancer cells, with subsequent castration. Orthotopic pre-clinical models of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer are critical to study the disease in the context of a clinically relevant tumor microenvironment and an immunocompetent host.

Eine Fluoreszenz und Biolumineszenz orthotopen Phänomen Mausmodell der Androgen-abhängige und Kastration-resistenten Prostatakrebs

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as tumors. Because digital polymerase chain reactions (PCR) enable the precise quantification of DNA copy number variants, they are becoming an essential tool for detecting rare genetic variations, such as drug-resistant mutations. It is expected that molecular diagnoses using digital PCR (dPCR) will be available in clinical practice in the near future; thus, how to efficiently conduct dPCR with human genetic material is a hot topic. Here, we introduce a method to detect Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism using dPCR with the chip-in-a-tube format, which allows eight dPCR reactions to be simultaneously conducted. Care should be taken when filling and sealing the reaction mixture on the chips. This article demonstrates how to avoid the over- and underestimation of positive partitions. Furthermore, we present a simple procedure for collecting the dPCR product from the partitions on the chips, which can then be used to confirm the specific amplification. We hope that this methods report will help promote the dPCR with the chip-in-a-tube method in genetic research.

Digital polymerase chain reaction (PCR) is a useful tool for the high-sensitivity detection of single nucleotide variants and DNA copy number variants. Here, we demonstrate key considerations for measuring rare variants in the human genome using digital PCR with the chip-in-a-tube format.

Digitalen Polymerase-Kettenreaktion-Assay für die genetische Variation bei einem sporadischen familiäre adenomatöse Polyposis Patienten mit dem Chip-in-Rohr-Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

Ein dreidimensionales thymisches Kultursystem zur Generierung von murine induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumor-Antigen-spezifischen thymischen Auswanderern

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and colorectal cancer (CRC). More than 50% of patients with muscle-invasive UCC, despite curative therapy for clinically-localized disease, will develop metastases and die within 5 years, and metastatic CRC is a leading cause of cancer-related deaths in the US. Xenograft models that consistently mimic UCC and CRC metastasis seen in patients are needed. This study aims to generate patient-derived orthotopic xenograft (PDOX) models of UCC and CRC for primary tumor growth and spontaneous metastases under the influence of LN stromal cells mimicking the progression of human metastatic diseases for drug screening. Fresh UCC and CRC tumors were obtained from consented patients undergoing resection for HG-UCC and colorectal adenocarcinoma, respectively. Co-inoculated with LN stromal cell (LNSC) analog HK cells, luciferase-tagged UCC cells were intra-vesically (IB) instilled into female non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency (NOD/SCID) mice, and CRC cells were intra-rectally (IR) injected into male NOD/SCID mice. Tumor growth and metastasis were monitored weekly using bioluminescence imaging (BLI). Upon sacrifice, primary tumors and mouse organs were harvested, weighed, and formalin-fixed for Hematoxylin and Eosin and immunohistochemistry staining. In our unique PDOX models, xenograft tumors resemble patient pre-implantation tumors. In the presence of HK cells, both models have high tumor implantation rates measured by BLI and tumor weights, 83.3% for UCC and 96.9% for CRC, and high distant organ metastasis rates (33.3% detected liver or lung metastasis for UCC and 53.1% for CRC). In addition, both models have zero mortality from the procedure. We have established unique, reproducible PDOX models for human HG-UCC and CRC, which allow for tumor formation, growth, and metastasis studies. With these models, testing of novel therapeutic drugs can be performed efficiently and in a clinically-mimetic manner.

This protocol describes the generation of patient-derived orthotopic xenograft models by intra-vesically instilling high-grade urothelial cell carcinoma cells or intra-rectally injecting colorectal cancer cells into non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency (NOD/SCID) mice for primary tumor growth and spontaneous metastases under the influence of lymph node stromal cells, which mimics the progression of human metastatic diseases.

Patientenabgeleitete orthotopische Xenograft-Modelle für humanes Urotheliale Zellkarzinom und Kolorektalkrebs-Tumorwachstum und spontane Metastasierung

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.