MS und YZ werden von KCL KCL-und PhD student China unterstützt. MO wurde von einem Biotechnologie und Biologische Wissenschaften Research Council Doktoranden-Stipendium gefördert. Wir danken Masaru Okabe und Jun-ichi Miyazaki für die pCX-EGFP-Plasmid und Alain Chedotal und Athena Ypsilanti für wertvolle Erfahrungsberichte Elektroporation.

Dieses Verfahren steht im Einklang mit den britischen Home Office Verordnungen (Tier Scientific Procedures Act, 1986). Wissenschaftler sollten die etablierten und durch ihre institutionelle und nationale Regulierungsorganisationen Tier genehmigten Richtlinien zu folgen. 1. Postnatale Elektroporation 1.1. Herstellung von Glas-Kapillaren, DNA-Lösung und Electroporator <ol><li> Bereiten zogene Glaskapillaren (OD: 1,5 mm, ID: 0,86 mm) für die DNA-Injektion. (Richt Einstellungen für eine Sutter P-97-Kapillare Zieher sind: Wärme 283; Ziehen 50; Velocity 90; Zeit 50). Machen Sie eine Markierung an der Kapillare entspricht einem Volumen von ca. 2 ul. </li><li> Stellen Sie die Spannung des Elektroporator bis 5 Rechteckimpulse, 50 ms / Puls bei 100 V, mit 850 ms Intervallen (100 V, 50 ms Puls ON, Puls 850 ms OFF, Puls 5). </li><li> Verdünnen hochreinen (OD 260/280&gt; 1,80) Endotoxin-freiem Plasmid-DNA bis zu einer Endkonzentration von 1-2 ug / ulmit Endotoxin frei Tris-EDTA-Puffer oder PBS. Es wird empfohlen, 0,1% Fast Green zu der DNA-Lösung (der Farbstoff in der Kammer verteilt, wenn erfolgreich injiziert) hinzuzufügen. </li><li> Bereiten Sie die Elektroden 5-7 mm, das Elektroden-Gel und erwärmen Sie das Heizkissen. </li></ol> 1.2. Elektroporation <ol><li> Entfernen einer postnatalen Tag 2 Maus-Welpe aus Käfig und betäuben sie durch Isofluran-Inhalation (bei einem Fluß von ~ 0,6 l / min). </li><li> Nach ca. 1 min, bestimmen den Zustand der Betäubung mit dem Fuß Prise Antwort. Wenn keine Bewegung stattfindet, fahren Sie mit intraventrikuläre Injektion. </li><li> Laden Kapillarnadel mit 1-2 &amp;mgr; l DNA mit einem Saugrohr mit der Kapillare verbunden ist. </li><li> Unter einer Kaltlichtquelle, halten Sie den Kopf des Welpen zwischen Daumen und Zeigefinger der weniger dominanten Hand. Etwas ziehen Sie die Haut wieder auf den Kopf, um die Identifizierung des richtigen Injektionsstelle zu helfen. </li><li> Betrachten Sie eine virtuelle Linie zwischen dem Auge und ter craniometric Wahrzeichen Lambda (Abbildung 1A). Legen Sie die Kapillarnadel bei etwa einem Drittel der Länge dieser Linie aus dem Lambda (ca. 1 mm von der Linie Mittelpunkt) 15. Legen Sie die Kapillare etwa 2 mm tief, achten Sie darauf, ein tiefes Eindringen in das Gehirn zu verhindern. </li><li> Injizieren Plasmid durch Blasen langsam durch den Mund (eine Spritze mit der Kapillare verbunden ist, kann auch verwendet werden). Während dieser Prozedur sicher, dass Ihre Finger nicht zu viel Druck auf das Gehirn, da dies erfolgreich Plasmid-Injektion zu verhindern. </li><li> Injektions stoppen, wenn eine minimale Menge an DNA-Lösung wird in die Kapillare verlassen. Es ist ratsam, weniger als 1 &amp;mgr; l injiziert, um schädliche Hirndruckanstieg zu vermeiden. </li><li> Mantel beide Elektroden mit Gel und sie mit der positiven Seite an der Seitenfläche der Halbkugel, wo die DNA injiziert wurde (Fig. 1A). Für die DNA-Einbau in den rostralen SVZ, Ort Elektroden etwas rostral derEinspritzstelle. Unterschiedliche Elektrodenposition regionale Spezifität der Elektroporation in verschiedenen Bereichen des SVZ 22,25 zu erreichen. </li><li> Initiieren Stromübertragung durch Drücken der Puls Fußschalter. Wenn die Elektroporation abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Spannung auf der Elektroporator Anzeige (Spannungswerte sollte nicht unter 90 V sein, da niedrigere Spannungswerte korrelieren mit schlechten Elektroporation Effizienz). </li><li> Reanimate den Welpen unter Sauerstoff auf Heizkissen für ein paar Minuten und wieder in den Käfig, indem sie weg von der Mutter. Achten Sie darauf, die Mutter ruft den Welpen und vereint sie mit dem Rest des Wurfes. Nach der Elektroporation verlassen Welpen mit ihrer Mutter für 4-7 Tage vor dem nächsten Schritt. </li></ol> 2. Vorbereitung der akuten Hirnschnittkulturen 2.1. Herstellung von Lösungen und Werkzeuge <ol><li> Die folgenden Lösungen erforderlich sind (es ist auch möglich, mit hohem Glucose DMEM zum Präparieren und Bildgebung17): Dissection Medium (500 ml) Gey-Balanced Medien - 500ml 45% Glukose - 5ml Film-Medium (10 ml) 45% Glukose - 0.110 ml HEPES 1 M - 0.100 ml Pen / Strep - 0.100 ml FCS - 0.500 ml B27 - 0.100 ml Glutamin - 0.200 ml Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (Phenol-frei), - 8,89 ml </li><li> Warm up Film-Medium bei 37 ° C </li><li> Zeigen Milli fügt in eine 35 mm Glasbodenkulturschale mit 1 ml Medium Film und in einem befeuchteten Brutschrank bei 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Bereiten Vibratoms Zubehör (Schraubendreher, Kammer, Rasierklingen, Kleber). </li><li> Bereiten Dissektion Werkzeuge: Schere, Spachtel, gerade Pinzette. </li><li> Bereiten Sie Werkzeuge für den Umgang mit Scheiben: kleinen Pinsel oder weichen Impföse (Größe: 10 ul), Kunststoff-Pasteurpipetten, ein Eis-Box und mehrere 6 cm Plastikschalen. </li><li> Vorkühlung der Dissektion Mediumbei 2-4 ° C. </li></ol> 2.2. Herstellung von Hirnschnitten <ol><li> Füllen Sie eine 6 cm Schale mit vorgekühlten Dissektion Medium und auf Eis (mit frisch geschnittenen Scheiben zu halten). </li><li> Nach Genickbruch, mit einer Schere, um die Maus pup enthaupten. Entfernen Sie die Kopfhaut mit einem Skalpell, schneiden Sie den Schädel entlang der Mitte der Pfeilnaht von der OB an das Kleinhirn und entfernen Sie vorsichtig die Schädellappen mit einer Pinzette. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Gehirn ausgesetzt ist und sorgfältig sezieren sie mit Hilfe einer Spachtel, die besondere Sorgfalt, nicht um das Gewebe zu beschädigen. Die Präparation muss sorgfältig durchgeführt werden, aber zur gleichen Zeit sehr schnell (weniger als eine Minute, wenn möglich). Genickbruch ist unsere bevorzugte Methode, weil Terminalanästhesie mit Drogen / Gas-Anästhetika können die Migrationseigenschaften der Neuroblasten und dem gesunden Zustand der Hirnschnittkulturen, die relativ schnell nach Tieropfer abgebildet werden müssen, beeinflussen. </li><li> Hemisect das Gehirn mit einem razoder Klinge (2). Entsorgen Sie nicht injizierten Hemisphäre oder Verwendung für andere Experimente. </li><li> Legen Sie ein kleines Stück Klebeband auf der Vibratom Halter und verwenden Sie die minimal notwendige Menge an Klebstoff, um die Gehirnhälfte oben drauf (Abbildung 2) zu befestigen. Dies verhindert eine Beschädigung der Halteroberfläche aufgrund von wiederholten Klebeanwendungen. </li><li> Lassen Sie den Kleber trocknen für ein paar Sekunden. </li><li> Zeigen Halter in der Vibratom Tablett mit vorgekühlten Dissektion Lösung gefüllt. Weisen den Riechkolben in Richtung der Klinge (2). </li><li> Beginnen Schneiden der Gehirnhälfte mit geeigneten Einstellungen. Die folgenden Parameter werden empfohlen: Schichtdicke 300 um; Geschwindigkeit ~ 3-5; Frequenz ~ 9. Hochfrequenz-und Niedergeschwindigkeits werden empfohlen, um eine Beschädigung der Scheibe zu vermeiden. </li><li> Sammeln Scheiben mit einem kleinen Pinsel oder einem weichen Impföse. Nur halten Scheiben mit sichtbaren OB (in der Regel 2-3 Scheiben / Gehirn). Typischerweise wird die Scheibe enthält die meisten der RMS can bei ~ 300 &amp;mgr; m von der Bodenfläche festgestellt werden. </li><li> Überprüfen Scheiben unter einem Fluoreszenzmikroskop Standard für GFP-Signal (achten Sie darauf, um sie umzudrehen, um die Fluoreszenz auf beiden Seiten überprüfen) und wählen Sie diejenigen, die helle Fluoreszenz entlang des größten Teils der RMS. </li></ol> 2.3. Kultivierung Hirnschnitten <ol><li> In einer Zellkultur Kapuze, schneiden Sie den meisten Schwanz Drittel der Hirnschnitt zu entfernen und mit feinen Pinzette oder gerade eine Mikrodissektion Skalpell keine Kleberspuren. </li><li> Zart absaugen Scheibe mit einem Kunststoff-Pasteur-Pipette (schneiden Sie die Spitze der Pipette, um eine größere Öffnung zu schaffen, wird dies eine Beschädigung der Scheibe) und legen Sie es auf die Mitte eines vorgewärmten Millicell-Einsatz. </li><li> Sicherzustellen, dass die Seite mit der hellsten Fluoreszenzsignal wird in Kontakt mit der Millicell Einsatz (für die Bildgebung mit einem umgekehrten Mikroskop) angeordnet ist. </li><li> Entfernen überschüssiger Lösung Präparation auf der Oberseite des Einsatzes mit einer Pipette. </li><li> Lassen Schnittkulturen zulassen sich in einem 37 ° C / 5% CO 2-Inkubator für mindestens 1 Stunde vor der Bildgebung. </li></ol> 3. Zeitraffer-Imaging Neuroblast von Migration <ol><li> Mindestens zwei Stunden vor der Bildgebung, schalten Sie den Perkin Elmer UltraViewVoX konfokale Spinning-Disk-System, invertiert Nikon Ti-E-Mikroskop, Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2) gekühlten CCD-Digitalkamera und Heizung (Solent Scientific) mit der konstanten eingestellt Temperatur von 37 ° C. </li><li> Öffnen Sie die Volocity Software Anschaffungs Modul, und klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Viz&quot; und wählen Sie den Laser (s) für die Bildgebung. </li><li> Innerhalb von 2 h von Hirnschnittpräparat, legen Sie das Glasbodenschale mit den Hirnschnitt in der Imaging-Kammer auf dem Mikroskoptisch. </li><li> Verwenden Sie ein Super-Nikon CFI Plan Fluor ELWD 20X/0.45 Ziel unter der entsprechenden Fluoreszenzlicht zu wählen und sich die Fläche der Scheibe, der abgebildet werden soll (z. B. der ersten absteigenden Teil des RMS kurz nach der Injektionsstelle, oder die elbow Bereich der RMS, oder einfach nur nach dem Ellenbogen vor Neuroblasten geben Sie die OB). </li><li> Richten Sie die Zeitraffer-Bildgebung mit den folgenden Aktionen: <ol><li> Auf dem Mikroskop, klicken Sie auf die Schaltfläche, um L100 Laser-Abtastung der Probe zu ermöglichen. </li><li> In Volocity, öffnen Sie das Ultraview Laser Changer von der Auswahl des geeigneten Laser (z. B. 488 nm Laser für GFP). </li><li> Stellen Sie die Belichtungszeit (in der Regel zwischen 100-500 ms) und die Laserintensität (in der Regel 20-30%) in Abhängigkeit von der Intensität des Fluoreszenzsignals. </li><li> Passen Sie die Bild digitale Verstärkung zu Zelle Visualisierung zu verbessern. </li><li> Wählen Sie die Z-Stapel-Intervall auf Bild im Hirnschnitt (in der Regel über ein Intervall um 100-120). Wähle ein Intervall mit einer geeigneten Anzahl von isolierten Zellen möglich zu vermeiden, überlagert, so viel wie möglich (dies die nachfolgenden Tracking-Analyse zu erleichtern). </li><li> Wählen Sie den Abstand zwischen den einzelnen Bild Z-Stapel (in der Regel 2-4 um). </li><li> Wählen Sie die Zeit interval zwischen jeder z-Stapelerfassung (z. B. 3 Minuten), und die Gesamtbilderzeugungszeitdauer (z. B. 3 Stunden). </li><li> Klicken Sie auf den &quot;Speichern&quot;-Symbol, um die Änderungen der Bildparameter zu speichern. </li><li> Drücken Sie die Aufnahme-Taste, um Bild starten. </li></ol></li><li> Alternative Abbildung der Kontroll-und experimentellen Proben (z. B. Fahrzeug / Arzneimittelbehandlung oder verschiedenen Plasmiden durch Elektroporation) während des gleichen Tages. </li></ol> 4. Analyse Neuroblast Migration <ol><li> In der Volocity Quantifizierung Modul, öffnen Sie die gewünschte Bibliothek nach Abschluss einer Zeitraffer-Experiment erstellt. Wählen Sie &quot;Erweiterte Tiefenschärfe&quot; von der linken oberen Feld (Abbildung 4A, Schritt 1). </li><li> Klicken Sie auf der Registerkarte &quot;Messungen&quot;, um das Messfenster angezeigt (Abbildung 4A, Schritt 2). </li><li> Eine Liste der Aufgaben ist in der unteren linken Ecke des Bildschirms sichtbar. Ziehen Sie &quot;Track&quot; (unter dem &quot;Verschiedenes&quot; vorhanden Überschrift am unteren Rand desdie Liste) auf dem Raum über. Dies wird die Eröffnung eines neuen Fenster namens &quot;Track&quot; in der oberen linken Bereich des Bildschirms (Abbildung 4A, Schritt 3) aufgefordert. </li><li> Wählen Sie &quot;Punkte&quot; von der &quot;Input&quot;-Reiter in der Track-Fenster (Abbildung 4A, Schritt 4). </li><li> Klicken Sie auf das Point Tool (Abbildung 4A, Schritt 5). </li><li> Starten Sie die Verfolgung der Migration Neuroblast, indem Sie mit der Maus auf den zentralen Bereich der Zellkörper und halten die Verfolgung der Zellbewegung bis zum letzten Zeitpunkt der Zeitraffer-erreicht wird (zum Beispiel Punktzahl 61 für eine 3 Stunden lange Film) . </li><li> Um Daten zu erhalten, wählen Sie &quot;Make Mess Item&quot; aus dem Menü Messungen (4B, Schritte 6-7). Ein Fenster in der Mitte des Bildschirms angezeigt. </li><li> In diesem Fenster wählen Sie &quot;Ein neues Messpunkt genannt:&quot; und geben Sie einen Namen ein (4C, Schritt 8). Denken Sie daran, die Option &quot;Alle Zeitpunkten&quot; vor pr wählenEssing OK (4C, Schritt 9). Ein Messpunkt Datei wird unter der Zeitraffer-Datei angezeigt und Parameter zur quantitativen Analyse (zB Migrations-Distanz, Geschwindigkeit, Weg und Verschiebungsrate) enthalten. </li><li> Doppelklicken Sie auf die Messpunkt Datei, um sie wie ein Fenster (4D, Schritt 10) zu öffnen. </li><li> Um die einzelnen Tracks der analysierten Zellen sichtbar zu machen, wählen Sie &quot;Raupen Point&quot; von den &quot;Display&quot;-Optionen (4D, Schritt 11). </li><li> Rechtsklick auf die Mess Artikel-Datei und exportieren es als Text-Datei, die dann in Programmen wie Excel, um die Migration zu analysieren Parameter importiert werden kann. </li><li> Um Bewegungen zwischen aufeinanderfolgenden Frames und Pausen von jeder Zelle während der Dreharbeiten Frist, in der Mess-Artikel-Datei aus den &quot;Display&quot; Optionen &quot;Punkt&quot; oder &quot;Populationen&quot;, und klicken Sie auf ID (jeder Track hat eine eindeutige ID) zu messen. Exportieren Sie die resultierende Datei durch gehenten, wie in Schritt 4.10 erläutert. </li></ol>

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(67), e4061 (2012).</li><li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling.">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li><li>Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+whole-mounts+of+the+subventricular+zone.">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone.</a> J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).</li><li>Schaar, B. T., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+coordination+during+neuronal+migration.">Cytoskeletal coordination during neuronal migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).</li><li>Valiente, M., Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+migration+mechanisms+in+development+and+disease.">Neuronal migration mechanisms in development and disease.</a> Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).</li><li>Comte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3+maintains+cell+motility+from+the+subventricular+zone+to+the+olfactory+bulb.">Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb.</a> J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).</li><li>Sonego, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+regulates+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain.">Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Effiziente Migration von neuralen Vorläuferzellen entlang der RMS sorgt für deren anschließende Reifung in funktionelle Neuronen 10. Prominent Streams von neuralen Vorläuferzellen in Richtung des OB gerichtet sind, sind in der menschlichen Kindheit sichtbar und werden wahrscheinlich eine wichtige Rolle in der frühen postnatalen Entwicklung des menschlichen Gehirns 27 zu spielen. Darüber hinaus sind diese Zellen in der Lage, Websites des Gehirns durch Verletzungen und Neurodegeneration betroff...

Im Säugerhirn, die Erzeugung von neuen Neuronen (Neurogenese) erfolgt nach der Geburt vor allem in zwei Regionen, die Subventrikularzone (SVZ) der Seitenventrikel und der Subgranularzone im Gyrus dentatus des Hippocampus 1. Deutliche Beweise in den letzten Jahren gesammelt unterstützt eine entscheidende Rolle für die postnatalen Neurogenese im Hippocampus und Riechkolben Speicherfunktionen 1-3. Wichtig ist, daß die postnatale Neurogenese auch therapeutisches Potential aufgrund der Beziehung mit degenerativen neurologischen Störungen, und die Fähigkeit von Neuroblasten an verletzten Stellen im Gehirn 4-6 migrieren. Die Subventrikularzone (SVZ) hat vor kurzem als ein entscheidender neurogenen Nische. SVZ abgeleiteten Neuroblasten wandern zur Riechkolben (OB) über dem rostralen Migrationsstrom (Effektivwert), so dass dies die längste Migration in der postnatalen Gehirn 1,7,8. Die Säugetier SVZ / RMS / OB-System hat sich zu einemnützliches Modell, um verschiedene Schritte der Neurogenese, wie Proliferation, Migration und Differenzierung 1,8 studieren. Viele Wachstumsfaktoren und extrazelluläre Signale regulieren SVZ Neurogenese und Migration entlang der RMS, aber die intrazellulären molekularen Mechanismen sind bei weitem nicht vollständig verstanden 1,9. Proper Migration entlang der RMS ist entscheidend für die spätere Reifung neugeborener Neuronen 10. Darüber hinaus haben einige Studien gezeigt, dass SVZ-derived Neuroblasten kann der RMS-Hirn-Verletzungen Websites 4-6,11-13 migrieren. So untersucht die Signalmechanismen Regelneuroblast Migration ist von grundlegender Bedeutung nicht nur für die Neurogenese zu verstehen, sondern auch für mögliche therapeutische Anwendungen. Hier ein ausführliches Protokoll zu SVZ neuralen Vorläuferzellen durch in vivo Elektroporation postnatale beschriften und Überwachung ihrer Wanderung entlang der RMS in akuten Hirnschnittkulturen mit Zeitraffer-konfokale Mikroskopie drehenden Scheibe beschreiben wirpy. Elektroporation ist weit verbreitet in Entwicklungsstudien aus embryonalen zu adulten Stadien 14-18 verwendet. Es ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um gezielt manipulieren SVZ neuralen Vorläuferzellen und ist ein kostengünstiger und wesentlich schnellere Alternative zu stereotaktische Injektion von viralen Vektoren oder Erzeugung transgener Modelle 1,15,19,20. Es ist ein relativ einfaches Verfahren, das nicht braucht, Chirurgie und hat eine hohe Überlebensraten. Elektroporation von shRNA oder CRE-Rekombinase-exprimierenden Plasmiden in Maus-Modellen Verwendung der genetischen LoxP System kann verwendet werden, um gezielt Gene von Interesse oder dauerhafte Kennzeichnung von SVZ Vorläuferzellen zu erreichen, stellt somit ein nützliches Werkzeug für die adulte Neurogenese Studien 21,22 werden. RMS Imaging Neuroblast Migration im intakten Gehirn ist immer noch eine Herausforderung aufgrund der aktuellen technischen Einschränkungen. Allerdings kann dieser Prozess mit Hilfe der konfokalen Spinning-Disk-Zeitraffer-Mikroskopie von akuten Hirnschnitten, die eine geeignete syst bieten überwacht werdenem sehr ähnlich der in vivo-Zustand, der auch offen für pharmakologische Manipulation 23,24. Kopplung in vivo Elektroporation mit postnatalen Zeitraffer-Imaging wird das Verständnis der molekularen Mechanismen, die die Neuroblast Beweglichkeit erleichtern und dazu beitragen, die Entwicklung von neuartigen Ansätzen zur Heilung des Gehirns zu fördern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="854">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Millicell</td>
			<td style="width:195px;">Millipore</td>
			<td style="width:149px;">PICM0RG50</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm Glass bottom culture dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td style="width:149px;">P35G-0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gey&#39;s Balanced media</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>G9779-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose, 45%</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>G8769-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FCS</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">10109-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:195px;"><a>Invitrogen Life Technologies</a></td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:195px;"><a>Invitrogen Life Technologies</a></td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (phenol red-free)</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Glass capillaries for injection</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">30-0057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Aspirator tube</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:149px;">A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sutter P-97 capillary puller</td>
			<td style="width:195px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:149px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">ECM830 Square Wave Electroporator</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Platinum Tweezertrodes 7 mm</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Footswitch Model 1250F</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel for electrodes</td>
			<td style="width:195px;">Cefar Compex</td>
			<td style="width:149px;">6602048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:195px;">Merial</td>
			<td style="width:149px;">AP/DRUGS/220/96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:149px;">VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glue</td>
			<td>Roti coll</td>
			<td>Roti coll 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraViEW VoX spinning disk system</td>
			<td style="width:195px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Volocity software</td>
			<td style="width:195px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Acquisition, Quantitation, Visualization Modules</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Environmental chamber for microscopy</td>
			<td style="width:195px;">Solent Scientific</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Custom-made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices

Die Subventrikularzone (SVZ) ist einer der wichtigsten neurogenen Nischen in der postnatalen Gehirn. Hier neuralen Vorläuferzellen vermehren sich und führen zu Neuroblasten in der Lage, entlang des rostralen Migrationsstrom (RMS) zum Bulbus olfactorius (OB) zu bewegen. Diese Fern Migration für die anschließende Reifung neugeborener Neuronen im OB benötigt, aber die molekulare Mechanismen, die diesen Prozess sind noch unklar. Untersuchung der Signalwege steuern Neuroblast Motilität kann nicht nur helfen, zu verstehen, einen entscheidenden Schritt in der Neurogenese, sondern auch therapeutische regenerative Potenzial, da die Fähigkeit der Neuroblasten zu Hirn Websites durch Verletzung, Schlaganfall oder Degeneration betroffen Ziel. In dieser Handschrift beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für in vivo-Elektroporation und anschließender postnatale Zeitraffer-Bildgebung Neuroblast von Migration in den Maus RMS. Postnatale Elektroporation kann SVZ Vorläufer effizient transfizierenZellen, die wiederum erzeugen Neuroblasten Migration entlang der RMS. Mit der konfokalen Spinning-Disk-Zeitraffer-Mikroskopie an akuten Hirnschnittkulturen, können Neuroblast Migration in einer Umgebung, sehr ähnlich der in vivo-Zustand überwacht werden. Außerdem kann Neuroblasten Motilität verfolgt und quantitativ analysiert werden. Als Beispiel beschreiben wir, wie man in vivo Elektroporation postnatale einer GFP-exprimierenden Plasmid verwenden, um zu kennzeichnen und zu visualisieren Neuroblasten Migration entlang der RMS. Elektroporation von shRNA oder CRE-Rekombinase-exprimierenden Plasmiden in Knockout-Mäusen unter Verwendung der loxP-System kann auch verwendet werden, um Gene von Interesse abzuzielen. Pharmakologische Manipulation von akuten Hirnschnittkulturen durchgeführt werden, um die Rolle der verschiedenen Signalmoleküle in Neuroblasten Migration zu untersuchen. Durch die Kopplung von In-vivo-Elektroporation mit Zeitraffer-Bildgebung, hoffen wir, die molekularen Mechanismen, die die Neuroblast Motilität verstehen und dazu beitragen, die Entwicklunglung neuer Ansätze zur Heilung des Gehirns zu fördern.

Kennzeichnung von SVZ-abgeleiteten Migrationsneuroblasten entlang der RMS beobachtet werden, in der Regel 4-8 Tage nach einer erfolgreichen Elektroporation (Abbildung 1B). Längere Zeitpunkte können auch gewählt werden, weniger Zellen werden in den RMS gefunden werden, da die meisten von ihnen die OB eingegeben. Neuroblasten starten Erwerb typische Morphologie und Eigenschaften von reifen Körnerzellen im OB etwa 2-3 Wochen nach der Elektroporation (nicht gezeigt). Nach Kultivierung für ~ 1 Stunde, k...

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In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast Migration ist ein grundlegendes Ereignis in der postnatalen Neurogenese. Wir beschreiben ein Protokoll für die effiziente Markierung von Neuroblasten durch in vivo Elektroporation postnatalen und anschließende Visualisierung der Migration mit Zeitraffer-Bildgebung der akuten Hirnschnitten. Wir sind eine Beschreibung für die quantitative Analyse von Neuroblast Dynamik von Video-Tracking.

In-vivo-Elektroporation und Postnatale Zeitraffer-Imaging Neuroblast von Migration in Maus Akute Hirnschnitten

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

in-vivo-postnatal-electroporation-time-lapse-imaging-neuroblast

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

13.1K Aufrufe.  King's College London.  Neuroblast Migration ist ein grundlegendes Ereignis in der postnatalen Neurogenese. Wir beschreiben ein Protokoll für die effiziente Markierung von Neuroblasten durch in vivo Elektroporation postnatalen und anschließende Visualisierung der Migration mit Zeitraffer-Bildgebung der akuten Hirnschnitten. Wir sind eine Beschreibung für die quantitative Analyse von Neuroblast Dynamik von Video-Tracking. 

Serie: In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Ein organotypischen Assay für High-Resolution Time-Lapse Imaging neuronaler Migration in der postnatalen Gehirn

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Forschung

Neurowissenschaften

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Zeitraffer-Live-Imaging von klonal verbundenen neuronalen Vorläuferzellen in der Entwicklung von Zebrafisch Vorderhirnneuronen

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration in Acute Scheiben von der adulten Maus Vorderhirnneuronen

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Langfristige Zeitraffer-Imaging von Maus Cochlear Explantate

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex-vivo-Bildgebung von Postnatale Kleinhirn-Körnerzellmigration mittels konfokaler Makros

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Migration von Neuronen in der organotypischen Scheibe Kultur der embryonalen Maus Gehirn mit<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Calcium Imaging in Maus Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent cerebellum is an ideal system to track the development and morphogenesis of a single cell type, the cerebellar granule neuron (CGN), across time. Here, in vivo electroporation of granule neuron progenitors in the developing mouse cerebellum was employed to sparsely label cells for subsequent morphological analyses. The efficacy of this technique is demonstrated in its ability to showcase key developmental stages of CGN maturation, with a specific focus on the formation of dendritic claws, which are specialized structures where these cells receive the majority of their synaptic inputs. In addition to providing snapshots of CGN synaptic structures&#160;throughout cerebellar development, this technique can be adapted to genetically manipulate granule neurons in a cell-autonomous manner to study the role of any gene of interest and its effect on CGN morphology, claw development, and synaptogenesis.

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Here we describe a method to visualize synaptogenesis of granule neurons in the mouse cerebellum over the time course of postnatal brain development when these cells refine their synaptic structures and form synapses to integrate themselves into the overall brain circuit.

Verwendung der postnatalen In-vivo-Elektroporation zur Untersuchung der Morphologie von Kleinhirngranula-Neuronen und der Synapsenentwicklung

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent ...