Diese Arbeit wurde durch ein Wellcome Trust Project Grant PD und GL vergeben (089236/Z/09/Z) finanziert. SG wurde von einem Biotechnologie und Biologische Wissenschaften Research Council Doktoranden-Stipendium unterstützt. Wir danken Matthieu Vermeren für die Art Geschenk der shRNA-Vektor und Jennifer Shieh für wertvolle Hinweise auf Neuroblast Nukleofektion.

Dieses Verfahren steht im Einklang mit den britischen Home Office Verordnungen (Tier Scientific Procedures Act, 1986). Wissenschaftler sollten die etablierten und durch ihre institutionelle und nationale Regulierungsorganisationen Tier genehmigten Richtlinien zu folgen. 1. Dissection und Dissoziation von Ratte RMS Neuroblasten <ol><li> Bereiten Sie die für RMS-Dissektion und Dissoziation erforderlichen Lösungen: </li></ol> Dissektion Medium (100 ml) Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) - 98,5 ml 5 M HEPES pH-Wert von 7,4 bis 0,5 ml Penicillin-Streptomycin (10.000 Einheiten / ml bis 10.000 &amp;mgr; g / ml) - 1 ml Dissoziation Medium (2 ml) HBSS - 1.760 ml 10x Trypsin (2,5%) - 200 ul DNAse1 (1 mg / ml) - 40 &amp;mgr; l Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) + 10% fötales Kälberserum (FCS) (40 ml) DMEM -36 ml FCS - 4 ml Komplett-Medium (12 ml) Neurobasalmedium - 11.46 ml B27 Supplement - 250 ul L-Glutamin (200 mM) - 125 ul Glucose (45%) - 165 ul 2. Filter-Sterilisieren der DMEM + 10% FCS und die Komplettmedium und preequilibrate sie in einem 37 ° C / 5% CO 2-Inkubator. <ol><li> Präparation <ol><li> Opfere eine P6-P7 Ratte Wurf (etwa 12 Jungtiere) durch Genickbruch und enthaupten mit einer Schere. </li><li> Machen Sie eine ap-Schnitt in der Haut entlang der Mittelpfeilnaht von der Nase des Kleinhirns mit einer Skalpellklinge. Ziehen Sie die Haut ab und wiederholen Sie den gleichen Schnitt entlang der Schädel. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Schädelklappen mit Zange und entfernen Sie vorsichtig das Gehirn mit einem Spatel, kümmert sich um die Riechkolben enthalten. </li><li> Schneiden Sie die meisten Schwanz Drittel des Gehirns und entsorgen. </li><li> Hacken Sie the Hirngewebe in 1,4 mm dicke Scheiben mit einem koronalen Gewebe Chopper. </li><li> Zeigen Scheiben in Schalen mit kaltem Dissektion Medium und sorgfältig trennen sie mit einer Nadel. </li><li> Die RMS wird als dreieckige, durchscheinenden Bereich in der Mitte der OB Abschnitten und als eine kleine, kreisförmige Fläche in mehr kaudalen Hirnschnitten. Schneiden Sie die RMS von jeder Scheibe mit einem mikrochirurgischen Messer, dabei darauf achten, einschließlich der umgebenden Gewebe. In P7 Rattenjungen, in der Regel die meisten rostral ~ 8 Scheiben (inklusive OB) enthalten die RMS. </li><li> Sammeln Sie die RMS-Fragmente mit einer Kunststoff-Pasteur-Pipette und legen Sie sie in eine kleine Schüssel mit kaltem Dissektion Medium auf Eis. </li><li> Wenn die Präparation abgeschlossen ist, übertragen Sie die RMS-Fragmente in einen 15-ml-Tube mit einer Kunststoffpipette. Lassen Fragmente am Boden des Röhrchens zu begleichen. </li></ol></li><li> Dissoziation <ol><li> Ersetzen Sie die Dissektion Medium mit 2 ml Medium Dissoziation. </li><li> Verreiben Sie das RMS-Fragmente durch sanft pipetting das Fragment Suspension auf und ab zu 10x mit einem P1000 Pipette. </li><li> Von dem Schlauch mit der Gewebefragmente in einem 37 ° C Wasserbad für 2 Minuten. </li><li> Pipettieren Sie die Lösung erneut 10x und sicherzustellen, dass Fragmente gespalten (die Suspension ist trüb). </li><li> Inaktivierung des Trypsins durch Zugabe von 5 ml des vorgewärmten DMEM + 10% FCS. </li><li> Zentrifugieren der Zellsuspension bei 433 × g für 5 min. </li><li> In der Zwischenzeit Aliquot die erforderliche Menge an siRNA / DNA in Eppendorf-Röhrchen (gewöhnlich 3-5 ug DNA / shRNA oder 5-9 ug pro siRNA-Oligo Nukleofektion jedoch die Menge des DNA / siRNA Optimierung erfordern kann). </li><li> Überschüssiges Medium und Zellpellet durch vorsichtiges Pipettieren in 5 ml vorgewärmten DMEM + 10% FCS. </li><li> Führen Sie eine Zellzahl. Erwarten ~ 1 x 10 6 Zellen pro Ratte Welpen Gehirn. Für jede Nukleofektion sind mindestens 2,5 x 10 6 Zellen benötigt, währendoptimale Ergebnisse werden mit 3-4 x 10 6 Zellen pro Nukleofektion erreicht. </li><li> Zentrifugieren der Zellsuspension bei 433 × g für 5 min. Stellen Sie sicher, dass Sie so viel wie möglich zu entfernen Medium. </li></ol></li></ol> 2. Nucleofection <ol><li> Unmittelbar Zellpellet in Ratte (oder Maus, wenn mit Maus-Zellen), die zuvor bei Raumtemperatur inkubiert Neuron Nukleofektion Lösung. Verwenden Sie 100 ul pro Nukleofektion. Hinweis: in der Regel eine Ratte Wurf von 12 Welpen ist ausreichend, um 4 nucleofections durchführen und eine Maus Wurf (12 Welpen) ist ausreichend, um 2 nucleofections durchzuführen. </li><li> Überweisung 100 ul der Zellsuspension in jede Eppendorf Röhrchen mit siRNA / DNA und vorsichtig mischen 2-3x durch Pipettieren mit einem P200 Pipette. </li><li> Hinzufügen der Probe (cell-DNA/siRNA Suspension) an der Unterseite des nucleofectioncuvette, kümmert sich um Blasen zu vermeiden. </li><li> Nucleofect mit dem Programm G-013 (für Ratten-Zellen) oder O-005 (fürMauszellen). Eine Nukleofektion dauert ca. 5 sek. </li><li> Schnelles Hinzufügen von 1 ml vorgewärmten DMEM + 10% FCS auf die nucleofected Probe. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.4 und 2.5 für alle anderen Proben. Hinweis: Für optimale Ergebnisse sollte die gesamte Prozedur Nukleofektion nicht länger als 5 min. </li><li> Übertragen jeder Probe in ein 15 ml Röhrchen mit 5 ml vorgewärmtem DMEM + 10% FCS mit der Kunststoffpipette vom Nukleofektion Kit bereitgestellt. Vermeiden Sie jede Übertragung von Zelltrümmern in die Röhre. </li><li> Zentrifuge Proben bei 433 × g für 5 min. </li><li> Überschüssige Medium vorsichtig entfernen und das Pellet in 25-30 ul vorgewärmtes DMEM + 10% FCS mit einem P20 Pipette. Verwenden Sie nicht mehr als 30 ul Medium. </li><li> Pipettieren die Suspension als ein Tropfen auf die Innenseite eines p35 Schalendeckel. </li><li> Kehren Sie die Deckel über den p35 Schale mit 2 ml Vollmedium (siehe auch Abbildung 1). </li><li> Lassen im Inkubator (37 ° C / 5% CO 2) fürmindestens 5 Stunden und bis zu 7 Stunden. Längere Inkubationszeit erlaubt eine bessere Reaggregation von Zellclustern. </li><li> Übertragen Sie die hängenden Tropfen aus dem Deckel in das Komplettmedium in die Schüssel mit einem P1000 Pipettenspitze mit einem Schnitt. </li><li> Bei 37 ° C / 5% CO 2 für 24 h für DNA nucleofections und 48 h für siRNA / shRNA nucleofections. </li></ol> 3. Verankerung <ol><li> Vorbereitung Komplettmedium (25 ml) und preequilibrate es bei 37 ° C / 5% CO 2 für ein paar Stunden. </li><li> Nehmen Sie die gefrorenen Aliquots von Basalmembranmatrix von -80 ° C Gefrierschrank und tauen auf Eis im Kühlraum. </li><li> Für jede Nukleofektion bereiten ein 6-cm-Schale, die bis zu acht 13 mm steril coverlips. </li><li> Die Schalen werden auf einem Eis-Box mit Klarsichtfolie abgedeckt. Es ist wichtig, die Deckgläser kühl zu halten, um Matrix Verfestigung während des Einbettungsverfahren zu verhindern. </li><li> Um Feuchtigkeit zu erhalten, legen Sie einen Streifen von feuchten Gewebe innerhalb einer 15 cm Schüssel, dass wkrank verwendet, um auf drei 6-cm-Schalen, die die eingebetteten Neuroblasten halten werden. </li><li> Hinzufügen Komplettmedium zu der aufgetauten Matrix in einem Verhältnis von 1:3. Zum Beispiel mischen 40 ul Vollmedium mit 120 ul der Matrix durch Pipettieren. Diese Menge ist ausreichend Matrix zur Einbettung Aggregate auf acht 12 mm Deckgläsern. </li><li> Übertragen Sie die neu zusammengefügt Zellhaufen zu einem 15-ml-Tube und Zentrifuge bei 433 × g für 5 min. </li><li> Überschüssiges Medium und das Pellet in 10 ul Vollmedium. </li><li> Platz 2 ul Zellsuspension auf jedes Aggregat sterilen Deckglas und fügen Sie 18 ul der Matrix / Komplett-Medium-Mischung. Verwenden Sie die Pipettenspitze, um die Matrix über den gesamten Deck verbreiten. </li><li> Sofort legen Sie die 6-cm-Schale, die die Deckgläser in der 15-cm-Schale und lassen in den Inkubator (37 ° C / 5% CO 2) für 15-20 min. Wenn die Matrix verfestigt hat, vorsichtig mit 5 ml Vollmedium zu jedem 6 cm Schale wobei darauf zu schiebenunten eine schwimmende Deckglas mit einer Pipettenspitze. </li><li> Inkubation für 24 Stunden bei 37 ° C / 5% CO 2 Neuroblasten Migration aus der Zellaggregate zu lassen. </li></ol> 4. 3D-Migration-Assay <ol><li> Bereiten Sie die für die Immunfärbung erforderlichen Lösungen. <ol><li> Bereiten Sie die Block-Lösung: Ziege Blocklösung (50 ml) Phosphat-gepufferte Saline (PBS) - 5 ml Goat Serum - 7,5 ml 10% Triton X-100 - 1,5 ml BSA - 50 mg H 2 O - 36 ml </li><li> Filter und bei 4 ° C </li><li> Bereiten Sie die Befestigungslösung: Fixier-Lösung (100 ml) Paraformaldehyd (PFA) - 4 g ACHTUNG: immer PFA Griff unter einer Haube Saccharose - 20 g (optional) PBS auf 100 ml </li><li> Auf einer Heizplatte unter konstantem Rühren auflösen PFA in 80 ml PBS bei 65 ° C gehalten wird </li><li> Sobald das PFA gelöst, mit 20 g Saccharose. </li><li> PH-Wert auf7,4 (gewöhnlich durch Zugabe ~ 60 &amp;mgr; l 1M NaOH pro 100 ml Lösung). </li><li> Bringen bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ml mit PBS. </li></ol></li><li> Immunfärbung <ol><li> Zeigen Deckgläser in einer 24-Well-Platte. </li><li> Spülen Deckgläser mit PBS 2x. </li><li> Befestigen Sie die RMS Neuroblast Aggregate mit Befestigungslösung für 45 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen Deckgläser mit PBS 3x (5 min / Waschgang - auf einem Schaukel Plattform). </li><li> Blockieren Sie für 30-60 min mit Ziegenblocklösung. </li><li> Verdünnen Primärantikörper in Ziegen Block-Lösung und Inkubation über Nacht bei 4 ° C (Falls gewünscht, fluoreszierende Phalloidin (1:400) und Hoechst Farbstoff (1:10.000) kann auch auf die Primärantikörperlösung hinzugefügt und filamentöses Aktin Kerne sichtbar wird). </li><li> Spülen Deckgläser mit PBS 3x (5 min / Waschgang). </li><li> Verdünnen Sekundärantikörper Ziege in Block-Lösung und Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen coverslips 3x mit PBS (5 min / Waschgang) </li><li> Berg Deckgläser mit fluoreszierenden Montagemedium und lassen über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. </li></ol></li><li> Migration Analysis <ol><li> Machen Sie Bilder von Fest RMS Neuroblast Aggregate mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einer 10X-Objektiv. Fügen Sie eine Maßstabsleiste in einem Beispielbild. </li><li> Um den Maßstab für die Quantifizierung, messen Sie den Maßstab in dem Bild, indem Sie die &quot;Gerade&quot;-Tool auf der ImageJ Werkzeugleiste. </li><li> Wählen Sie die Option &quot;Analysieren&quot; und klicken Sie auf &#39;gesetzt der Skala &quot;. </li><li> In der Skala Fenster stellen Sie die &quot;bekannte Strecke&quot; und aktivieren Sie die &quot;globale&quot;-Box die gleichen Einstellungen für alle Messungen zu halten. </li><li> Verwenden Sie die &#39;Segmentlinie &quot;-Tool auf der ImageJ Werkzeugleiste, um den Abstand von der Kante des Aggregats an den weitesten migriert Neuroblast in 6 verschiedenen Bereichen rund um die gesamte Aggregat (3B) zu messen. Betrachten Sie nur isoliert agAggregate für die Analyse. </li><li> Berechnen einer durchschnittlichen Laufstrecke von den 6-Werte für jedes Aggregat erhalten. </li><li> Messen 10-20 Aggregate für jede Bedingung in jedem unabhängigen Versuch und Pool Ergebnisse aus mindestens drei unabhängigen Experimenten. Immer auch eine Nukleofektion Kontrolle (zB. GFP oder ein Steuer sh / siRNA). </li></ol></li></ol>

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A., Bordey, A., lique, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Subventricular+Zone+Electroporation.">Neonatal Subventricular Zone Electroporation.</a> J. Vis. Exp. , e50197 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Migration der Neuroblasten entlang der RMS an den endgültigen Standort im OB ist ein grundlegender Schritt in der postnatalen Neurogenese. Allerdings sind die molekularen Mechanismen, die diesen komplexen Prozess bei weitem noch nicht vollständig verstanden. Die hier beschriebene experimentelle Verfahren ermöglicht die Untersuchung von Neuroblast Migration in vitro. Wir haben eine bisher veröffentlichten Protokoll zur Isolierung von RMS Neuroblasten aus der frühen postnatalen Maus oder Ratte 25 angepasst. Um optimale Ergebnisse zu erreichen, ist es wichtig, die Dissektionsschritt meistern, da es entscheidend ist, um das Zeitintervall zwischen Dissektion und Nukleofektion auf einem Minimum zu halten. Nach Nukleofektion können Neuroblasten neu zusammengefügt werden, in einer dreidimensionalen Matrix eingebettet und links über einen Zeitraum von 24 Std. zu migrieren. Alternativ kann für andere als die Migration (z. B. Immunfluoreszenz oder Western-Blot-Analyse) Zwecken Zellen kann unmittelbar nach Nukleofektion auf polyornithine/laminin- plattiert werdenbeschichtete Deckgläser, wo sie bis zu 4-5 Tage überleben. Maus und Ratte Neuroblasten wandern in Matrigel in einem ähnlichen Ausmaß, aber Maus-Zellen scheinen eine stärkere Tendenz, in Ketten als Rattenzellen migrieren. Je nach Ziel der Studie, können Neuroblasten mit verschiedenen Plasmiden fluoreszierende Proteine ​​oder Wildtyp / Mutante Proteine ​​von Interesse kodiert nucleofected werden. Für eine optimale Protein-Expressionsplasmide mit einer CAG-Promotors (β-Actin-Promotor CMV-Enhancer und β-Globin-Poly-A-Schwanz) 26 werden empfohlen. Darüber hinaus kann siRNA Oligos oder shRNA Plasmide nucleofected werden, um Ziele von Interesse Knockdown. Effektive Proteinabbau kann durch Immunfluoreszenz oder durch Western-Blot (in der Regel Lyse eingebettet Aggregate von 1 Jungtier mit 50 ul Standard Lyse-Puffer) visualisiert werden. Nucleofection ist eine relativ einfache Methode zur primären Neuroblasten Transfektion bietet eine einfachere und schnellere Alternative zu viral-Vektor-vermittelte Transfektion und kann hoch (~ 70-80%) Transfektion Effizienz zu erreichen. Es ist wichtig, während der Nukleofektion Verfahren schnell zu arbeiten, seit er in der Neuroblasten Nukleofektion Lösung für eine längere Zeit die Lebensfähigkeit der Zellen drastisch reduziert. Die durchschnittliche Zellausbeute von RMS Dissektion ist relativ gering für P7-Mäuse (~ 5 × 10 5 Zellen / Gehirn) im Vergleich zu Ratten, P7 (~ 1 × 10 6 Zellen / Gehirn) und mindestens 3 x 10 6 Zellen pro Nukleofektion erforderlichen der Transfektion mit ~ 50% Wirkungsgrad zu erreichen. Darüber hinaus erscheinen Ratte Neuroblasten besser zu widerstehen, um Nukleofektion Vergleich zu Maus Neuroblasten. Daher könnte der frühen postnatalen (P6-P7) Rattenjungen eine bequeme Neuroblast Quelle darstellen, auch unter Berücksichtigung, dass die Organisation von Ratte und Maus RMS sind bemerkenswert ähnLAR 27 und dass das Ausmaß der Ratte und der Maus Neuroblastenmigration in vitro ist ebenfalls vergleichbar. Es ist ratsam, nicht die neu zusammengefügt Cluster von nucleofected Neuroblasten in Suspension für länger als 48 Stunden zu halten, um abnormale Effekte auf die Zellmorphologie und Migration (unsere unveröffentlichte Beobachtungen) zu vermeiden. Die hier beschriebene 3D-Assay kann verwendet werden, um Neuroblastenmigration zu einem festen Zeitpunkt zu quantifizieren nach Einbetten in der Matrix (zB. 24 h) werden. Aggregate unterschiedlicher Größe in der Analyse verwendet werden, da es keine signifikante Korrelation zwischen der Größe der Aggregate und Migrationsdistanz (unsere unveröffentlichte Beobachtungen). Um sichtbar zu machen und weiter zu untersuchen, die Dynamik der Neuroblast Migration können Zeitraffer-Bildgebung verwendet werden. Es wird empfohlen, für die Durchführung der Analyse der Migration innerhalb einer 24-Stunden-Intervall nach der Einbettung, da die Geschwindigkeit der Neuroblasten scheint in längeren Zeitpunkte drastisch verringern (unsere unveröffentlichte Beobachtungen). &lt;/ P&gt; Es gibt einige Einschränkungen auf diesem Protokoll. Erstens kann bislang für Nukleofektion frühen postnatalen Nagetier Neuroblasten verwendet werden, während eine Infektion mit viralen Vektoren bleibt die effizienteste Transfektionsverfahren für erwachsene Neuroblasten 28. Zweitens ist die in vitro-Migrationstest nicht vollständig die komplexe Architektur der in vivo beobachteten RMS reproduzieren. Tatsächlich, obwohl Neuroblasten Aufrechterhaltung der Fähigkeit, in einer ähnlichen Art und Weise, um ihre in vivo-Gegenstücke zu migrieren, in dem hier beschriebenen sie keine Wechselwirkung mit anderen Komponenten wie z. B. RMS Astrozyten und Blutgefäße, die auch dazu beitragen, ihre Beweglichkeit 9,29 regulieren Versuchsaufbau 30. Dieses Problem kann in Zukunft durch die Optimierung von dreidimensionalen Co-Kultur-Modell-Systeme angesprochen werden. Abschließend Nukleofektion Kombination mit einem 3D-Migrationsassay stellt ein wertvolles Werkzeug, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen besser zu verstehen,Neuroblast Migration. Das experimentelle Verfahren gibt einen ersten, schnellen und relativ einfache Methode, um die Rolle der Regulatoren der Neuroblast Kandidat Migration, die durch andere Ansätze, wie in vivo Elektroporation und postnatale Zeitraffer-Bildgebung von Hirnschnittkulturen validiert werden können beurteilen 28,31,32 .

Im postnatalen Gehirn von Säugetieren, Neubildung von Nervenzellen (Neurogenese) über die gesamte Lebensdauer und ist mit zwei neurogenen Nischen beschränkt: die Subventrikularzone (SVZ) der Seitenventrikel und der Subgranularzone des Gyrus dentatus des Hippocampus 1. Mehrere neuere Studien haben die wichtige Rolle der adulten Neurogenese bei der Erleichterung der Lern-und Gedächtnisaufgaben 2,3 gezeigt. Darüber hinaus Nachweis der Proliferation und Rekrutierung von neuralen Vorläuferzellen nach Hirnverletzung 7.4 erhöht die Möglichkeit der pharmakologischen Aktivierung der Neurogenese im neuronalen Reparatur. Postnatale Neurogenese ist streng in all seinen Phasen, die neuralen Vorläufer Proliferation, Migration, Differenzierung, Überleben und letzte synaptischen Integration neu geboren Neuronen 8 sind geregelt. Neuronale Vorläuferzellen (Neuroblasten) aus Stammzellen in der SVZ abgeleitet wandern über eine große Strecke durch den rostralen MigrationsStrom (RMS) in Richtung der Riechkolben (OB), wo sie in funktionelle Neuronen 9 reifen. Wandernden Neuroblasten sind überwiegend unipolar, mit einem länglichen Zellkörper, der sich eine einzige führende Prozess. Diese Zellen bewegen sich in Ketten auf kollektive Weise, übereinander zu gleiten 10. Migration ist ein entscheidender Schritt für die anschließende Reifung SVZ abgeleiteten Vorläuferzellen zu funktionellen Neuronen 11 und wird von mehreren Faktoren und Führung Moleküle einschließlich gesteuert: polysialyliert neurale Zelladhäsionsmolekül (PSA-NCAM) 12. Ephrine 13, Integrine 14, Schlitze 15, Wachstumsfaktoren und Neurotransmitter 16 17, jedoch sind die molekularen Mechanismen, die diesem Verfahren unterliegen nicht vollständig verstanden. Untersuchung der intrazelluläre Signalwege regulieren Neuroblast Migration wird nicht nur ein besseres Verständnis der adulten Neurogenese, sondern auch für die Entwicklung von neuen therapeutischen beitragenAnsätze zur Heilung des Gehirns zu fördern. Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll, um die Rolle des Kandidaten Regulatoren der Neuroblast Migration in vitro Studie mit Nukleofektion und eine 3D-Migration-Assay. Nukleofektion eine Zelle Transfektion Technik, die auf ein verbessertes Verfahren zur Elektroporation. Zelltyp-spezifische elektrische Strom und Nukleofektion Lösung ermöglicht die Übertragung von polyanionischen Makromoleküle, wie DNA und shRNA Vektoren und siRNA Oligonukleotide direkt in den Zellkern und erlauben Transfektion langsam teil oder mitotisch inaktiven Zellen, wie embryonalen Säugetierneuronen und 18. Diese Methode ist schnell, relativ einfach durchzuführen und die Ergebnisse in hohem Maße reproduzierbar Transfektion von einem breiten Spektrum von Zelltypen, einschließlich der primären Neuroblasten und Neuronen 19-21. Die Dissoziation von RMS Gewebe ermöglicht die Isolierung der wandernden Neuroblasten, die erfolgreich mit DNA / SHR nucleofected werden könnenNA Vektoren oder siRNA Oligos gezielt Gene von Interesse. Nach Nukleofektion, Neuroblasten werden in hängenden Tropfen neu zusammengefügt und anschließend in einem dreidimensionalen Matrigel-Matrix eingebettet sind. Diese Bedingungen ermöglichen Neuroblasten aus der Zellaggregate rekapituliert die in vivo beobachtete Migrationsmodus zu migrieren, wodurch ein ausgezeichnetes Modellsystem für die Signalwege in Neuroblastenmigration beteiligt zu untersuchen und um den Einfluss von pharmakologischen Behandlungen auf die Motilität der Zellen beurteilen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1639">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td style="width:255px;">14175129</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">HEPES</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">2.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td style="width:339px;">Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>store 200 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">DNAse I Vial (D2)</td>
			<td style="width:339px;">Worthington</td>
			<td style="width:255px;">LK003170</td>
			<td>&#8805;1,000 units per vial; store 50 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Dulbecco Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:339px;">Gibco</td>
			<td style="width:255px;">11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:339px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SH3007902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:339px;">Gibco</td>
			<td style="width:255px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">D-(+)-Glucose solution (45%)</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-free, 10 ml, LDEV-Free</td>
			<td style="width:339px;">BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td>prepare 120 &#181;l aliquots at 4 &#176;C, then store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">PFA</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">441242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Sucrose</td>
			<td style="width:339px;">BDH</td>
			<td style="width:255px;">102745C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Goat serum</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">69023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:339px;">VWR International Ltd.</td>
			<td style="width:255px;">306324N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">BSA</td>
			<td style="width:339px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:255px;">BPE9701-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Dako fluorescence mounting medium</td>
			<td style="width:339px;">Dako</td>
			<td style="width:255px;">S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Rat neuron nucleofection kit</td>
			<td style="width:339px;">Lonza</td>
			<td style="width:255px;">VPG-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Mouse neuron nucleofection kit</td>
			<td style="width:339px;">Lonza</td>
			<td style="width:255px;">VPG-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Microsurgical knife</td>
			<td style="width:339px;">Angiotech</td>
			<td style="width:255px;">7516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:339px;">The Mickle Laboratory Engineering Company</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Nucleofector II</td>
			<td style="width:339px;">Lonza</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nucleofection of rodent neuroblasts to study neuroblast migration in vitro

Die Subventrikularzone (SVZ) in der Seitenwand der lateralen Ventrikel befindet spielt eine fundamentale Rolle in der adulten Neurogenese. In diesem geschützten Bereich des Gehirns, der neuralen Stammzellen vermehren und ständig zu erzeugen Neuroblasten, die tangential in Ketten entlang der rostralen Migrationsstrom (RMS) zu migrieren, um den olfaktorischen Bulbus (OB) zu erreichen. Einmal in der OB, Neuroblasten zu wechseln, um die radiale Migration und dann in ausgereiften Nervenzellen in der Lage, in die bereits bestehende neuronale Netzwerk integrieren zu unterscheiden. Proper Neuroblast Migration ist ein grundlegender Schritt in der Neurogenese, der die korrekte funktionelle Reifung von neugeborenen Neuronen. Angesichts der Fähigkeit der SVZ-derived Neuroblasten, verletzte Bereiche im Gehirn Ziel, die Untersuchung der intrazellulären Mechanismen zugrunde liegen ihre Beweglichkeit verbessern nicht nur das Verständnis der Neurogenese, sondern kann auch die Entwicklung von neuroregenerativen Strategien zu fördern. Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertesProtokoll für die Transfektion von primären Nagetier RMS postnatalen Neuroblasten und der Analyse ihrer Motilität mit Hilfe eines 3D-Migrationsassay in vitro rekapituliert ihre Art der Migration in vivo beobachtet. Beide Ratte und Maus Neuroblasten können schnell und effizient transfiziert über Nukleofektion entweder mit Plasmid-DNA, kleine Haarnadel (sh) RNA oder short interfering (si) RNA-Oligos gezielt Gene von Interesse sein. Um die Migration zu analysieren, werden nucleofected Zellen in &quot;hängenden Tropfen&quot; neu zusammengefügt und anschließend in einer dreidimensionalen Matrix eingebettet. Nucleofection per se nicht die Migration der Neuroblasten nicht wesentlich beeinträchtigen. Pharmakologische Behandlung von nucleofected und neu zusammengefügt Neuroblasten kann auch durchgeführt werden, um die Rolle von Signalwegen in Neuroblast Migration beteiligt studieren.

Neuroblasten erfolgreich aus Gewebe seziert RMS (Fig. 1A) isoliert und in einer dreidimensionalen Matrix eingebettet werden. Zellen aus Ratte oder Maus entweder postnatale RMS isoliert sind für wandernde Neuroblast Marker, wie Double (DCX), βIII Tubulin-oder PSA-NCAM (1B-C) immun. Dissoziierten Neuroblasten effizient mit DNA nucleofected (zB. Ein GFP-codierenden Plasmid, Fig. 2) oder shRNA Plasmide (Fig. 4), um Proteinabbau zu erreichen, was durch Western-Blot-Analyse bestimmt werden kann (Fig. 4B) oder Immunfluoreszenz (nicht gezeigt) . Zellen, die mit GFP-kodierenden Plasmide nucleofected radial wandern aus neu zusammengefügt Neuroblast-Cluster (Abbildung 3A). Quantifizierung der relativen Abstand migrierten 24 Stunden nach der Einbettung (3B) zeigt keinen Unterschied in der Migration zwischen GFP-Setzung<html> ive Zellen und GFP-negativen, nonnucleofected Zellen (3C), die anzeigt, dass Nukleofektion an sich nicht stören Migration. Es gibt auch keinen signifikanten Unterschied in dem Ausmaß der Migration zwischen nucleofected Neuroblasten und Neuroblasten direkt aus der RMS-Explantaten (Daten nicht gezeigt) migrieren. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig1.jpg" width="500px" /> Fig. 1 ist. Dissektion der RMS Neuroblasten. (A) Schematische Darstellung der RMS Neuroblast Dissektion. Eine detaillierte Beschreibung finden Sie im Text beziehen. (B) Isolierte Ratten RMS-Zellen sind immun für die wandernden Neuroblast Trägern DCX und βlll Tubulin. Bar, 20 um. (C) Zellen Migration von Maus RMS Explantate drücken die Migrationsneuroblast Marker DCX und PSA-NCAM. Bar, 20 um.0989/50989fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig2.jpg" width="500px" /> 2. Maus Neuroblast Nukleofektion. Dissoziierte Maus RMS Neuroblasten wurden mit pMAX-GFP nucleofected, neu zusammengefügt, in eine dreidimensionale Matrix eingebettet und für 6 Stunden wandern. Neuroblasten Migration aus einem neu zusammengefügt Zellcluster (oben, Phasenkontrast-Bilder) zeigen hohe Transfektionseffizienz (unten, GFP-Kanal-Bilder). Die rechte Spalte Tafeln zeigen höhere Vergrößerung Bilder entsprechend den Einsätzen in der linken Spalte Tafeln hervorgehoben. Bars, 20 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 3" fo:c<html> NHALT-width = &quot;6in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50989/50989fig3.jpg&quot; width = &quot;500px&quot; /&gt; 3. 3D-Migration-Assay. (A) wurden mit Ratten-Neuroblasten pMAX-GFP (GFP) oder pCAG-IRES-EGFP 22 (EV), neu zusammengefügt, in der Matrix eingebettet und dann für 24 Stunden wandern nucleofected. Zellen wurden dann fixiert und für GFP (grün) und βIII-Tubulin (rot) immungefärbt. Bar, 50 um. (B) Messwanderungsstrecke mit ImageJ. Die neu zusammengefügt Zellcluster ist in 6 gleiche Sektoren unterteilt. Der Abstand zwischen der Kante des Clusters (gestrichelte Linie) und dem am weitesten migriert Zelle für jeden Sektor gemessen. (C) Quantifizierung der relativen Abstand von nucleofected Zellen migrierten (GFP-positiv) und Steuerung, nonnucleofected Zellen (GFP-negative) . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="&lt;/ Html">&quot;Figure 4&quot; fo: content-width = &quot;6in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50989/50989fig4.jpg&quot; width = &quot;500px&quot; /&gt; 4. Überwachung Neuroblast Migration nach shRNA Nukleofektion. (A) Neuroblasten Ratte wurden mit einer Kontroll shRNA Vektor (PCA-b-EGFPm5 Schalldämpfer 3, die ebenfalls exprimiert EGFP 23) oder der gleiche Vektor eine shRNA Targeting fascin, eine Actin-Bündelung Protein 24 enthält nucleofected. Zellen wurden über 48 h neu zusammengefügt, in der Matrix eingebettet und dann für 24 Stunden zu migrieren. Aggregate wurden dann fixiert und für GFP (grün) und βIII Tubulin (rot) immungefärbt. Bar, 50 um. (B) Effektive Fascin Erschöpfung kann 50 Stunden nach shRNA Nukleofektion durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen werden. Aktin ist hier als Ladekontrolle Quantitative Analyse der relativen Wanderungsstrecke zeigt, dass Fascin Erschöpfung Neuroblast Migration erheblich beeinträchtigt (C) gezeigt. (; ** P &lt;0,01; Mittelwert ± SEM n = 3 unabhängigen Experimenten). <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig4highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

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Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast Migration ist ein entscheidender Schritt in der postnatalen Neurogenese. Das hier beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um die Rolle der Regulatoren der Neuroblast Kandidat Migration durch den Einsatz von DNA / kleine Haarnadel-RNA (shRNA) Nukleofektion und eine 3D-Migrationsassay mit Neuroblasten aus dem Nagetier postnatale rostralen Migrationsstrom getrennt zu untersuchen.

Nucleofection von Nagerneuroblasten zu Neuroblast Migrationsstudie<em&gt; In-vitro-</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

nucleofection-rodent-neuroblasts-to-study-neuroblast-migration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

11.3K Aufrufe.  King's College London.  Neuroblast Migration ist ein entscheidender Schritt in der postnatalen Neurogenese. Das hier beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um die Rolle der Regulatoren der Neuroblast Kandidat Migration durch den Einsatz von DNA / kleine Haarnadel-RNA (shRNA) Nukleofektion und eine 3D-Migrationsassay mit Neuroblasten aus dem Nagetier postnatale rostralen Migrationsstrom getrennt zu untersuchen. 

Serie: Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Organotypischen Kulturen von embryonalen ventralen Mittelhirn: Ein System zur Dopaminerge Neuronale Development Study In-vitro-</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration in Acute Scheiben von der adulten Maus Vorderhirnneuronen

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Direkt Intraventrikuläre Abgabe von Arzneimitteln an die Nager Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In-vivo-Elektroporation und Postnatale Zeitraffer-Imaging Neuroblast von Migration in Maus Akute Hirnschnitten

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Visualisierung Neuroblast Cytokinesis Während<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenese

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

Maus-Hinterhirn<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur zu Gesichts Branchiomotor Neuron Migrationsstudie

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuroblasten

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...