Zuschüsse: NIH CA165263, CA150197 NIH, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), NSF PHY-0120999 Zentrum für Biophotonik Science &amp; Technology (DL Wolfson, FYS Chuang), DOD PC073420 (RJ Bold), das Forschungszentrum Council of Norway, Leiv Eiriksson Reisestipendium 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ Kung erkennt auch die Unterstützung der Gemeinschaft Auburn Cancer Endowment Fund. RJ Bold erkennt auch die Unterstützung der J. McDonald Stiftung. Wir danken Dr. Jenny Wei-Jen Kung und Dr. Bor-wen Wu bei DesigneRx für die großzügige Bereitstellung von ADI.

1. Teil 1: Zellkultur und Immuno-Fluoreszenz-Labeling <ol><li> Wachsen CWR22 Rv1 menschlichen Prostata-Tumorzellen auf Deckgläschen (# 1.5 bzw. 170 um Dicke) in 6-well Platten mit RPMI (Mediatech, VA) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin / Glutamin. </li><li> Induce Autophagie durch Behandlung mit ausgewählten Proben Arginindeiminase (ADI, 0,3 ug / ml) in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS). </li><li> Fix-Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA, Fisher Scientific, NH) in PBS verdünnt; 100 ul pro Deckglas für 10 min bei RT. </li><li> Waschen der Zellen 3x mit 1 ml HBS / BSA. </li><li> Durchdringbar Zellen mit 0,05% Saponin (Sigma, MO) in HEPES (HBS) / BSA, 100 ul pro Deckglas 15 min bei RT. </li><li> Vor der Immuno-Kennzeichnung, Block Proben mit 2,5% Casein (Sigma, MO) in HBS / BSA, 100 ul pro Deckglas für 1 h bei RT. </li><li> Inkubieren fixierten Zellen mit primären Antikörpern in 2,5% Casein / HBS / BSA, 100 ul pro coversl verdünntip, O / N bei 4 ° C. </li><li> Waschen der Zellen 3x mit 1 ml HBS / BSA. </li><li> Inkubieren fixierten Zellen mit sekundären Antikörpern in 2,5% Kasein / HBS / BSA, 100 ul pro Deckglas verdünnt, 1 h bei RT. </li><li> Waschen der Zellen 3x mit 1 ml HBS / BSA. </li><li> Montieren vorbereiteten Deckgläser auf reguläre Glas Objektträger mit SlowFade Gold-oder Gold-Verlängern antifade Reagenz (Invitrogen, CA) mit 4 &#39;,6-Diamino-2-phenylindol (DAPI). </li><li> Seal Deckglas Kanten mit Nagellack. Für beste Bildergebnisse, damit sie rechtzeitig (idealerweise O / N) für anti-fade Medien gründlich durchdringen Zellen. </li><li> Saubere Deckglas mit Methanol und / oder Chloroform. </li><li> In Immersionsöl (Brechungsindex 1,520 bei der Bildgebung bei 37 ° C oder 1,516 bei der Bildgebung bei RT) an die 60X 1,42 NA Objektiv (Olympus, Japan). </li><li> Position gleiten auf der Bühne und schaffen Mikroskop Fokus mit den Zellen von Interesse. </li></ol> 2. Teil 2: Herstellung von Zellen, für Live-Imaging <ol><li> Wachsen CWR22 Rv1 Zellen, die grün fluoreszierendes Protein-gekoppelten Light Chain 3 (LC3-GFP) in RPMI Kulturmedium, enthaltend 10% FBS und 1% Antibiotika auf 35 mm Poly-D-Lysin beschichteten Glasboden Kulturschalen (MatTek, MA). Die Zellen sollten in ausreichender Dichte beschichtet werden, um eine schnelle Verbreitung zu erleichtern, aber nicht so viel, dass die Zellen überwachsen und verklumpt durch die Zeit der Bildgebung sind. </li><li> Gönnen ausgewählt Zellproben mit ADI (0,3 ug / ml) in PBS. </li><li> Etwa 1 Stunde vor der Bildgebung, verdünnte 1,5 ul LysoTracker Red DND-99 (Invitrogen, CA) mit 20 ml RPMI. enthaltend 10% FBS und 1% Antibiotika. Mit Lösungen, die ADI für ausgewählte Proben. Halte alle Medien auf 37 ° C vor der Zugabe in der Kulturschale. </li><li> Inkubieren Zellen mit RPMI mit LysoTracker Red DND-99 für 15-45 min bei 37 ° C </li><li> Etwa 30 min vor der Bildgebung auf der WeatherStation Schutzgehäuse drehen und ermöglichen bis 37 ° C ins Gleichgewicht und 5% CO 2 (mit Humidified Luft). </li><li> Waschen der Zellen mit PBS gewaschen und ersetzen Medien mit Standard-RPMI mit nur 10% FBS und 1% Antibiotika. In ADI um Proben wie angegeben. </li><li> Berg 35 mm Deckglas-bottom Kulturschalen in kundenspezifische Adapter (Applied Precision, Inc., WA), und die Position auf dem Mikroskop Bühne. Verwenden Immersionsöl (Brechungsindex 1,520) auf dem 60X 1,42 NA Objektiv, und positionieren Sie den montierten Kulturschale auf der Bühne. </li></ol> 3. Teil 3: Dekonvolution Microscopy and Analysis Das Protokoll in diesem Abschnitt wird vorausgesetzt, die Verwendung des DV DeltaVision Persönliche Entfaltung Mikroskop und zugehörigen SoftWorX Application Suite (Applied Precision, Inc., WA). <ol><li> Schalten Sie Mikroskop-System, einschließlich der Akquisitions-Workstation und Instrument-Controller. Öffnen Resolve3D Anwendung das Mikroskop Bühne und wiederum auf der Xenon-Lichtquelle zu initialisieren. Warten Sie 10 min für Lichtquelle, um sich aufzuwärmen und erreichen einen stabilen Bedingungen. </li><li> HinzufügenTropfen Immersionsöl (Brechungsindex 1,520 für lebende Proben, die bei 37 ° C oder 1,516 für feste Proben bei RT) auf der 60X 1,42 NA Objektiv und Zentrum Gewebeprobe (Deckglas nach unten) über die Objektivlinse. </li><li> Entweder mit Hellfeld-oder Außenbeleuchtung und Grobfokus Einstellknopf langsam erhöhen Objektivlinse bis der Wulst Immersionsöl Kontakt mit dem invertierten Deckglas. (Von diesem Punkt die Zellschicht sollten in den Fokus innerhalb von ein paar Windungen der feinen Schärfe einzustellen Knopf kommen). Bei der Arbeit mit festen Proben auf den Objektträgern, ist es empfehlenswert, Zellen innerhalb oder in der Nähe von Gebieten mit Blasen zu vermeiden. Bei der Anzeige mit Live-Proben auf dem Glasboden-Gericht, zu vermeiden Bewegen der Objektivlinse außerhalb der Grenze des Deckglas. </li><li> Autophagosomen kann durch eGFP-Signal (grün) identifiziert werden. Lysosomen sind von LysoTracker Red (live Probe) oder anti-Lamp1 Fluoreszenz-Antikörper (feste Probe) identifiziert. Zellkerne sind durch DAPI st identifiziertaining (feste Probe). </li><li> Wählen Sie die gewünschte Sichtfeld. Im Idealfall sollten die Zellen gut Fluoreszenzsignal in allen geeigneten Kanäle aufweisen und ausreichend befestigt und auf dem Deckglas Oberfläche, so dass die intrazelluläre Inhalte einfach zu visualisieren sind verteilt. Kleine Änderungen in seitlicher x-, y-und z-Ausrichtung kann durch den Computer unter Verwendung des Acquire3D Schnittstelle gesteuert werden. Setzen Binning 1x1 bis 2x2 oder, je nach gewünschter Sichtfeld (mehr Zellen können in das Feld, wenn Binning auf 2x2 gesetzt ist zu sehen). </li><li> Für ein gegebenes Bild durch den Mittelteil einer Zelle, die Belichtung Parameter (zB% Sendeleistung und Belichtungszeit), so dass die maximale Pixelintensität nicht überschreitet 3000 zählt. Im Allgemeinen sollte% Transmission so niedrig wie möglich eingestellt werden, ohne Erhöhung der entsprechenden Belichtungszeit länger als 1 Sekunde. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Fluoreszenz Farbe abgebildet werden und für jeden einzelnen Bereich der Blick auf die Bilder von höchster Qualität zu erhalten. </li><li> Stellen Sie die upper und unteren Grenzen des Z-Stapel durch Einstellen des Fokus nur geringfügig über die oberen und unteren Ende der Zellprobe sind. Die Gesamtzahl der Bilder in einer bestimmten Z-Stapel wird somit durch diese Grenzwerte und durch den Abstand zwischen den Schichten (: 0,2 um Voreinstellung) bestimmt werden. </li><li> Um Bewegungsartefakte während der Bildaufnahme zu minimieren, empfehlen wir, die Bildaufnahme-Modus auf &quot;Wellenlänge dann z-Stapel&quot; für feste Proben, und &quot;z-Stapel dann Wellenlänge&quot; für Live-Proben. </li><li> Fluoreszenz-Bilder werden mit entfalteten SoftWorX (Applied Precision, WA) und später unter Verwendung Volocity (Improvision, jetzt Perkin Elmer, MA). </li></ol> 4. Teil 4: Super-Auflösung, Structured-Beleuchtung (OMX) Mikroskopie Das Protokoll in diesem Abschnitt gilt für die Nutzung der OMX Structured Illumination Microscope (Applied Precision, WA). <ol><li> Schalten Sie den Netzschalter aus und gewünschte Laser (410 nm, 488 nm und / oder 532 nm). Warten Sie, bis 20 kmn für die Laser thermisch stabilisiert werden. </li><li> In Immersionsöl (Brechungsindex 1,516 für feste Proben bei RT) auf dem 60X 1,42 NA Objektiv. Wenn Blasen in der Öltropfen zu sehen sind, reinigen Sie das Ziel und Öl wieder. </li><li> Zeigen Probenobjektträger auf der Bühne und bei Bedarf lassen Sie 10 min für Zellen auf Deckglas begleichen. </li><li> Initialisieren die Akquisition Programm. Verwenden Fluoreszenzbeleuchtung um den Fokus einzustellen, bis eine scharfe Kontur der Zelle zu sehen. (Es sollte zu allen Zeiten, um die Exposition von Zellen gegenüber Fluoreszenzanregung zu minimieren, bis die tatsächliche Bildaufnahme). </li><li> Eine Spirale Mosaik Scan kann erworben, um größere Bereiche der Probe Vorschau auf Zellen oder Bereiche von Interesse auszuwählen. Es wird empfohlen, kurze Belichtungszeiten (1-10 ms) und niedrigen Anregungsenergie (0,1-1% Transmission) verwenden, während Abtasten der Probe oder der Suche nach Zielen. </li><li> Identifizieren Autophagosomen von GFP-LC3 Fluoreszenz. Identifizieren Lysosomen von Alexa Fluor 555 anti-LAMP(Lysosom-assoziiertes Membranprotein) und Zellkerne mit DAPI (feste Proben). </li><li> Wählen experimentellen Bedingungen einschließlich Anregungswellenlänge Bildbereich (zB 512x512), Stapeldicke, Belichtungszeit und Laserübertragung Prozentsatz. Für Super aufgelöste Bilder, sicherzustellen, dass die strukturierte Beleuchtung Option aktiviert ist. Für Entfaltung Mikroskopie an der OMX, wählen Sie die Option konventioneller Beleuchtung. </li><li> Für die besten Ergebnisse Rekonstruktion Wählen experimentellen Bedingungen, so dass die maximale Intensität Zahl zwischen 10.000 und 15.000 ist während der Aufnahme. Wenn Bleichen ist ein Anliegen, kann Bildgebung bei einer niedrigeren Exposition (zählt zwischen 5.000 und 10.000) verwendet werden. Idealerweise sollte die Zählungen nicht um mehr als den Faktor zwei über die gesamte Erfassung und verringert sich um mehr als einen Faktor von vier zu vermeiden. Falls erforderlich, reduzieren Sie die Stapeldicke eine nachhaltige Intensität Zählung zu gewährleisten. Die Kamera sättigt mit 64.000 zählt, also maximal inIntensität sollte nie mehr als diese. Für eine gute Proben, fanden wir die experimentellen Bedingungen zu 10 sein ~ 50 ms Belichtungszeit mit 1% Laserübertragung. Helle und photostabil Proben, die immer wieder abgebildet werden können, werden bevorzugt. Eine stabile Fleck für Zeitraffer, super aufgelöste Bilder erforderlich. </li><li> Um das Rauschen, ein 95MHz Auslesegeschwindigkeit (Medium Speed ​​Option) und den Erwerb von 2 ms oder mehr reduzieren wird empfohlen. Erhöhte Artefakte werden in der rekonstruierten abgebildeten, wenn die Probe während der Aufnahme bewegt erhalten. Aufgrund dieser Wirkung werden kurze Belichtungszeiten für nicht haftende oder sich schnell bewegende Zellen empfohlen. </li><li> Mehrkanal-Bildgebung kann gleichzeitig oder nacheinander durchgeführt werden. Modus Sequential Renditen weniger Übersprechen und wird daher empfohlen. </li><li> Zur Reduzierung Bleichen, ist es im Allgemeinen dem Bild mit mehr Anregungswellenlängen ersten (532 nm, 488 nm, und 410 nm) empfohlen. Für den experimentellen Ergebnissen in Fig. 3 gezeigt, war das Rückwärtsd (dh 48 nm, 532 nm und 410 nm) auf die Photostabilität von diesem bestimmten Probe. </li><li> Stellen Sie den oberen / unteren Grenze des Z-Stapel durch das Mikroskop zu bewegen, bis die Bühne oben / unten der Zellen ist etwas unscharf. Der gewünschte Abstand zwischen jedem Bild sollte konstant gehalten werden, um bei 0,125 für Super-Resolution Imaging, als Rekonstruktion Software nehmen diesen Wert als Standard. </li><li> Rekonstruieren Bildstapeln mit SoftWorX (Applied Precision, WA) und analysieren mit Volocity 6.0 (Perkin Elmer, MA). </li></ol>

<ol>
	<li>Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+deiminase+as+a+novel+therapy+for+prostate+cancer+induces+autophagy+and+caspase-independent+apoptosis.">Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis.</a> Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).</li><li>Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+growth+inhibition+of+human+tumor+cells+in+culture+by+arginine+deiminase+purified+from+a+culture+medium+of+a+Mycoplasma-infected+cell+line.">Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line.</a> Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).</li><li>Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-tumor+activity+of+arginine+deiminase+from+Mycoplasma+argini+and+its+growth-inhibitory+mechanism.">Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism.</a> Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).</li><li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+by+self-digestion:+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy.">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).</li><li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion.">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li><li>Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).</li><li>Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+macroautophagy+by+mTOR+and+Beclin+1+complexes.">Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes.</a> Biochimie. 90, 313-323 (2008).</li><li>Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BH3-only+proteins+and+BH3mimetics+induce+autophagy+by+competitively+disrupting+the+interaction+between+Beclin+1+and+Bcl-2/Bcl-X(L).">BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L).</a> Autophagy. 3, 374-376 (2007).</li><li>Crighton, D., Wilkinson, S., O'Prey, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRAM,+a+p53-induced+modulator+of+autophagy,+is+critical+for+apoptosis.">DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis.</a> Cell. 126, 121-134 (2008).</li><li>Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+distribution+of+argininosuccinate+synthetase+deficiency+in+human+cancers:+a+method+for+identifying+cancers+sensitive+to+arginine+deprivation.">Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation.</a> Cancer. 100, 826-833 (2004).</li><li>Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host &amp; Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations.">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li><li>York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+live,+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy.">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).</li><li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination.">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Während die direkte Beobachtung von Zellen mit fluoreszierenden Sonden gegen LC3 beschriftet wird weithin als Standard-Methode, um autophagic Antwort 6, quantitative 3D-Bildgebung des gleichen Systems (wie wir getan haben) bietet beispiellose Informationen und Details über den komplexen Prozess der zellulären Autophagie bestätigen akzeptiert . Insbesondere beobachten wir, dass Hunderte (wenn nicht Tausende) von Autophagosomen in lebenden Zellen innerhalb von 80 min Induktion der Autophagie gebildet werden...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine Deiminase (ADI)</td>
			<td>DesigneRx</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5890</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>4042</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa anti-mouse 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21422</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa anti-rabbit 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21244</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Lamp1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>H4A3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Cadherin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#3195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36936</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GC-1.5-1.4-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.1, 22 mm coverslip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#2865-22</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1324G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of autophagy using advanced 3d fluorescence microscopy

Prostatakrebs ist die führende Form von malignen Erkrankungen bei Männern in den USA Während der Operation trägt ein erhebliches Risiko von Impotenz und Inkontinenz, haben traditionelle chemotherapeutische Ansätze weitgehend erfolglos. Hormontherapie ist in einem frühen Stadium wirksam, aber oft nicht mit dem späteren Entwicklung von Hormon-resistentem Tumoren. Wir haben in die Entwicklung von Therapeutika für bestimmte metabolische Mangel von Tumorzellen interessiert. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Prostata-Tumorzellen spezifisch fehlt ein Enzym (Argininosuccinatsynthase oder ASS) für die Synthese der Aminosäure Arginin 1 beteiligt. Dieser Zustand bewirkt, dass die Tumorzellen abhängig zu werden exogenen Arginin, und sie unterziehen metabolischen Stress, wenn der freie Arginin durch Arginindeiminase (ADI) 1,10 aufgebraucht ist. In der Tat haben wir gezeigt, dass die menschliche Prostata-Krebszellen CWR22 Rv1 effektiv durch ADI mit Caspase-unabhängige Apoptose und aggressive autopha getötetgy (oder Makroautophagie) 1,2,3. Autophagie ist ein evolutionär konservierten Prozess, Zellen zu verstoffwechseln unerwünschte Proteine ​​durch lysosomalen Abbau während Ernährungs Hunger 4,5 ermöglicht. Obwohl die wesentlichen Komponenten dieses Weges gut charakterisierten 6,7,8,9 sind, sind viele Aspekte der molekularen Mechanismus noch unklar - insbesondere, was ist die Rolle der Autophagie in den Tod-Reaktion von Prostata-Krebszellen nach Behandlung ADI ? Um diese Frage zu beantworten, benötigten wir ein experimentelles Verfahren, um das Niveau und den Umfang der autophagic Reaktion in Zellen zu messen - und da es keine bekannten molekularen Markern, die genau verfolgen können diesen Prozess sind, entschieden wir uns für ein bildgebendes Ansatz zu entwickeln, mit quantitative 3D Fluoreszenzmikroskopie 11,12. Mit CWR22Rv1 Zellen mit fluoreszierenden Sonden für Autophagosomen und Lysosomen speziell markierten, zeigen wir, dass 3D-Bild Stapel entweder mit wi erworbendefield Entfaltung Mikroskopie (und später, mit Super-Auflösung, strukturierte Illumination Microscopy) eindeutig erfassen die frühen Phasen der Autophagie Induktion. Mit kommerziell verfügbaren digitalen Bildanalyse, können wir leicht zu bekommen statistische Informationen über Autophagosom und Lysosomen Anzahl, Größe, Verteilung und Grad der Kolokalisation von jedem abgebildeten Zelle. Diese Informationen ermöglichen es uns, genau zu verfolgen den Fortschritt der Autophagie in lebenden Zellen und ermöglicht unseren fortgesetzten Untersuchung in die Rolle der Autophagie in Krebs-Chemotherapie.

Die Bildsequenz in 1 gezeigt sind die körperlichen Veränderungen, die in CWR22-Zellen auftreten, während der ersten 80 min der autophagy Induktion. In dieser und anderen Studien (nicht gezeigt) wir konsequent beobachtet: (1) Verschiebung des Kerns vom Zentrum der Zelle, (2) Reduktion der fokalen Adhäsion Punkte, und (3) allgemeine Translokation Autophagosomen und Lysosomen in Richtung der Mitte des Zelle. Darüber hinaus haben wir auch beobachtet einen leichten Anstieg in Kolokalisation (gelb) zwisc...

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Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Autophagie ist ein allgegenwärtiges Prozess, Zellen zu zersetzen und zu recyceln Proteine ​​und Organellen ermöglicht. Wir bieten fortschrittliche Fluoreszenzmikroskopie zu visualisieren und zu quantifizieren, die klein, aber wichtig, körperliche Veränderungen mit der Induktion von Autophagie verbunden sind, einschließlich der Bildung und Verteilung von Autophagosomen und Lysosomen, und deren Verschmelzung zu autolysosomes.

Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

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17.8K Aufrufe.  University of California, Davis. Autophagie ist ein allgegenwärtiges Prozess, Zellen zu zersetzen und zu recyceln Proteine ​​und Organellen ermöglicht. Wir bieten fortschrittliche Fluoreszenzmikroskopie zu visualisieren und zu quantifizieren, die klein, aber wichtig, körperliche Veränderungen mit der Induktion von Autophagie verbunden sind, einschließlich der Bildung und Verteilung von Autophagosomen und Lysosomen, und deren Verschmelzung zu autolysosomes.

Serie: Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualizing Einzelne molekulare Komplexe In Vivo Verwenden der erweiterten Fluoreszenzmikroskopie

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Forschung

Biologie

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

Quantitative Analyse der ungerichtete Migration von Zellen unter Verwendung Zeitraffer-Video-Mikroskopie

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Schnelle Analyse und Exploration von Fluoreszenzmikroskopie Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Die Analyse der Autophagie in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Mithilfe von Starvation Pads in Kombination mit Fluoreszenzmikroskopie

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

Identifikation von Kinesin-1 Cargos Mit Fluoreszenzmikroskopie

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Open Source High Content Analyse Unter Verwendung Automatische Fluorescence Lifetime Imaging Mikroskopie

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to understand where and when transcription is taking place within nuclear space and to visualize the relationship between episomes infected within the same cell's nucleus. Here, both immunofluorescence (IFA) and RNA-FISH have been combinedto identify actively transcribing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) episomes. By staining KSHV latency-associated nuclear antigen (LANA), it is possible to locate where viral episomes exist within the nucleus. In addition, by designing RNA-FISH probes to target the intron region of a viral gene, which is expressed only during productive infection, nascent RNA transcripts can be located. Using this combination of molecular probes, it is possible to visualize the assembly of large viral transcription factories and analyze the spatial regulation of viral gene expression during KSHV reactivation. By including anti-RNA polymerase II antibody staining, one can also visualize the association between RNA polymerase II (RNAPII) aggregation and KSHV transcription during reactivation.

Viral transcriptional factories are discrete structures that are enriched with cellular RNA polymerase II to increase viral gene transcription during reactivation. Here, a method to locate sites of actively transcribing viral chromatin in 3D nuclear space by a combination of immunofluorescence staining and in situ RNA hybridization is described.

Funktionelle Bildgebung der virale Transkription Fabriken mit 3D Fluoreszenz-Mikroskopie

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...