Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus den National Institutes of Health (U54CA143906 zu KGP, OJTM und R01HL101972 zu OJTM) und einem Oregon Medical Research Foundation Frühe klinische Investigator Award (KGP) unterstützt. OJTM ist ein American Heart Association Gegründet Investigator (13EIA12630000). Wir danken Dr. Eric Anderson von dem Ritter Cancer Institute für die Herstellung von Zellproben in dieser Arbeit verwendet.

1. Mikroskop Technische Daten Zur Durchführung Bildgebung in der richtigen Art und Weise das Mikroskop sollte den folgenden Spezifikationen: <ol><li> Besitzen beide Differentialinterferenzkontrast (DIC) und Hellfeld (BF) Kontrast. </li><li> Haben Computer-gesteuerten z-Achsen-Bewegung. </li><li> Haben Sie eine verstellbare Blende, um die Sammellinse numerische Apertur variieren. Eine Öffnung mit einer abgestuften Regel oder elektronische Auslesung erforderlich ist, um den Wert der numerischen Apertur zu kennen. Die numerische Apertur von 0,1 sollte für NIQPM bis 0.9 (oder höher) für HTDIC reichen. </li><li> Das Mikroskop sollte eine Schmalband-Farbfilter müssen für Hellfeld-Bildgebung genutzt werden. Dieser Filter ist erforderlich, um den Brechungsschritt, eine wellenlängenabhängige lung zur Phase der Massendichte für NIQP konvertieren zu beheben. </li></ol> 2. Differentialinterferenzkontrast (DIC) Z-Stapel-Erfassung <ol><li> Öffnen Sie die Slidebook Software einnd erstellen Sie eine neue Folie für die Bildsammlung. </li><li> Dann öffnen Sie den Fokus-Fenster. Unter dem Filter-Set Wählen Sie im Abschnitt DIC. Auf der Registerkarte Bereich unter der Kondensator Abschnitt, stellen Sie die Blende Schieberegler, um die am weitesten rechten Position (in alle Richtungen öffnen). Dies sorgt für hohe numerische Apertur Beleuchtung und verbessert optische Schnitte der Probe. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf die Probe mit Hilfe eines DIC Ziel. Einstellen der Halogenlampenintensität, bis die Probe leicht sichtbar ist. Um sicherzustellen, dass die Kamera nicht gesättigt ist, wählen Sie die Registerkarte Kamera in der Focus-Fenster und überprüfen Sie, dass das Histogramm der Pixelintensitäten innerhalb der Dynamikbereich der Kamera. </li><li> Öffnen Sie die Bildaufnahme-Fenster. In dem Abschnitt Aufnahmetyp, überprüfen Sie die 3D-Box. In der 3D-Capture-Abschnitt, wählen Sie den Bereich um das Zentrum und zurück zu aktuellen Standort </strong&gt; Boxen und geben Sie den Z-Richtung Bereich, die Anzahl der Flugzeuge und Schrittweite. Die Z-Richtung Bereich sollte die gesamte Probe zu integrieren. </li><li> In der Filter-Set Abschnitt der Bild-Capture Fenster die DIC Kästchen und geben Belichtungszeit. In der Bildinformationen Abschnitt, nennen Sie das Bild (optional), und wählen Sie Start, um die Abbildung zu initiieren. </li></ol> 3. Hellfeld (BF) Z-Stapel-Erfassung <ol><li> Sobald das Mikroskop Sammeln der DIC Z-Stapel von der Probe beendet ist, öffnen Sie den Fokus-Fenster und wählen Sie unter dem Filter-Set Abschnitt Öffnen. Stellen Sie die Blende Schieberegler, um die am weitesten links (geschlossen den ganzen Weg) zum niedrigen NA Beleuchtung zu bieten. </li><li> Ändern Sie den Mikroskoplicht-Pfad-Filter auf grün. Stellen Sie die Halogenlampe Intensität, bis die Probe sichtbar ist. Sicherzustellen, dass keine Sättigung der Kamera durch Auswahl der <strong&gt; Kamera-Registerkarte in der Focus-Fenster und überprüfen, ob das Histogramm der Pixelintensitäten innerhalb des angegebenen Bereichs. </li><li> Öffnen Sie die Bildaufnahme-Fenster. Die 3D-Capture-Einstellungen aus der Z-Stapel Erwerb DIC wird angezeigt. </li><li> In der Filter-Set Abschnitt der Bildaufnahme-Fenster, überprüfen Sie die OPEN-Box und geben Belichtungszeit. In der Bildinformationen Abschnitt, nennen Sie das Bild (optional), und wählen Sie Start, um den Z-Stapel-Bildakquisition zu initiieren. </li></ol> 4. Exportieren Z-Stapel-Bilder <ol><li> Öffnen Sie ein Z-Stapel-Aufnahme. Ändern Sie die Ansicht auf 100%. Einstellen des Histogramms der Pixelwerte zwischen 0 angezeigt, und der maximale Pixelwert der Kamera (4.095 für 12-Bit-Kameras, 65.535 für 16 Bit.). </li><li> Wählen Sie Ansicht&gt; Exportieren&gt; TIFF-Serie. Dadurch wird die Z-Stapel als eine Reihe von TIFF exportieren(Eine für jede Z-Ebene). Speichern Sie die TIFF-Serie in einem separaten Ordner mit einem Namen, der einen Unterstrich am Ende (dh &quot;DIC Stapel 1_&quot;) hat. Wiederholen Sie dies mit jedem DIC oder BF Z-Stapel. </li></ol> 5. Volumenmessungen <ol><li> Öffnen Sie die HTDIC MATLAB-Programm mit dem Titel &quot;JoVE_HTDIC_v1.m&quot;. </li><li> Nach § 0 des HTDIC Programm, aktualisieren Sie die Abhängigkeiten Verzeichnis variabel. Kopieren Sie das Verzeichnis mit der hilbert_transform_dic.m und sobel_edge_detect.m Dateien aus dem Explorer (PC) in zwischen den einfachen Anführungszeichen folgenden &quot;dependencies_directory =&quot;. ExecuteSection 0 des JoVE_HTDIC_v1.m Programm. </li><li> In Abschnitt 1, aktualisieren Sie die &quot;images_directory&quot;. Auch Kopieren Sie das Verzeichnis mit den durch-Fokus-Bilder in. Tif Form zwischen den einfachen Anführungszeichen. NUR EINMAL ein Laufabschnitt. </li><li> Ausrichtung und Drehung der Bilder für Hilbert-Transformation Run Abschnitt 2 des Codes. Ein Dialogfeld mit dem Titel &quot;Define HTDIC Parameter&quot; wird angezeigt. Fünf numbeRS sind für den Benutzer erforderlich, die Brennebene Nummer, die DIC-Bild der Probe fokussiert ist, laterale Auflösung (&amp;mgr; m / Pixel im Bild), die axiale Auflösung (das ist 0,1 für die Bildaufnahme in 0,1 um axiale Stufen), der Drehwinkel der DIC-Bild benötigt, um die Hilbert-Transformation durchzuführen, sind 45 und -135 typische Werte. Schließlich geben Sie die Region von Interesse Größe, definiert dieser Parameter die Länge einer Seite der Box, die später erscheinen werden - typischer Wert ist 400. Klicken Sie auf OK. </li><li> Ein Bild von dem von der Brennebene Nummer angegeben DIC Brennebene wird mit einem blauen Feld angezeigt. Positionieren Sie die Box auf das Merkmal von Interesse, z. B. einer Zelle. Die Box muss nicht quadratisch sein. Sobald die Box über den gewünschten Bereich, doppelklicken Sie in der Box positioniert. </li><li> Eine weitere Zahl wird nun angezeigt: Diese Zahl enthält eine beschnittene und gedrehte Bild der Region von Interesse in der vorherigen Schritt ausgewählt. Der Kontrast des Bildes sollte so sein,dass dunkle Funktionen erscheinen auf der linken Seite, während helle Funktionen erscheinen auf der rechten Seite. Ziehen Sie die blaue Box auf dem Gebiet von Interesse, neu zu gestalten wie nötig. </li><li> Abschnitt 3 erzeugt eine Maske für die z-Stapel Würfel. Es gibt zwei Arten von Masken zur Verfügung: eine rechteckige Maske, um ein Rechteck um die Zelle und ein Freihandwerkzeug, um die Zelle von Interesse von Hand skizzieren erstellen. </li><li> Um eine rechteckige Maske, entfernen Linie 167 und Linie 170 Kommentar (Kommentar einer Linie durchgeführt, indem ein &quot;%&quot; am Anfang der Zeile) zu erzeugen. Führen Abschnitt 3 des Programms. Klicken Sie in das Bild und ziehen Sie die Maus, die rechteckige Maske definieren, um zu beginnen. Doppelklicken Sie auf das Feld, um es zu akzeptieren. </li><li> Um eine von Hand gezeichnete Maske Kommentarzeile 167 und Kommentar-Linie 170 zu generieren und auszuführen Abschnitt 3. Klicken Sie auf und ziehen Sie die gewünschte Maske mit der Maus. Doppelklicken Sie auf die Maske, es zu akzeptieren. </li><li> Führen Abschnitt 4to der Hilbert-Konstrukt transformiert DIC Bildstapel und die entsprechende DIC Bildstapel der Bereich von Interesse.Die in Abschnitt 3 aufgebaut Maske wird dem Hilbert-Transformation angewendet werden DIC-Stack und die regelmäßige DIC Stapel, wenn &quot;Maskon&quot; auf 1 in Zeile 179 festgelegt ist. Einstellung &quot;Maskon&quot; wird auf 0 Bildstapeln ohne Auftragen der Maske zu konstruieren. </li><li> Laufabschnitt 5, um die Bildsegmentierung der xz-Querschnittsbilder von dem interessierenden Bereich zu optimieren. Figur 500, durch das Programm erzeugt wird, erscheint die Anzeige drei verschiedene Arten von Kontrast. Der Erfolg des Algorithmus, um die Grenzen der Zelle zu finden, ist abhängig von einer Kombination der Maske verwendet, und der Wert der &quot;Schwellenwert&quot; in Zeile 229 des Programms. Beginnen Sie mit einem Wert von 0,5. Stellen Sie den Wert der Schwelle, und wiederholen Sie diesen Abschnitt des Programms, bis die richtige Gliederung in eine der Spalten erreicht. </li><li> Wenn die Gliederung besten in Spalte 1 war, verwenden Sie Abschnitt 6, um die Lautstärke zu bestimmen, unter Verwendung von DIC Bildsegmentierung. Wenn Spalte 2 gab optimale Ergebnisse laufen Abschnitt 7 zu Zellvolumen von Hilbert-transformierten DIC Bildern zu bestimmen. Wenn Spalte 3 GAVe die optimalen Ergebnisse, Abschnitt 8 laufen, um die Lautstärke zu bestimmen, mit Fourier-gefilterten Hilbert-transformierten DIC Bilder. </li><li> Das gemessene Volumen der Probe in Kubik um (fl) gemeldet wird im Titel von Fig. 600, 700 oder 800 von dem Programm in Abhängigkeit von dem Volumenmessung gewählt hergestellt vorgestellt. </li></ol> 6. Massenmessungen <ol><li> Öffnen Sie die NIQPM MATLAB-Programm mit dem Titel &quot;JoVE_NIQPM_v1.m&quot;. </li><li> Nach § 0 des NIQPM Programm, aktualisieren Sie die Lage der drei Verzeichnisse benötigt, um das Programm auszuführen. Dies sind die &quot;dependencies_directory&quot;, die &quot;brightfield_directory&quot; und die &quot;dic_directory.&quot; </li><li> Als nächstes führen Sie Abschnitt 1. Dieser Codeabschnitt erzeugt ein helles Feld Bild Würfel des vollen Feld der gesamte Satz von Bildern. NUR EINMAL ein Laufabschnitt. </li><li> Als nächstes führen Sie Abschnitt 2. Ein Dialogfeld mit dem Titel &quot;Define NIQPM Parameter&quot; wird angezeigt. Vier Zahlen sind für den Benutzer erforderlich: Anzahl der Brennebene, wo das helle Feld Bild desProbe im Fokus, laterale Auflösung (um / Pixel im Bild), die axiale Auflösung (das ist für die Bildaufnahme 0,1 in 0,1 Schritten um axial) und die Region von Interesse Größe, definiert dieser Parameter die Länge einer Seite ein Box, die später erscheinen werden - ein typischer Wert ist 200. Klicken Sie auf OK. </li><li> Ein Bild von dem von der Brennebene Nummer angegeben Hellfeld-Brennebene wird mit einem blauen Feld angezeigt. <ol><li> Wenn das Bild nicht fokussiert ist, doppelklicken Sie in der blauen Box und erneut Abschnitt 2, achten Sie darauf, um die Brennebene Nummer im Dialogfeld einstellen. </li><li> Wenn das Bild scharf ist, ziehen Sie den blauen Kasten um das Bild und Größe ändern, indem Sie die Knoten der Box und ziehen Sie diese gegebenenfalls. Positionieren Sie den Rahmen um das Merkmal von Interesse, z. B. einer Zelle. Die Box muss nicht quadratisch sein. Doppelklicken Sie in der Box, es zu akzeptieren. </li></ol></li><li> Als nächstes führen Sie Abschnitt 3, einen Stapel von Hellfeld-Bilder zu konstruieren abgeschnitten, um in der RegionInteresse. </li><li> Um die Phasenkarte, Pseudobild DIC, und Vergleiche mit Hellfeld-Bildern und dem wahren Bild DIC generieren, führen Sie Abschnitt 4. </li><li> Mit der Pseudo DIC und wahre DIC Bilder so ähnlich wie möglich der Massendichte Karte, Gesamtmasse und Histogramm der Zelldichte kann durch Ausführen von § 5a oder 5b bestimmt werden. § 5a führt automatische Erkennung der Grenze des Feldes - optimieren &quot;Schwelle&quot; in Zeile 300 - typische Werte liegen zwischen 0,1-1. Führen Sie erneut diesen Abschnitt wie notwendig, um den Wert der Schwelle zu optimieren. 5b führt Massenbestimmung usw., nachdem der Benutzer den interessierenden Zelle skizziert. </li></ol>

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Die Autoren haben keine finanziellen Interessen in der vorliegenden Arbeit.

Im allgemeinen ist NIQPM ein beugungsbegrenzter Technik auf optische Weglängen zwischen 0,25-44,7 validiert. Validierung auf n = 1.596 durchgeführt Polystyrolkugeln im Durchmesserbereich von 0,11 bis 9,8 &amp;mgr; m in Fluoromount G suspendiert (Daten nicht gezeigt). Zellen besitzen optischen Weglängen, die von fast 0-7 liegen. Bei der Messung der Dichteverteilung einer Probe kann man feststellen, dass die Pseudo-Bild DIC sieht gut aus, während die Dichtekarte besitzt unerwünschte Hinte...

Die Verwendung optischer Mikroskopie ist nun überall in der Untersuchung von zellulären Organismen. Aufgrund ihrer geringen endogenen Absorption und schwache Streueigenschaften über den sichtbaren Lichtspektrum, ich Zellen nicht stark auf die Amplitude der Lichtwellen durchqueren sie und erscheinen halbtransparent, wenn sie mit Standard-Hellfeld-Mikroskop abgebildet. Zellproben haben jedoch verlangsamen optischen Wellen, die sich durch sie in einer Weise, die linear zur Höhe der lokalen Massendichte in einem bestimmten Raumbereich, durch den das Licht in Beziehung steht. Die Nutzung dieser heterogenen Zeitverzögerung oder &quot;Phase&quot;-Profil von optischen Wellen durch mikroskopische Präparate übertragen wurde erstmals 1935 von Frits Zernike 1 beschrieben und experimentell durch Zernikein 1942 2 realisiert. Zernike den Nobelpreis im Jahr 1953 für diese Leistung ausgezeichnet. Zeiss kommerzialisiert dieses Instrument im Jahr 1945 3. Im Jahr 1955, Smith und Nomarskich würde ihre ersten Arbeiten über die Verwendung 4 und 5 von Theorie Differentialinterferenzkontrast (DIC) Mikroskopie, eine Modalität, die die räumliche Gradienten von Phase als Kontrastmechanismus verwendet zu präsentieren. DIC wurde von Zeiss in 1965in enger Zusammenarbeit mit Nomarski 6 kommerzialisiert. Im Jahr 1981 zeigten zwei Labors die erste aufgezeichnete Live-Cell-DIC Bilder mit dem Einbau von Videokameras in die Optik Zug der DIC-Mikroskop 7, 8. Die Ära der Live Cell Imaging war geboren. Seit dieser Zeit hat sich die Ausführung der beiden Phasenkontrast und DIC auf kommerziellen Mikroskope weitgehend unverändert geblieben. Diese Methoden werden hauptsächlich von Biologen genutzt werden, um Bilder von Zellen für qualitative Zwecke zu produzieren: Überwachung der Morphologie, Tracking subzellulärer Strukturen, und Untersuchungen von Membrandynamik 9. Diese Techniken sind in ihrer qualitativen &quot;off-the-shelf&quot;-Konfiguration und Phase DIC lassen sich beliebige Funktionen der Intensität der Lichtquelle, die Beleuchtungsoptik Einstellungen und CCD-Kamera Verstärkung, Gamma-und Belichtungseinstellungen. Eine kleine Legion von Physikern und Ingenieuren optischen hat sich bemüht, zu kommerziellen bildgebenden Verfahren quantitativ. Zu den ersten Bemühungen waren zwei Briefe an die Natur in 1952 und 1953, in denen der Arzt-turned-Biophysiker Robert Barer demonstriert die Verwendung von Phasenmikroskopie, um Zelltrockenmasse von Zellen durch Schätzung Phasenverschiebungen durch diesen Zelltypen mit einem handelsüblichen Phasen Mikroskop bestimmen 10, 11. Phasenmikroskopie 10,11, DIC-Mikroskopie 12-17, 18-22 und Hellfeld auf optische Weglänge, Phase, Masse zu bestimmen: Das Feld hat eine Vielzahl von Techniken in den folgenden Jahren auf Basis drei Grundmarkierungsfreie Kontrastmechanismen entwickelt Dichte, Brechungsindex, und Zellvolumen. In Abs.llel, eine große Sammlung von kundenspezifischen optischen Instrumenten wurden auch seit den 1950er Jahren entwickelt worden und haben weitreichende optische Messungen im Bereich von Anwendungen in der Parasitenwachstum 23, zu dokumentieren, die den Zellzyklus 24 bis sucht Membrandynamik der roten Blutzellen 25. Insbesondere hat die vergangenen zehn Jahren eine Fülle von kennzeichnungsfreien quantitativen Mikroskopie in Form von Beugungsphasenmikroskopie 26, 27 tomographischen Phasenmikroskopie, digitale holographische Mikroskopie 28, phasensensitive optische Kohärenzmikroskopie 29, räumliche Lichtinterferenzmikroskopie 30. Hilbert gesehen Phasenmikroskopie 31 und quantitative Phasenmikroskopie 32. Trotz ihrer gemeinsamen Erfolge, haben diese Instrumente nicht zu den größeren Bereich der biologischen Forscher durch, meist, um ihre komplexen Mess-und Rechenanforderungen verbreitet. Hier beschreiben wir dEscribe die Verwendung eines Lichtmikroskops, quantitative Messungen der Masse, Volumen und Dichte auf die zelluläre Proben durch eine Kombination von Hellfeld-und DIC Bildern durchzuführen. Zwei Hauptansätze werden vorgestellt: noninterferometric quantitative Phasenmikroskopie (NIQPM), Messungen der Gesamtzellmasse und subzellulärer Dichteverteilung durchzuführen, und Hilbert-Transformation Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie (HTDIC), um die Lautstärke zu bestimmen. Die Hauptvorteile von NIQPM und HTDIC lag in ihrer technologischen Zugänglichkeit. Die für die erfolgreiche Ausführung erforderlich Abbildungsbedingungen sind im Rahmen des normalen Betriebs der meisten kommerziell erhältlichen Mikroskope. Darüber hinaus sind die Post-Processing-Algorithmen stabil, schnell und robust - worden in MATLAB mit Hilfe von schnellen Fourier-Transformation (FFT) basierte Algorithmen, wann immer möglich umgesetzt. NIQPM ist eine Methode zur Phasen-und den axial integriert Massendichte cel rekonstruierenzellulären Proben von Hellfeld-Bilder. Summation dieser axial integrierten Massendichte über die Fläche der Probe gibt die Gesamttrockenmassegehalt der Probe. , In dem sie gezeigt werden, dass die Phasenprofil einer Zelle konnte von durch-Fokus-Hellfeldbildern der Probe rekonstruiert werden - - Die NIQPM Protokoll basiert auf den experimentellen Grundlagen von Paganin und Nugent 18, 19 aufgestellt hat und die theoretische Arbeit von Frank , Altmeyer und Wernicke 20 - auf die Lösung der paraxialen Wellen Modelle in einer effizienten FFT-basierte Weise. Die Verbindung der Phase auf die Trockenmasse Dichte beruht auf der Arbeit von Barer 10, 11 und 33 Popescu basiert. Volumen Informationen können durch Fokus DIC Bilder unter hohen NA Beleuchtungsbedingungen, die optische Schnitte der Probe entlang der optischen Achse zu ermöglichen, erhalten werden. Hilbert-Transformation Verarbeitung der DIC-Bildstapeln stark erhöhtRanderfassungsalgorithmen zur Lokalisierung der Probe Grenzen in drei Dimensionen durch die Trennung der Grauwerte der Probenintensität von denen der Hintergrund. Diese Arbeit stammt mit Arinson et al. 34. obwohl wir beide Fourier-Filter-Methoden eingeführt, um den Kontrast und einen Sobel-Kantenerkennung basierend Verfahren zur automatischen Volumen Analyse der Probe zu verbessern. Wir haben auch bestätigt HTDIC vorher für Polystyrolkugeln in der Größe von der Beugungsgrenze von bis zu 20 um Durchmesser 36. Während sowohl NIQPM und HTDIC technologisch erreichbar aufgrund ihrer Entwicklung zu kommerziellen Mikroskope sind die Verfahren im wesentlichen durch die Hardware-Konfiguration der Mikroskope selbst begrenzt. Die primären Grenzen dieser Techniken sind zweifach: langsam Z-Stapel-Erfassungszeit auf kommerziellen Bereiche, die durch Übersetzung der gesamten Probenbühne im Gegensatz zu nur die ObjektivlinseBegrenzt gegenwärtig die Untersuchung von Phänomenen schneller als etwa 1 Bild / min und zweitens Beugungseffekte begrenzen die Nützlichkeit NIQPM und HTDIC auf Objekte in der Größe von 0,2 bis 10 und 20 um im Durchmesser sind. Daher muss die Probe und die damit verbundenen Zeitdynamik von Interesse bestimmte Größe und zeitliche Einschränkungen treffen, um die Anwendung dieser Methoden auf typische &quot;off-the-shelf&quot; Instrumente zu ermöglichen. Spannend, die meisten festen zellulären Proben leicht mit diesen Methoden untersucht. Eine Übersicht über den NIQPM und HTDIC Protokolle sind in Fig. 1 angegeben. In Abbildung 2 veranschaulichen wir optimale und suboptimale Durch Schwerpunkt Bildgebung unter niedrigen und hohen NA Beleuchtungsbedingungen sowohl für Hellfeld-und DIC-Bilder. Abbildungen 3 und 4 zeigen die Abhängigkeit der Parameter NIQPM Algorithmus auf der erfolgreiche und nicht erfolgreiche Implementierungen. <strong&gt; 5 veranschaulicht die Schritte in der HTDIC Bildverarbeitungs-Algorithmus beteiligt und zeigt die optimale Implementierung des Algorithmus, um Zellvolumen zu bestimmen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager 2 microscope</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td>Axio Imager D2</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green filter (&#955; = 540 &#177; 25 nm)</td>
			<td>Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont</td>
			<td>D540/25x</td>
			<td>Green filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook 5.5 software</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado</td>
			<td></td>
			<td>Image acquistion software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microspheres</td>
			<td>Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN</td>
			<td>PS06N</td>
			<td>Polystyrene spheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech, Birmingham, Alabama</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative optical microscopy: measurement of cellular biophysical features with a standard optical microscope

Wir beschreiben die Verwendung eines Lichtmikroskops, quantitative Messungen der Masse, Volumen und Dichte auf die zelluläre Proben durch eine Kombination von Hellfeld-und Differentialinterferenzkontrastbildern durchzuführen. Zwei Hauptansätze werden vorgestellt: noninterferometric quantitative Phasenmikroskopie (NIQPM), Messungen der Gesamtzellmasse und subzellulärer Dichteverteilung durchzuführen, und Hilbert-Transformation Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie (HTDIC), um die Lautstärke zu bestimmen. NIQPM auf einem vereinfachten Modell der Wellenausbreitung auf der Basis, der sogenannten paraxialen Näherung mit drei zugrunde liegenden Annahmen: niedriger numerischer Apertur (NA) Beleuchtung, Schwach Streuung, und schwache Lichtabsorption durch die Probe. Glücklicherweise ungefärbten zellulären Proben erfüllen diese Annahmen und niedrigen NA Beleuchtung ist leicht zu kommerziellen Mikroskopen erreicht. HTDIC wird verwendet, um Informationen von Volumendurch Fokus DIC Bilder unter hohen NA Aufhellung erhaltenation Bedingungen. Hohe NA Beleuchtung ermöglicht verbesserte Schneide der Probe entlang der optischen Achse. Hilbert-Transformationsverarbeitung auf der DIC Bildstapeln stark erhöht Kantenerkennungsalgorithmen für die Lokalisierung der Probe Grenzen in drei Dimensionen durch die Trennung der Grauwerte der Probenintensität von denen der Hintergrund. Die Hauptvorteile von NIQPM und HTDIC lag in ihrer technologischen Erreichbarkeit mit &quot;off-the-shelf&quot;-Mikroskope. Es gibt zwei grundlegende Einschränkungen dieser Methoden: langsam Z-Stapel-Erfassungszeit auf gewerbliche Bereiche hebt derzeit die Untersuchung von Phänomenen schneller als 1 Bild / Minute, und zweitens, Beugungseffekte beschränken den Nutzen der NIQPM und HTDIC, um Objekte von 0,2 bis zu 10 (NIQPM) und 20 (HTDIC) um im Durchmesser sind. Daher muss die Probe und die damit verbundenen Zeitdynamik von Interesse bestimmte Größe und zeitliche Einschränkungen treffen, um die Anwendung dieser Methoden zu ermöglichen. Aufregend, die meisten Fest cellular Proben leicht mit diesen Methoden untersucht.

Korrekte Probenbeleuchtung während durch Fokus-Bildaufnahme ist entscheidend für die erfolgreiche Umsetzung des NIQPM nd HTDIC Algorithmen. In Abbildung 2 veranschaulichen wir niedrigen und hohen NA Beleuchtung sowohl unter DIC und Hellfeld-Kontrast für eine Polystyrol-Kugel und der menschlichen kolorektalen Adenokarzinom-Zelllinie SW620. Fig. 2A, 2C, 2I, 2K und demonstrieren eine optimale Bildgebung für NIQPM. 2F, 2H, 2N und 2P demonstrieren optima...

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Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Quantitative Optische Mikroskopie: Messung der Cellular biophysikalische Eigenschaften mit einem Standard Optisches Mikroskop

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

quantitative-optical-microscopy-measurement-cellular-biophysical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.4K Aufrufe.  Oregon Health & Science University, School of Medicine. We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Serie: Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Forschung

Biotechnik

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

Ein Cre-Lox P Rekombination Ansatz für den Nachweis von Cell Fusion In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

In vitro Synthese von Native, Fibröse Lange Abstände und Segmentberichterstattung Lange Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Herstellung von Mica Unterstützte Lipiddoppelschichten für Hochauflösende Optische Mikroskopie Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluoreszenz-Abschrecken eines Liposomenverkapseltes NIR-Fluorophore als Instrument zur<em&gt; In-vivo-</em&gt; Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Mehrfarbenfluoreszenzdetektion für Droplet Mikrofluidik Verwendung von Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

Gezielte Plasma Membrane Lieferung eines Hydrophobic Transport Encapsulated in einem Liquid Crystal Nanoparticle Träger

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By replicating the imaging environment, costly animal experiments to validate a technique may be circumvented. Predicting and optimizing the performance of in vivo and ex vivo imaging techniques requires testing on samples that are optically similar to tissues of interest. Tissue-mimicking optical phantoms provide a standard for evaluation, characterization, or calibration of an optical system. Homogenous polymer optical tissue phantoms are widely used to mimic the optical properties of a specific tissue type within a narrow spectral range. Layered tissues, such as the epidermis and dermis, can be mimicked by simply stacking these homogenous slab phantoms. However, many in vivo imaging techniques are applied to more spatially complex tissue where three dimensional structures, such as blood vessels, airways, or tissue defects, can affect the performance of the imaging system. 
This protocol describes the fabrication of a tissue-mimicking phantom that incorporates three-dimensional structural complexity using material with optical properties of tissue. Look-up tables provide India ink and titanium dioxide recipes for optical absorption and scattering targets. Methods to characterize and tune the material optical properties are described. The phantom fabrication detailed in this article has an internal branching mock airway void; however, the technique can be broadly applied to other tissue or organ structures.

Optical tissue phantoms are essential tools for calibration and characterization of optical imaging systems and validation of theoretical models. This article details a method for phantom fabrication that includes replication of tissue optical properties and three-dimensional tissue structure.

Herstellung und Charakterisierung von optischen Gewebe Phantome, die Makrostruktur enthalten

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie for the Study of Murine Herzen

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Durchführung von mehreren Imaging-Modi mit einem Fluoreszenzmikroskop

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...